一种秦艽悬浮细胞的培养工艺

摘要

本发明公开了一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，取秦艽叶片诱导得愈伤组织后对其进行增殖培养，继代培养获得松散的适合悬浮培养的愈伤组织细胞系，在获得对数生长期种细胞之后，进行秦艽悬浮细胞培养，在收获细胞之后再提取生产次生代谢产物。本发明提供的秦艽悬浮细胞的培养工艺，细胞生长速度快，分散性好，所得悬浮细胞的生物量达15.23g/L.月(干细胞)，龙胆苦苷含量达0.034％。在培养液中添加诱导子之后，可提高次生代谢产物的产量：在加入黑曲霉诱导子之后，与未添加诱导子的对照组相比，龙胆苦苷的产量提高了23.99％。

权利要求

1.一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，其特征在于，包括以下步骤：

2

1）将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm 大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含1.5～3.0mg/kg的2,4-D和0.3～0.6mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在25～28℃下每天连续光照10～16h，诱导6～8d；

2）在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.05～

0.2mg/kg的2,4-D和0.1～1.0mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在22～28℃下黑暗培养25～32d；

3）在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.05～0.5mg/kg的2,4-D和0.1～1.0mg/kg的

6-BA的MS固体培养基上，于22～28℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为25～32d，继代培养5～8代后获得松散愈伤组织；

4）按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含

0.5～2.0mg/kg的2,4-D和0.1～1.0mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养12～18d，收集获得种细胞；

5）按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将处于对数生长期的种细胞，接种于pH为6.5～7.5、包含0.5～2.0mg/kg的2,4-D、0.1～1.0mg/kg的6-BA和35～50g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，装瓶培养，装液量为1/2～1/5，在22～28℃、黑暗条件、转速为90～120r/min的摇床上悬浮培养；在培养至少18d后加入终浓度为60～100mg/L的黑曲霉诱导子，继续培养8～10d后收获细胞；

所述的黑曲霉诱导子的制备为：

将黑曲霉接于PDA培养液中置摇床上100～120r/min、22～28℃下暗培养4～6d后收获，抽滤收集菌体，加入9～12倍体积量的纯水，灭菌后抽滤，滤液灭菌后得到黑曲霉诱导子。

2.如权利要求1所述的秦艽悬浮细胞的培养工艺，其特征在于，所述的无菌的秦艽叶片的获得为：取秦艽叶片用洗衣粉清洗其表面并用流水冲洗，体积浓度75%乙醇消毒10s，无菌水冲洗，再用质量浓度0.1%的升汞溶液浸泡消毒6min，再用无菌水冲洗。

3.如权利要求1所述的秦艽悬浮细胞的培养工艺，其特征在于，所述的愈伤组织的诱导时，光照强度为2000～5000Lx，相对湿度为65～80%。

说明书

一种秦艽悬浮细胞的培养工艺

技术领域

[0001] 本发明属于植物细胞培养技术领域，涉及一种秦艽悬浮细胞的培养工艺。

背景技术

[0002] 秦艽为龙胆科植物秦艽(Gentiana macropHykgkga Pakgkg)、麻花秦艽(Gentiana straminea Maxim.)、粗茎秦艽(Gentiana crassicaukgis Duthie ex Burk.)或小秦艽(Gentiana dahurica Fisch.)的干燥根，主产于陕西、甘肃、四川、内蒙古等地。秦艽主要有效成分龙胆苦苷，龙胆苦苷具有镇痛、抗炎、保肝利胆、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，利用龙胆苦苷研究开发的二类新药——艽龙胶囊已投放市场。

[0003] 目前龙胆苦苷多来源于秦艽和龙胆的野生或栽培药材，由于所用药材生长周期长(3～5年)，且生长在高海拔地区，秦艽药材资源的问题限制了药效成分龙胆苦苷的开发和应用。通过细胞培养方法生产龙胆苦苷，是解决龙胆苦苷来源的有效途径。

发明内容

[0004] 本发明解决的问题在于提供一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，该培养方法的秦艽悬浮细胞生长速度快，分散性好，次生代谢产物含量高，尤其是龙胆苦苷含量高。

[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现：

[0006] 一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，包括以下步骤：

[0007] 1)将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含1.5～3.0mg/kg的2，4-D和0.3～0.6mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在25～28℃下每天连续光照10～16h，诱导6～8d；

[0008] 2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.05～0.2mg/kg的2，4-D和0.1～1.0mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在22～28℃下黑暗培养25～32d；

[0009] 3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.05～0.5mg/kg的2，4-D和0.1～1.0mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，于22～28℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为25～32d，继代培养5～8代后获得松散愈伤组织；

[0010] 4)按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含0.5～2.0mg/kg的2，4-D和0.1～1.0mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养12～18d，收集获得种细胞；

[0011] 5)按照每100ml培养液接种4.0～6.0g的比例，将处于对数生长期的种细胞接种于pH为6.5～7.5、包含0.5～2.0mg/kg的2，4-D、0.1～1.0mg/kg的6-BA和35～50g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养25～30d之后收获细胞。

[0012] 所述的无菌的秦艽叶片的获得为：

[0013] 取秦艽叶片用洗衣粉清洗其表面并用流水冲洗，体积浓度75％乙醇消毒10s，无菌水冲洗，再用质量浓度0.1％的升汞溶液浸泡消毒6min，再用无菌水冲洗。

[0014] 所述的愈伤组织的诱导时，光照强度为2000～5000Lx，相对湿度为65～80％。

[0015] 所述的悬浮培养为：将处于对数生长期的种细胞，接种于pH为6.5～7.5、包含0.5～2.0mg/kg的2，4-D、0.1～1.0mg/kg的6-BA和35～50g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，装瓶培养，装液量为1/2～1/5，在22～28℃、黑暗条件、转速为90～120r/min的摇床上悬浮培养；在培养至少18d后加入终浓度为60～100mg/L的黑曲霉诱导子，继续培养
8～10d后收获细胞。

[0016] 所述的黑曲霉诱导子的制备为：

[0017] 将黑曲霉接于PDA培养液中置摇床上100～120r/min、22～28℃下暗培养4～6d后收获，抽滤收集菌体，加入9～12倍体积量的纯水，灭菌后抽滤，滤液灭菌后得到黑曲霉诱导子。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

[0019] 本发明提供的秦艽悬浮细胞的培养工艺，在收获细胞之后再提取生产次生代谢产物，这样不仅可以节约大量的土地资源，保护生态环境，而且可人工调节控制细胞和龙胆苦苷生产过程，为解决龙胆苦苷来源的问题提供和了一条有效途径。

[0020] 本发明提供的秦艽悬浮细胞的培养工艺，细胞生长速度快，分散性好，所得悬浮细胞的生物量达15.23g/L.月(干细胞)，龙胆苦苷含量达0.034％。

[0021] 更进一步，在培养液中添加诱导子之后，可提高次生代谢产物的产量：在加入黑曲霉诱导子之后，与未添加诱导子的对照组相比，龙胆苦苷的产量提高了23.99％。

附图说明

[0022] 图1为诱导并增殖后的秦艽愈伤组织的示意图；

[0023] 图2为秦艽种细胞悬浮培养的示意图；

[0024] 图3为秦艽种细胞悬浮培养过程中的显微放大示意图。

具体实施方式

[0025] 本发明公开了一种秦艽悬浮细胞的培养工艺，取秦艽叶片诱导得愈伤组织后对其进行增殖培养，继代培养获得松散的适合悬浮培养的愈伤组织细胞系，在获得对数生长期种细胞之后，进行秦艽悬浮细胞培养，在收获细胞之后再提取生产次生代谢产物。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

[0026] 实施例1

[0027] 秦艽悬浮细胞的培养工艺，包括以下步骤：

[0028] 1)本发明所用秦艽采自陕西宝鸡凤县秦艽种植基地生长2年的栽培秦艽。采取的时间为4月份，用秦艽真叶为外植体诱导愈伤组织。

[0029] 取秦艽叶片用洗衣粉清洗其表面并用流水冲洗，体积浓度75％乙醇消毒10s，无菌水冲洗，再用质量浓度0.1％的升汞溶液浸泡消毒6min，再用无菌水冲洗，得到无菌的秦艽叶片。

[0030] 将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含1.5mg/kg的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和0.3mg/kg的
6-BA(6-苄氨基嘌呤)的MS固体培养基上，在25～28℃下每天连续光照12h，相对湿度
65％，光照强度3000条件下诱导6d；

[0031] 2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.05mg/kg的2，4-D和0.1mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在22～25℃下黑暗培养25～
28d；

[0032] 3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.05mg/kg的2，4-D和0.1mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，于22～25℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为25～28d，继代培养7代后获得松散愈伤组织；

[0033] 4)按照每100ml培养液接种4.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含0.5mg/kg的2，4-D和0.1mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养12～18d，收集获得种细胞；

[0034] 5)按照每100ml培养液接种4.0g的比例，将处于对数生长期的种细胞接种于pH为6.5、包含0.5mg/kg的2，4-D、0.1mg/kg的6-BA和35g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，在22～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养18～25d之后收获细胞。

[0035] 实施例2

[0036] 秦艽悬浮细胞的培养工艺，包括以下步骤：

[0037] 1)本发明所用秦艽采自陕西宝鸡凤县秦艽种植基地生长2年的栽培秦艽。采取的时间为4月份，用秦艽真叶为外植体诱导愈伤组织。

[0038] 取秦艽叶片用洗衣粉清洗其表面并用流水冲洗，体积浓度75％乙醇消毒10s，无菌水冲洗，再用质量浓度0.1％的升汞溶液浸泡消毒6min，再用无菌水冲洗。

[0039] 将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含3.0mg/kg的2，4-D和0.6mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在25～28℃下每天连续光照12h，相对湿度65～80％，光照强度2000～5000Lx条件下诱导
8d；

[0040] 2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.2mg/kg的2，4-D和1.0mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在25～28℃下黑暗培养28～
32d；

[0041] 3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.5mg/kg的2，4-D和1.0mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，于25～28℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为28～32d，继代培养8代后获得松散愈伤组织；

[0042] 4)按照每100ml培养液接种6.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含2.0mg/kg的2，4-D和1.0mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在25～28℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养16～18d，收集获得种细胞；

[0043] 5)将处于对数生长期的种细胞，接种于pH为6.8～7.0、包含2.0mg/kg的2，4-D、1.0mg/kg的6-BA和50g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，装瓶培养，装液量为1/2，在25～
28℃、黑暗条件、转速为100～120r/min的摇床上悬浮培养；在培养18d后加入终浓度为
60～80mg/L的黑曲霉诱导子，继续培养8～10d后收获细胞。

[0044] 所述的黑曲霉诱导子的制备为：

[0045] 将黑曲霉(无特定种的要求)接于PDA培养液中置摇床上100r/min、22～25℃下暗培养4～6d后收获，抽滤收集菌体，加入9～10倍体积量的纯水，灭菌后抽滤，滤液灭菌后得到黑曲霉诱导子。

[0046] 实施例3

[0047] 秦艽悬浮细胞的培养工艺，包括以下步骤：

[0048] 1)将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含2.0mg/kg的2，4-D和0.5mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在26～28℃下每天连续光照12h，相对湿度65％，光照强度3000Lx条件下诱导7d；

[0049] 2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.1mg/kg的2，4-D和0.5mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在22～24℃下黑暗培养28～
30d；

[0050] 3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.2mg/kg的2，4-D和0.6mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，于22～24℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为28～30d，继代培养6代后获得松散愈伤组织；

[0051] 4)按照每100ml培养液接种5.0g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含1.0mg/kg的2，4-D和0.6mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在22～25℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养15～16d，收集获得种细胞；

[0052] 5)将处于对数生长期的种细胞，接种于pH为7.0～7.2、包含1.0mg/kg的2，4-D、0.6mg/kg的6-BA和40g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，装瓶培养，装液量为1/3，在25～
28℃、黑暗条件、转速为90～100r/min的摇床上悬浮培养；在培养20d后加入终浓度为
80～100mg/L的黑曲霉诱导子，继续培养8～9d后收获细胞。

[0053] 所述的黑曲霉诱导子的制备为：

[0054] 将黑曲霉接于PDA培养液中置摇床上100r/min、22～25℃下暗培养4～6d后收获，抽滤收集菌体，加入9～10倍体积量的纯水，灭菌后抽滤，滤液灭菌后得到黑曲霉诱导子。

[0055] 实施例4

[0056] 秦艽悬浮细胞的培养工艺，包括以下步骤：

[0057] 1)将无菌的秦艽叶片切成0.5～1.0cm2大小的碎片，然后进行愈伤组织的诱导：将秦艽叶的碎片接种于包含1.8mg/kg的2，4-D和0.45mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在25～26℃下每天连续光照12～14h，相对湿度65％，光照强度2000Lx条件下诱导6d；

[0058] 2)在诱导出愈伤组织之后，对愈伤组织进行增殖培养：将愈伤组织接种于包含0.12mg/kg的2，4-D和0.2mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，在24～25℃下黑暗培养25～
26d；

[0059] 3)在愈伤组织增殖培养之后，在包含0.12mg/kg的2，4-D和0.3mg/kg的6-BA的MS固体培养基上，于22～24℃、黑暗条件下继代培养，每代培养时间为28～30d，继代培养5代后获得松散愈伤组织；

[0060] 4)按照每100ml培养液接种5.5g的比例，将松散愈伤组织的细胞接种于包含1.2mg/kg的2，4-D和0.4mg/kg的6-BA的MS液体培养基中，在22～25℃、黑暗条件、摇床上悬浮培养16～18d，收集获得种细胞；

[0061] 5)将处于对数生长期的种细胞，接种于pH为7.2～7.5、包含1.5mg/kg的2，4-D、0.6mg/kg的6-BA和40g/kg的蔗糖的MS液体培养基中，装瓶培养，装液量为1/4，在25～
28℃、黑暗条件、转速为90～100r/min的摇床上悬浮培养；在培养25d后加入终浓度为
80～90mg/L的黑曲霉诱导子，继续培养9～10d后收获细胞。

[0062] 所述的黑曲霉诱导子的制备为：

[0063] 将黑曲霉接于PDA培养液中置摇床上100r/min、22～25℃下暗培养4～6d后收获，抽滤收集菌体，加入9～10倍体积量的纯水，灭菌后抽滤，滤液灭菌后得到黑曲霉诱导子。