用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其应用

摘要

本发明提供了一种用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其在微生物法水解处理油脂污染物中的应用，该脂肪酶及其编码基因序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明提供的新的脂肪酶基因，能够在酵母菌中高效表达，克服了传统纯培养技术的不足，可提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。

权利要求

1.一种用于处理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述脂肪酶的基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.含有权利要求2所述基因的重组载体。

5.权利要求2所述基因在制备重组脂肪酶中的应用。

6.权利要求1所述的脂肪酶在水解处理含油脂废水中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述水解在25～35℃、pH6.5～7.5下进行。

说明书

用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其在微生物法水解处理油脂污染物中的应用。(二)背景技术

[0002] 近年来，环境中油脂类物质造成的污染日益严重，已成为一个亟待解决的环境问题。含油废水是一种量大而面广的污染源。随着人们生活质量的提高和环保意识的增强，油脂的污染问题越来越受到人们的关注。目前油脂污染物常用的处理方法主要有物理法和化学法，但无法彻底消除废水中的油脂，而且易造成二次污染。生物法是处理油脂污染物的一种最有效、最安全和最彻底的方法。

[0003] 脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶，能够水解非水溶性酯类物质，如长链三酸甘油酯(脂肪)。脂肪酶的一个最显著的特点是它能特异性地在油-水两相界面上将脂肪水解为脂肪酸和甘油。

[0004] 近年来，对于脂肪酶的分子生物学研究在不断深入，到目前为止已克隆了很多脂肪酶基因，测定了它们的核苷酸序列，部分脂肪酶的蛋白晶体结构也已经研究清楚(Winkler F K，Arcy AD et al.1990；Brady L，1991)。

[0005] 大量文献报道了利用大肠杆菌(Escherichia coli)和毕赤酵母(Pichia Piastoris)等表达体系表达脂肪酶基因，Brocca等合成了全长为1647个碱基的经过密码子优化的lip1基因，实现了其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的异源高效表达，产酶量高达150U/ml(Brocca S，et al.1998)。Pfeffer等在Escherichia coli Origami B中采用一系列优化策略表达Candidaantarctica脂肪酶A(CalA)(Pfeffer J，et al.2007)。

[0006] 从自然界中筛选到的产脂肪酶野生菌，其脂肪酶基因一般受宿主菌的严谨调控，表达的脂肪酶满足自身的代谢即可；而市场导向要求高效表达以提高脂肪酶产量。大量微生物脂肪酶基因的克隆与重组表达为市场需求提供了可保障的酶源，但是原有脂肪酶基因的表达效率仍然不高，是脂肪酶大量应用的一个瓶颈。

[0007] 目前能够在实验室纯培养的微生物仅占其总数的不到1％，绝大多数微生物不可培养，无法通过分离纯化的传统培养方式得到纯菌落，从而限制了新的脂肪酶基因的开发。利用分子生物学的方法筛选新的脂肪酶基因，提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。
(三)发明内容

[0008] 本发明提供了一种从环境中筛选出的新的脂肪酶基因，该基因能够在酵母细胞中高效表达，克服了原有脂肪酶基因表达效率不高的缺陷。

[0009] 一种用于处理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0010] 本发明还涉及编码权利要求1所述脂肪酶的基因。具体的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过构建活性污泥的DNA文库，筛选到一个新的高效表达的脂肪酶基因。克服了传统纯培养技术的不足，是一条寻找新的脂肪酶基因的新途径。

[0011] 本发明涉及的脂肪酶基因，是一种新的基因，与同类基因没有同源性。其编码的脂肪酶是一种新的脂肪酶，与其他已报道的脂肪酶氨基酸序列相比，相似性小于30％。应当指出的是，对本发明的脂肪酶基因所编码的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的功能类似物均属于本发明的保护范围。在已知本发明脂肪酶基因的情况下，本发明普通技术人员可按本领域常规方法构建载体、转化、表达，获得所述脂肪酶。

[0012] 本发明还涉及含有所述基因的重组载体，将含有所述基因的重组载体转化至宿主菌(通常为酵母菌)中，进行表达，即可获得本发明脂肪酶。

[0013] 本发明还涉及所述基因在制备重组脂肪酶中的应用。

[0014] 本发明还涉及所述的脂肪酶在微生物法水解处理油脂污染物中的应用。本发明的脂肪酶的最适温度是25～35℃，最适pH为6.5～7.5。

[0015] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新的脂肪酶基因，能够在酵母菌中高效表达，克服了传统纯培养技术的不足，可提高脂肪酶的表达活力，对于促进脂肪酶在含油脂废水处理中的应用具有重要意义。(四)附图说明

[0016] 图1为活性污泥总DNA电泳图谱；

[0017] 图2为Sau3A I酶切DNA电泳图谱；

[0018] 图3为重组质粒pPIC9K-lipN的EcoR I/Not I双酶切验证电泳图谱；

[0019] 图4为转化酵母中lipN目的基因的PCR验证电泳图谱；M：Marker，A：以5’AOX1和3’AOX1作为引物扩增，B：以α-factor和3’AOX1作为引物扩增

[0020] 图5为脂肪酶的最适pH曲线；

[0021] 图6为脂肪酶的最适温度曲线。(五)具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0023] 实施例1：活性污泥DNA文库的构建

[0024] 1、活性污泥DNA的提取

[0025] 从某食品污水处理厂采集污泥，经过适当稀释作为样品进行DNA的提取。-1 -1
12000r·min 离心5min收集样品，TE重悬洗涤一次后，加溶菌酶至终浓度为100μg·ml ，
37℃水浴2小时。加5M NaCl调整终浓度至0.5M，混匀后加入40μl蛋白酶K和20％SDS(终浓度为0.5～1％)，37℃过夜或者50℃水浴3h至溶液粘稠澄清。加1/3体积的饱和NaCl-1
剧烈振荡15s后，12000r·min 离心5min，收集上清至一灭菌离心管中，加入0.6V异丙醇-1
混匀后沉淀，12000r·min 离心收集沉淀，用70％乙醇洗涤，吹干后溶于400μl灭菌去离子水中，总DNA电泳如图1所示。

[0026] 2、DNA文库的构建

[0027] (1)DNA的酶切

[0028] 用Sau3A I部分酶切活性污泥总DNA，先用检测型反应体系进行酶切，确定最适酶切浓度及时间，最终进行制备型部分酶切。检测型酶切反应体系(10μL)：总DNA 2μL，Sau3AI适量，缓冲液1μL，加ddH2O至终体积10μL。制备型酶切反应体系(100μL)：总DNA20μL，Sau3AI适量，缓冲液10μL，加ddH2O至终体积100μL。其中所加Sau3AI酶量根据酶切浓度及时间进行摸索，切胶回收2～4kb条带的DNA片段，作为外源片段，电泳如图2所示。

[0029] (2)脱磷载体的制备

[0030] 提取puc18质粒，用BamHI进行单酶切，回收1.8kb大小的线性片段进行去磷酸化反应。在微量离心管中建立以下的反应体系：线性化puc18载体28ul，10×碱性磷酸酯酶缓冲液5μl，CIAP(16U/μl TAKARA)0.5ul，加ddH2O至终体积50μl。50℃反应30min，加1/10体积0.5M的EDTA终止反应；合并四管用ddH2O补足至500ul；加400ul酚/氯仿抽提
1次，吸出上清；加1/10V的3M NaAc，2V预冷的乙醇，在-20度沉淀60min；离心收集沉淀，用200μl 70％乙醇洗涤后吹干，用20μlTE溶解。电泳定量，50～100ng/管分装保存于终浓度为50％的灭菌甘油中，备用。

[0031] (3)转化

[0032] 将外源片段和载体按比例进行过夜酶连。取E.coli DH5α高效感受态细胞(每管约200μl)于冰浴中融化，每管加2μl酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴中放置30min，将离心管放入42℃的循环水浴中，热激90s，不要摇动离心管。快速将离心管移到冰浴中使细胞冷却1～2min后每管加800μl预热至37℃的LB培养基，混匀后在37℃摇床-1
中，150r·min 温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因。涂布复苏-1
后的转化液到加氨苄青霉素(100μg·ml )的新鲜LB平板上，待菌液被完全吸收后，倒置平板于37℃培养，12～16h后出现菌落。

[0033] (4)文库的检查与保存

[0034] 挑取150个阳性克隆接种于抗生素平板上，37℃培养至菌落长出后，随机挑取部分转化子进行质粒提取，检查外源片段插入情況，并将培养好的平板于4℃保存备用。检测后的平板用无菌水将菌落洗下后加甘油至终浓度15％，于-70℃保存备用。

[0035] 实施例2：脂肪酶基因的筛选和序列分析

[0036] 将DNA文库中克隆子置于LB液体培养基中培养12h，经适当稀释后涂布于表面均匀涂布2滴橄榄油的初筛平板上，置于37℃条件下培养24h，选取在平板上生长的菌株接入复筛液体培养基中，37℃条件下培养36h后测定每种发酵液中的橄榄油含量。选取对橄榄油有最强降解能力的菌株，提取质粒对插入序列进行测序。脂肪酶基因命名为lipN，载体命名为puc-lipN。

[0037] 测序结果在NCBI Genbank数据库进行序列比对，结果表明，在数据库中没有发现和该基因序列同源的序列，其应为一新序列。经过对脂肪酶基因lipN的分析，预测了该酶可能的编码序列，去除信号肽后，包括起始密码及终止密码在内，共1224个核苷酸(SEQ ID NO：2)，编码408个氨基酸(SEQ ID NO：1)。

[0038] 上述初筛培养基(g·L-1)：(NH4)2SO42.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O0.5，琼脂20.0，-1每皿2滴橄榄油。复筛培养基(g·L )：(NH4)2SO42.0，K2HPO42.0，NaH2PO42.0，NaCl 2.0，MgSO4·7H2O 0.5，橄榄油20.0。

[0039] 实施例3：脂肪酶基因在酵母细胞中的表达

[0040] 1、表达载体的构建

[0041] 设 计 酶 切 位 点 分 别 为 EcoR I 和 Not I 的 引 物 lipNF(ACTG AATTCATGTCCTATGTACCGTTCAG)和lipNR(ACTGCGGCCG CCTACCAGTGGGTCGTACCAA)，以质粒puc-lipN为模板，扩增带有EcoR I/Not I酶切位点的脂肪酶基因lipN，PCR产物用EcoR I/Not I双酶切，回收1.4kb片段，与同样双酶切的pPIC9K(美国invitrogen公司)连接，转化E.coli DH5α，获得重组质粒pPIC9K-lipN。该重组质粒经EcoRI/Not I双酶切验证。酶切验证图谱如图3所示。

[0042] 2、准备转化用DNA

[0043] 将pPIC9k-lipN用Sal I或Sac I或Bgl II酶切线性化，对于酵母细胞而言，用Sal I或Sac I线性化得到的转化子是His+Mut+表型；用Bgl II得到的转化子是His+Muts表型。建议同时分离His+Mut+及His+Muts酵母转化子，因为很难预测哪种结构更利于蛋白表达。

[0044] 3、电转化感受态的制备

[0045] 在含5ml YPD的50ml离心管中，培养酵母细胞，30度过夜；取30～50ul过夜培养物，接种含50ml新鲜培养基的250ml摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3～1.5；在4度，1500g离心5min收集细胞，用50ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用25ml预冷的灭菌水悬浮细胞；如上离心，用2ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞；如上离心，用100ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

[0046] 4、电转化

[0047] 将5～10ug线性化DNA与80uL电转化细胞混匀，转移到0.1cm电转化杯，冰浴5min。电转化参数：0.75kV，25uF，200Ω。电击后立即加入1mL预冷的1M山梨醇。取150ul涂布MD平板上培养。在30度孵育平板至克隆产生。

[0048] 5、筛选遗传霉素抗性转化子

[0049] 吸取1～2ml灭菌水于所有HIS+转化子平板上；用灭菌刮子重悬HIS+转化子，不要划破琼脂；将细胞悬液集中转移至灭菌的50ml离心管中，稍涡旋(5～10S)；用分光光度计测定浓度(1OD600＝5×107细胞/ml)；在每块含有遗传霉素的YPD平板上涂105细胞。(遗传霉素浓度梯度为0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml)；在30度孵育平板，每天检查。抗遗传霉素克隆需2～5天出现。

[0050] 根据文献已经研究过植酸酶基因在酵母中的表达量与其整合在染色体上的拷贝数成正比，而其拷贝数又与其抗遗传霉素的能力成正比，所以需要筛选抗G418浓度3.0及4.0mg/ml的转化子，但是抗如此高遗传霉素的克隆比较少见，需要筛选数以千计的HIS+转化子以分离抗2-4mg/ml遗传霉素的克隆。

[0051] 6、遗传霉素抗性验证

[0052] 将从0.4、1.0和1.75mg/ml浓度的G418平板得到的转化子分别划线于相应抗性的平板上，5天后发现菌落生长良好，并出现单菌落。接单菌落于YPD液体培养基中，过夜培养，保藏菌种。

[0053] 7、PCR鉴定转化子基因

[0054] 用 引 物 5’AOX 1(GACTGGTTCCAATTGACAAGC)、α-factor(TACT AT T G CCAGCATTGCTGC)和3’AOX1(GGCAAATGGCATTCTGACAT)扩增目的基因。PCR条件：95℃3min；95℃1min，56℃30s，72℃1min，28个循环；72℃5min。PCR结束后，通过0.8％琼脂糖电泳检测大小。结果如图4所示，外源线性片段已成功整合入酵母染色体。

[0055] 8、Mut+和Muts表型验证

[0056] 用灭菌牙签挑取单克隆，在MM及MD平板上分别点转化子，确保先在MM平板上点，每个克隆换一次牙签，30度孵育2天。两天后，观察平板，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长的转化子为Muts，生长速度一样的转化子为Mut+。原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。所以Mut+能够在含甲醇(MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖(MD)平板快速生长。根据PCR产物大小和MD平板点菌实验证明转化子为Muts型。

[0057] 9、诱导表达

[0058] 挑取单克隆，接种至含100ml BMGY的1L摇瓶中。在摇床中28～30度，250～300rpm生长至OD600＝2～6(约16～18小时)；室温1500-3000g离心5min收集细胞，去除上清，用1/5～1/10原培养基体积的BMMY重悬细胞(约10～20ml)；置于100ml隔板摇瓶中，用2层灭菌纱布或干酪包布盖住瓶口，放入摇床继续培养；每隔24小时，加入甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导；在下列的各个时间点，取1ml培养基至1.5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间。室温用水平离心机最大转速离心2～3min。时间点：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)；分泌表达时，将上清转移至单独管中，将上清及细胞沉淀存于-80度。

[0059] 10、脂肪酶活性的测定

[0060] 用底物p-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenybutyrate)测定脂肪酶活力。酶活力单位定义为：每分钟释放1umol p-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。酶活力测定通过在25度，脂肪酶水解p-硝基苯丁酸酯为p-硝基酚的量来确定。lipN基因在酵母细胞中表达，脂肪酶酶活在第72h达到最高，为210U/ml。

[0061] 实施例4：脂肪酶的特性研究

[0062] 1、pH值对脂肪酶活性的影响

[0063] 将脂肪酶加入不同pH值的缓冲液体系中测定酶活力，pH设置从3.0到10.0，每隔0.5取点测定。酶活性测定反应在25℃进行，反应时间为15min。结果如图5示，脂肪酶的最适pH值为6.5～7.5，在pH5.5到pH8.5范围内，脂肪酶酶活能保持在60％以上。

[0064] 2、温度对脂肪酶活性的影响

[0065] 脂肪酶的最适反应温度测定在最适pH值下进行，反应时间为15min，温度设置从15℃到75℃，每隔5℃取点测定。结果如图6示，脂肪酶的最适温度为25～35℃，20～45℃时的酶活能保持60％以上。

[0066] 实施例5脂肪酶在污水处理中的应用

[0067] 将脂肪酶按0.1％的添加量添加到某油脂公司废水处理厂SBR工艺(序列间歇式活性污泥法)曝气池中进行含油脂废水的处理。进水水质为：油脂1200mg·L-1，化学需氧量(COD)3000mg·L-1。未使用脂肪酶的对照组油脂降解率为25％，化学需氧量(COD)去除率为70％；使用脂肪酶后油脂降解率为95％，化学需氧量(COD)去除率为96％。与对照组相比，脂肪酶可明显提高含油脂废水处理的效率。