牛重组α-1,3-半乳糖苷转移酶的克隆与表达

摘要

本发明涉及一种高活性，具有特异性半乳糖苷转移酶(GT)活性的重组酶蛋白，本发明采用内蒙古奶牛胸腺GT蛋白从第80位到368位氨基酸，它是GT具有活性的、最小的水溶性部分。为了进一步提高重组GT的水溶性和酶反应活性，通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造，将GT第160位氨基酸脯氨酸修改为赖氨酸，将第241位的谷氨酸修改为谷氨酰胺，从而得到更强酶活性的重组酶蛋白，该重组酶蛋白酶活性比现有的酶活性提高8-10倍，可应用于治疗肿瘤的医用领域。

权利要求

1.牛α-1，3-半乳糖苷转移酶重组酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.含有编码权利要求1所述重组酶蛋白的cDNA的表达载体。

3.含有编码权利要求1所述重组酶蛋白的cDNA的表达细胞。

说明书

牛重组α-1，3-半乳糖苷转移酶的克隆与表达

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高活性，具有特异性半乳糖苷转移酶(GT)活性的重组酶蛋白，该酶蛋白是通过对天然蛋白分子设计与基因工程改造，从而得到更强酶活性的重组酶蛋白，该重组酶蛋白可应用于治疗肿瘤的医用领域。

背景技术

[0002] 器官移植是当代医学中一种重要的治疗技术，但由于人体器官短缺，严重地影响了该医疗技术的广泛开展。为了寻找器官个体，猪可能是一个异种间移植较好的候选供体。但人如果接受猪来源的供体，由抗体介导的超急性排斥反应是一大障碍。这种异种间的移植排斥的主要原因是由于猪血管内皮细胞表面的半乳糖苷链，即α-1，3-半乳糖苷β-糖链末端(Gal-α-1，3-Galβ)，也称作α-Gal表位。

[0003] 除人类、猿类外，所有的哺乳类动物，都具有α-1，3-半乳糖苷转移酶，其细胞膜表面带有α-Gal表位，相反的，人类血液中却存在大量的抗α-Gal表位抗体，占1-2％IgG，3-8％IgM。我们知道，抗原抗体发生反应，激活补体，发生超急性移植器官的排斥。

[0004] 从器官移植排斥得到启发，可以将这种免疫排斥应用于肿瘤免疫治疗。由于人类所有细胞表面缺乏α-Gal表位，这种治疗技术的第一步是在人类肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位。方法有：1)用转基因的方式使肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，但是这种方法比较复杂，而且成功率较低，不能保证所有的肿瘤细胞膜表面在体外都合成α-Gal表位；2)在体外用GT通过酶促反应的方式，在肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，这样就需要高活性、高纯度的GT，所以我们只能通过基因重组的方式来生产大量的GT酶蛋白。

[0005] 基因重组的GT表达开始于90年代，由Fang和Premal等人(Fang JW et al，Journal of the American Chemical Society 1998，120：6635-6638；Premal SS，et al.Biochimica et Biophysica Acta2000，1480：222-234)用原核细胞表达出具有活性的牛α-1，3-GT；他们利用切割的部分牛α-1，3-GT基因(从80-368氨基酸位置)进行表达。根据他们的报道，表达的量高，活性也可以，但是我们重复他们的实验时发现，虽然这个系统可以生产重组的GT，粗制品中酶蛋白含量较高，但酶活性较低，很难达到临床可用级别的酶蛋白。

[0006] 2001年，由Chen等人(ChenAC，et al.Glycobiology 2001，11：577-586)利用酵母菌表达系统生产带有糖基化的GT，据其报道，活性较高，但我们重复其试验时发现，花费时间较长，成本较高，特别是纯化时总有多种重组蛋白污染，虽然经反复纯化，仍有大量不同程度糖基化的酶蛋白污染。

[0007] 概括而言，现有的生产GT的方式分为以下几种：1)从牛胸腺提取，但程序复杂，产量低，活性也低；2)应用基因重组技术，以猪、鼠、牛的GT基因，在原核细胞内表达，但我们发现他们表达的酶蛋白活性不高，不能用于临床；3)应用真核表达系统，虽然表达的是糖基化蛋白，但表达量低，表达所需时间长，成本较高。另外也有人使用昆虫细胞体系进行表达，但产量较低，无法应用于临床。

[0008] 由于表达的酶蛋白是应用于临床，所以需要量大，纯度和活性要求特别高，基于它的特殊要求，我们发明了这个既简单、快速、成本低、产量大、酶蛋白活性高的重组GT克隆技术。

发明内容

[0009] 本发明是以牛胸腺的半乳糖苷转移酶(GT)cDNA为模板，通过基因重组技术，修改GT的个别氨基酸，生产大量的、高活性的、具有特异性GT活性的重组酶蛋白。

[0010] 本发明的实施方案是采用内蒙古奶牛胸腺GT蛋白从第80位到368位氨基酸，它是GT具有活性的、最小的水溶性部分。为了进一步提高重组GT的水溶性和酶反应活性，经过对酶蛋白的结构分析，其中第160位和第241位两个氨基酸对酶的活性和水溶性影响较大，所以本发明将GT第160位氨基酸proline(P)修改为lysine(K)；将第241位的glutamic acid(E)修改为glutamine(Q)。

[0011] 本发明提供了一种可在人类肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位的半乳糖苷转移酶，这些酶具有与天然存在的奶牛胸腺半乳糖苷转移酶(SEQ ID NO：2)的第80位到368位氨基酸序列除了两个氨基酸外都相同。

[0012] 在具体实施方案中，牛半乳糖苷转移酶SEQ ID NO：2从第80位到368位氨基酸序列中替换两个氨基酸，该替换选自第160位和第241位，前者改为lysine(Lys)，后者改为glutamic acid(Gln)。

[0013] 本发明还提供了一种高活性、具有特异性半乳糖苷转移酶(GT)活性的重组酶蛋白，可在人类肿瘤细胞膜表面合成α-Gal表位，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

[0014] 本发明还提供了修改后的牛半乳糖苷转移酶cDNA表达质粒。还提供了该质粒的表达克隆。

[0015] 在实施方案中，本发明还提供了重组半乳糖苷转移酶的医疗用途，即在肿瘤细胞膜表面合成半乳糖苷表位，提高肿瘤细胞的抗原性。

[0016] 以上概括的描述了本发明，可通过参照本文提供的某些具体实施例进一步理解本发明，这些实施例仅是为了说明而不是限制本发明。

附图说明

[0017] 图1：重组牛α-1，3-GT蛋白结构示意图

[0018] 图2：表达重组牛α-1，3-GT质粒的构建；

[0019] 图3：同位素方法测试α-1，3-GT活性的化学反应；

[0020] 图4：流式细胞检测图：阴性对照试验组中肿瘤细胞未经唾液酸酶和GT处理，也没有用FITC标记的抗体，以此作为阴性对照组；

[0021] 图5：流式细胞检测图：阴性对照管(虚线所示)的肿瘤细胞未经唾液酸酶和GT处理，但用抗α-gal表位的抗体，流式细胞分析呈阴性，说明抗体无非特异性结合；试验管(实线所示)中的肿瘤细胞加唾液酸酶和Fang等人方法生产的牛GT，用α-gal表位的抗体测试，肿瘤细胞膜表面可以合成α-gal表位，但平均FL1-H峰值仅52.90；

[0022] 图6：流式细胞检测图：阴性对照管(虚线所示)的肿瘤细胞未经唾液酸酶和GT处理，但用抗α-gal表位的抗体，流式细胞分析呈阴性，说明抗体无非特异性结合；试验管(实线所示)中的肿瘤细胞经唾液酸酶和本发明生产的新GT处理，证实肿瘤细胞膜表面合成α-gal表位，平均FL1-H峰值高达408.12。

具体实施方式

[0023] 实施例1.表达重组牛α-1，3-GT质粒的构建

[0024] 本发明采用内蒙古奶牛胸腺GT蛋白从第80位到368位氨基酸，它是GT具有活性的、最小的水溶性部分。为了进一步提高重组GT的水溶性和酶反应活性，经过对酶蛋白的结构分析，其中第160位和第241位两个氨基酸对酶的活性和水溶性影响较大，所以本发明将GT第160位氨基酸proline(P)修改为lysine(K)；将第241位的glutamic acid(E)修改为glutamine(Q)，参见图1。

[0025] 首先从牛的血管内皮细胞内提取mRNA，经反转录PCR(RT-PCR)扩增牛α-1，3-GTcDNA片段，开始的位置在第240bp(即第80位氨基酸处)，结束的位置在第1104bp(即第368位氨基酸处)。将此反转录PCR扩增的cDNA片段克隆到TA克隆质粒内，筛选，扩增，DNA测序；然后用点突变试剂盒，设计引物，将牛alpha1，3-半乳糖苷转移酶cDNA第
720-722bp修改(相当于第160位置的P氨基酸改为K氨基酸)；将第961-963bp修改(相当于第241位置的E氨基酸改变为Q氨基酸)；将人工突变后的质粒再转化到E.coli内，确认突变后的cDNA序列准确无误；进一步用PCR，分别在α-1，3-GT cDNA的5′和3′端引入NdeI和BamHI酶切位点。pET-15b质粒经NdeI和BamHI两酶消化，在两酶切点之间插入牛α-1，3-GT cDNA片段(参见图2)，最后再经DNA测序证实整个重组基因序列正确。最后，将pET-15b+α-1，3-GT质粒转化到HMS174(DM3)E.coli内进行重组牛GT酶蛋白表达。

[0026] 实施例2.重组的GT酶蛋白纯化

[0027] 含有pET-15b+α-1，3-GT质粒的HMS174(DM3)E.coli在LB培养液中培养到OD600＝0.7时，加入终浓度1mM IPTG来诱导重组蛋白表达，细菌继续在35℃培养4小时，离心、收集细菌；干冰上速冻1.5小时，然后悬浮于His-tag纯化溶液内，离心收集上清液，按照Sigma公司的His-tag纯化柱两次纯化，在4℃的冷库内透析三次，最后用试剂盒去除内毒素。经SDS-PAGE电泳和高效液相测定其表达蛋白的纯度，并定量。

[0028] 实施例3.重组酶蛋白的活性测试

[0029] 3.1同位素测试α-1，3-GT酶活性

[0030] 测试原理(参见图3)：100μL含有5mM MnCl2，5mM Tris-HCl(pH7.0)，50μM UDP-Gal(标有同位素)和10mM糖受体Galβ-1，4-GlcNAcβ-OR，加入不同浓度的重组GT，在37℃反应15分钟，加入20μL冰水终止反应。0.05ml反应液加到AG1-X8阴离子交换树脂(Bio-Rad)的液体闪烁瓶内，反复洗涤后测同位素。

[0031] 酶活性定量标准：在37℃，15分钟内，1单位酶＝从UDP-Gal催化1μmol Gal转移到Galβ-1，4-GlcNAcβ-OR糖受体上。

[0032] 测试结果：

[0033] A.本发明的酶蛋白表达量：每升LB培养液可生产出＞10mg酶蛋白；酶活性：15单位/mg。电泳证实，酶蛋白分子量大约为：39,000D。

[0034] B.用Fang等人的方法生产的酶产量：每升培养液可生产5.4mg酶蛋白；酶活性：1.5单位/mg。分子量：40,000D。

[0035] 3.2流式细胞检测α-1，3-GT酶活性

[0036] 检 测 原 理：α-1，3-GT 以 UDP-Gal为 底 物，将 半 乳 糖 残 基 联 接 到N-acetyllactosamine上，构建α-gal表位。人血清内存在天然的抗α-gal表位抗体。FITC标记的鼠抗人IgG作为二抗与anti-gal表位结合，利用流式细胞仪进行检测。

[0037] 检测方法：100μL含有5mM MnCl2，5mM Tris-HCl(pH7.0)，50μM UDP-Gal和5
5×10 人类肿瘤细胞，加入1mU唾液酸酶(Sigma)，不同浓度的和不同来源的重组GT，在
37℃反应60分钟，加入冰生理盐水终止反应。洗涤三次，加入人抗半乳糖苷表位抗体，洗涤后再加入标有荧光的鼠抗人IgG单抗。流式细胞仪检测，比较不同来源的GT活性，结果如图4，5，6所示。图5和6结果比较，本发明生产的酶活性大约是Fang等人生产的酶活性的
8倍。

[0038] 根据我们重复前述文献的几种技术，如1998年Fang等人报道的方法，他们使用原核表达系统，方法简单，成本低，产量较高，但是他们表达的酶活性，经流式细胞分析和同位素检测，与本发明生产的酶活性相比，只有本发明的10-20％。当我们重复Chen等人的真核表达系统时发现，本发明生产的酶比真核系统表达的酶活性超过50倍以上。虽然我们没有重复昆虫表达系统，但是我们都知道，原核表达系统远比昆虫系统简单、成本低。