亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途

摘要

本发明公开了亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途。该用途是双功能酶PAI作为delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶的应用；所述双功能酶PAI是如下a)或b)蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶活性由a)衍生的蛋白质。本发明为进一步研究pai基因功能以及利用双功能酶PAI生物合成t10c12-CLA的相关应用性研究提供了依据和方法。

权利要求

1.如下1）或2）或3）的DNA分子：

1）其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

2）在序列表中序列1的第1275位和1276位核苷酸之间插入6个组氨酸的密码子得到的DNA分子；

3）在序列表中序列1的第1275和1276位之间插入6个组氨酸的密码子、在序列1的第1位前加入GCCACC得到的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组病毒。

3.如下蛋白质的表达方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的DNA分子导入离体的哺乳动物细胞中得到表达所述基因的重组细胞，培养所述重组细胞，表达得到所述蛋白质；

所述蛋白质为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

4.蛋白质下述1）或2）的用途：

1）作为delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶的应用；

2）作为delta-12脂肪酸脱氢酶的应用；

所述蛋白质为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述亚油酸异构酶能将亚油酸异构催化为t10c12共轭亚油酸，所述delta-12脂肪酸脱氢酶能将单不饱和脂肪酸的delta 12和13位碳原子各脱去一个H原子得到多不饱和脂肪酸；所述单不饱和脂肪酸的delta 9和10位碳原子间是双键。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述单不饱和脂肪酸的碳原子总数为18。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述单不饱和脂肪酸为油酸。

8.一种制备不饱和脂肪酸的方法，包括如下步骤：将如下蛋白质的编码基因导入哺乳动物细胞中得到表达所述基因的重组细胞，将所述重组细胞在含有油酸和/或亚油酸的动物细胞培养基中培养后收集细胞，从所收集的细胞中提取不饱和脂肪酸；所述不饱和脂肪酸为亚油酸，或为亚油酸和t10c12共轭亚油酸：所述蛋白质由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求4-7中任一所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质按照权利要求3所述的方法制备；或权利要求

8中所述蛋白质的编码基因是权利要求1所述的DNA分子。

说明书

亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途

技术领域

[0001] 本发明涉及亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途。

背景技术

[0002] 共轭亚油酸，英文名Conjugated linoleic acids，缩写为CLA，是指亚油酸(C18H32O2)的一组位置和几何异构体组成的同分异构体的总称。共轭亚油酸的特点是分子含有一对共轭的碳碳双键，一个为顺式，一个为反式，共轭亚油酸至少有28种同分异构体。其中关于顺式-9，反式-11(cis-9，trans-11；c9t11-CLA)和顺式-10，反式-12(trans-10，cis-12；t10c12-CLA)异构体的研究相对较多。c9t11-CLA具有抗癌特性，能降低心血管疾病的发病率，改善免疫功能，抵抗糖尿病等；t10c12-CLA主要参与控制身体脂肪的合成，能减少肥胖症的发生概率，另外也有文献报道t10c12-CLA能够抑制癌细胞的增长。2008年，美国FDA颁发食品许可证，同意将CLA作为食品添加剂使用。目前，CLA已经被许多食品和制药企业作为保健品生产并出售。

[0003] 天然CLA主要来自反刍动物(牛、羊等)的乳汁，由瘤胃微生物产生；一升牛奶的CLA含量在1.4克左右，主要是c9t11-CLA和t10c12-CLA组分，它们的占比大概是8～9∶1。遗憾的是，有相当比例的人群不能食用乳制品，无法获得对身体有益的CLA。工业来源的CLA主要由亚油酸碱性异构化生成，是混合物的形式。其中除了生物活性明晰的c9t11-CLA和t10c12-CLA外，还含有多种杂质性异构体，杂质的含量能达到30％以上，这些杂质成分被人或动物消化吸收后，容易通过花生四烯酸代谢途径衍生出多种有负面生物学效应的共轭类异构体。因此，用于食品添加剂的CLA，最好来自生物合成的单一组分，而不是工业合成的复杂成分。

[0004] 利用基因工程技术，通过微生物、真核细胞、甚至转基因家畜大量生产单一的CLA组分，是一种比较理想的生物合成CLA的途径。这种途径的关键，是获得具有生物活性的功能基因。已经知道，哺乳类的scd1基因，能够在重组细胞中将t18:1脂肪酸转化成c9t11-CLA组分(苟克勉，一种生物合成共轭亚油酸CLA的方法，专利申请号：201010200224.9，专利公开号：CN101864463A)。对于t10c12-CLA组分来说，还没有功能基因在动物细胞或者转基因动物中异源合成的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供亚油酸异构酶在脱氢和异构方面的双重用途。

[0006] 本发明所提供的一个用途是双功能酶PAI作为delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或delta-12脂肪酸脱氢酶的应用；所述双功能酶PAI是如下a)或b)蛋白质：

[0007] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0008] b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有delta-12脂肪酸脱氢酶和亚油酸异构酶，或具有delta-12脂肪酸脱氢酶活性由a)衍生的蛋白质。

[0009] 序列表中序列2所示的氨基酸序列由425个氨基酸残基组成。

[0010] 为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0011] 表1标签的序列

[0012]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0013] 上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0014] 其中，所述亚油酸异构酶能将亚油酸异构催化为t10c12共轭亚油酸，所述delta-12脂肪酸脱氢酶能将单不饱和脂肪酸的delta-12和delta-13位碳原子各脱去一个H原子得到多不饱和脂肪酸；所述单不饱和脂肪酸的delta9和delta-10位碳原子间是双键。

[0015] 所述单不饱和脂肪酸的碳原子总数为18，所述单不饱和脂肪酸具体可为油酸。

[0016] 本发明提供的另一个用途是一种制备不饱和脂肪酸的方法。

[0017] 本发明所提供的制备不饱和脂肪酸的方法，包括如下步骤：将所述双功能酶PAI的编码基因导入哺乳动物细胞中得到表达所述基因的重组细胞，将所述重组细胞在含有油酸和/或亚油酸的动物细胞培养基中培养后收集细胞，从所收集的细胞中提取不饱和脂肪酸；所述不饱和脂肪酸为亚油酸，或为亚油酸和t10c12共轭亚油酸。

[0018] 所述哺乳动物细胞具体可为离体的哺乳动物细胞。

[0019] 所述离体的哺乳动物细具体可为NIH/3T3细胞。

[0020] 所述b)的蛋白质具体可为将序列表中序列2的第425位氨基酸残基的羧基端连接6个组氨酸残基得到的蛋白质。

[0021] 编码所述双功能酶PAI的基因也属于本发明的保护范围。

[0022] 编码所述双功能酶PAI的基因，简称pai，可为如下1)或2)的DNA分子：

[0023] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

[0024] 2)在序列表中序列1的第1275和1276位之间插入6个组氨酸的密码子得到的DNA分子。

[0025] 含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

[0026] 含有所述DNA分子的重组载体具体可为将上述1)或2)的DNA分子插入pIRES-AcGFP得到的表达上述a)或b)蛋白质的重组表达载体。

[0027] 所述PAI的编码基因是通过转染或者转化方法在宿主细胞和/或动物个体中表达。

[0028] 所述双功能酶PAI的表达方法，可包括如下步骤：将上述1)或2)的DNA分子导入离体的哺乳动物细胞中得到表达所述基因的重组细胞，培养所述重组细胞，表达得到所述双功能酶PAI。

[0029] 本发明将一种源于真菌的亚油酸异构酶的基因进行密码子优化后，转染到动物细胞中，结果发现，该酶具有delta-12脱氢酶的活性，能够增加亚油酸的含量；同时，该酶还具有cis-9异构酶的活性，能够将亚油酸转化成t10c12-CLA成分。本发明首次阐明，该基因具有脱氢酶和异构酶的双重生物学活性。导入该优化基因的NIH/3T3细胞，能够显著(p＜0.05)增加目标产品亚油酸和t10c12-CLA的含量；其中亚油酸含量提高了15.4～24.7％、t10c12-CLA异构体含量提高了59.4～223.7％；本发明为进一步研究pai基因功能以及利用双功能酶PAI生物合成t10c12-CLA的相关应用性研究提供了依据和方法。

附图说明

[0030] 图1为pai基因转录的RT-PCR分析。

[0031] 图2为GFP细胞和pai细胞系F样品中亚油酸(28.4min)和t10c12-CLA(31.6min)组分的检测信号。

具体实施方式

[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0034] 实施例1、外源pai基因在NIH/3T3细胞中的稳定表达

[0035] 一、真核基因表达结构的构建

[0036] 根据公开发表的疮疱丙酸杆菌亚油酸异构酶pai原始基因序列(GenBank accession number AX062088)，通过基因工程手段，将DNA原始序列进行了密码子优化；同时在起始密码子ATG前面加入称为Kozak序列寡核苷酸，如GCCACC，ATG后面加入GNN，以满足Kozak规则。本实施例在起始密码子ATG后加入1个甘氨酸密码子GGA；在终止密码子TAA前加入组氨酸标签的编码序列。该优化的核苷酸序列为在序列表中序列1的第1275和1276位之间插入6个组氨酸的密码子、在ATG(序列1的第1位)前加入GCCACC得到的DNA序列，其中序列1的第5和6位分别为G和A。所插入6个组氨酸的密码子中，前5个组氨酸的密码子均为CAT，第6个组氨酸的密码子为CAC。该优化的核苷酸序列编码蛋白PAI，该蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2的第425位氨基酸残基的羧基端连接6个组氨酸残基得到的序列，其中，序列2的第2位氨基酸为甘氨酸。优化的pai基因通过EcoRI酶切位点连接到pIRES-AcGFP质粒(美国Clontech公司)上，构建成pPAI质粒。酶切鉴定和DNA测序证明，pPAI质粒序列没有突变。常规的苯酚--氯仿抽提并纯化pPAI质粒，用于转染NIH/3T3细胞(美国Sigma公司，货号93061524)。

[0037] 二、细胞培养与转染

[0038] 按照常规方法，在37℃，5％CO2培养条件下，NIH/3T3细胞用DMEM细胞培养液(high glucose，Gibco公司)+10％新生牛血清(new calf serum，GIBCO)培养。细胞传代时，使用0.05％(w/v)trypsin(胰蛋白酶)+0.04％(w/v)EDTA溶液在37℃消化2分钟即可。

[0039] 在直径Φ35-mm的培养皿中接种NIH/3T3细胞(1×105个/ml)，待融合度达到70％时转染，转染前将培养液倒掉，用不含血清的培养液漂洗2次，再加1ml无血清培养液；
TM
将10μl脂质体(美国Invitrogen公司，Lipofectamine 2000，货号11668-019)稀释到
250μl无血清DMEM/F12中，轻轻混匀，室温静置5min，同时将4μg的pPAI质粒DNA稀释到另一份250μl无血清DMEM/F12中，轻轻混匀，室温静置5min；然后将这两种稀释液共
500μl混合在一起，轻轻混匀，室温静置20min；随后，将500μl混合液轻轻滴入Φ35-mm培养皿中，前后晃动轻轻混匀，放入CO2培养箱；6h后，换成标准血清培养液继续培养24h，然后消化，并转移到24孔板中，用有血清培养液培养，每孔0.5ml；培养24-48h后根据细胞
5
密度(约1×10/ml)添加G418培养液(G418终浓度0.6mg/ml)，筛选14天。期间，每3-5天换掉一半溶液；14天后用荧光显微镜观察，选择有绿色荧光的、正常生长的细胞株消化并接种到培养皿中继续培养，具体地，每株细胞使用一个Φ35-mm培养皿，生长到70-80％时，消化转移到Φ60-mm培养皿，随后，再用Φ100-mm培养皿，冻存相应的细胞系，保存或者进行下面的分析。转染目标质粒pPAI的同时，另外还转染pIRES-AcGFP质粒，并获得表达GFP荧光的细胞系，作为标准对照。

[0040] 三、RT-PCR转录分析

[0041] 上述转染、筛选获得阳性pai细胞和对照GFP细胞有多株。随机选择其中的9株pai细胞系和1株GFP细胞系，继续培养后，消化、离心回收汇合度达70％的细胞，按照标准方法用RNAiso Plus(TaKaRa)试剂提取细胞总RNA，并且用DNase I(TaKaRa)消化去除混杂的DNA成分。用纯化RNA进行反转录获得cDNA，使用M-MLV反转录酶(Promega)，按照生产商提供的说明操作。为了检测是否存在基因组DNA的污染，每个RNA样品均有不添加反转录酶的阴性对照。

[0042] 设计并合成不同基因的PCR扩增引物，具体地，pai基因上游引物5’-gga ttc cacgat tac acc a-3’，下游引物5’-ggg tca tca gcc cat cta-3’，扩增片段长度是878-bp；持家基因hprt上游引物5’-cct gct gga tta cat taa agc act g-3’，下游引物
5’-gtc aag gca tat cca aca aca aac-3’，扩增片段长度是352-bp。以上述反转录获得的cDNA模板和基因的扩增引物，用相同的PCR条件，分别扩增两个基因的特异片段。PCR条件是：94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，共35个循环。PCR产物进行凝胶电泳分析并拍照。

[0043] RT-PCR实验结果证明，随机选择的9株pai细胞均表达pai基因(同时表达hprt持家基因，且都能够正常生长)，图1显示了其中3株细胞D、E、F的RT-PCR分析结果。而GFP细胞没有检测到pai基因的表达。与3T3和空载体转染获得的GFP细胞样品相比，细胞株D、E、F样品均转录pai基因片段(878-bp)，说明这三株细胞属于pai阳性细胞。所有细胞样品都转录hprt持家基因片段(352-bp)。图1中，3T3表示NIH/3T3细胞，GFP为转pIRES-AcGFP的NIH/3T3细胞，D、E、F为3株转pPAI的NIH/3T3细胞。

[0044] 实施例2、脂肪酸测定及外源pai基因指导的CLA生物合成

[0045] 1株未转染对照细胞NIH/3T3、实施例1获得的1株GPF对照细胞、实施例1获得5
的9株阳性pai细胞系分别按每毫升2×10 个细胞的密度接种至Φ100-mm培养皿中，分开培养。

[0046] 一、脂肪酸测定

[0047] 将上述11株细胞用DMEM+10％新生牛血清在37℃，5％CO2条件下培养12h后，换成添加30μM亚油酸(Sigma，L1012)的上述新鲜培养基，再继续培养48h后，将各株细胞收集至带聚四氟乙烯瓶盖的玻璃甲基化管中，进行高压气相色谱分析。具体步骤是：管内细胞先溶于1.0ml正己烷，接着添加1.0ml 14％的BF3/MeOH试剂(Sigma，B1252)混匀，向玻璃管中充入氮气，沸水浴1h后自然冷却至室温，添加1.0ml双蒸水，离心(3,000rpm，1min)分离的上相直接进样到100米长HP-88型色谱柱(J&W112-88A7型号，Agilent，USA)，使用HP7890全自动气相色谱仪(Agilent)进行分析，具体气相色谱程序是：初始温度120℃，保持1min；以10℃/min的速度升温至175℃，保持10min；再以5℃/min的速度升温至210℃，保持5min；再以5℃/min的速度升温至240℃，保持10min后结束。载气为氦气，分流比为10∶1。参照脂肪酸标准品(Sigma，47885-U和O5632)的峰面积，将仪器检测到的信号，用GC ChemStationSoftware(Agilent)软件处理，计算相对含量，细胞培养和脂肪酸测定的实验连续重复4次。上述条件下，脂肪酸样品中的t10c12-CLA、亚油酸(18:2n6)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1n9)、花生四烯酸(20:4n6)保留时间分别为31.6、28.4、25.5、26.7、
35.0min。图2只列出了转pIRES-AcGFP的NIH/3T3细胞(A)和pai细胞系F样品(转pPAI的NIH/3T3细胞)(B)中亚油酸(28.4min)和t10c12-CLA(31.6min)组分的检测信号。图2中的横坐标为保留时间分钟，纵坐标为检测信号。*表示同一组分间差异显著(p＜0.05)。

[0048] 二、脂肪酸测定结果统计分析

[0049] 从表2中可以看出：

[0050] 1)异源表达的pai基因能够提高细胞中t10c12-CLA的含量，具有亚油酸异构酶活性。

[0051] 编号D、E、F的pai细胞系样品，它们的t10c12-CLA含量分别是3.49±0.45，3.66±0.60和7.09±1.98，显著(p＜0.05)高于NIH/3T3细胞(1.78±0.44)和GFP细胞(2.19±0.31)样品。也就是说，亚油酸异构酶PAI的异源表达，能够有效地合成t10c12-CLA，相对于GFP对照细胞，t10c12-CLA含量至少提高了59.4％，最高达到了
223.7％。

[0052] 2)异源表达的pai基因能够提高细胞中亚油酸18:2n6含量，具有delta-12脱氢酶的活性。

[0053] 亚油酸(18:2n6)作为异构酶PAI的反应底物，在三株pai细胞系(编号D、E、F)脂肪酸总量中的占比分别是15.54±0.57，14.58±0.09和14.38±1.03，这些数据显著(p＜0.05)高于NIH/3T3细胞(11.80±0.81)和GFP细胞(12.46±0.71)样品中的亚油酸含量；相反，pai细胞组的硬脂酸(18:0)含量在11.85±0.51至12.54±0.15之间，显著(p＜0.05)低于3T3细胞(14.13±0.01)和GFP细胞(14.07±0.48)样品；另外，在代谢过程中介于硬脂酸(C18:0)和亚油酸中间的油酸(18:1n9)含量却没有组间的明显差异(p＞0.05)。目前的知识是，动物细胞中，存在delta-9脱氢酶，能够将硬脂酸在delta-9位脱氢生成油酸；但是没有能够将油酸在delta-12继续脱氢的delta-12脱氢酶(植物细胞和微生物具有这种delta-12脱氢酶)。由此看出，pai基因也具有delta-12脱氢酶的活性，能够将油酸生物合成为亚油酸，细胞中减少的油酸又由硬脂酸转化而来，最终表现为硬脂酸显著减少，而亚油酸显著升高。

[0054] 3)异源表达的pai基因能够有效地降低细胞中花生四烯酸含量。

[0055] 与NIH/3T3细胞(13.35±1.23)和GFP细胞(13.31±0.77)相比，pai细胞样品中的花生四烯酸(20:4n6)成分显著(p＜0.05)减少，只有9.03±0.85～11.13±0.25。这个结果说明，异源表达的亚油酸异构酶PAI能够干扰花生四烯酸的生物合成过程或者加快花生四烯酸的代谢过程。

[0056] 综上所述，pai基因具有广泛的生物学活性，具体表现为亚油酸异构酶活性和delta-12脱氢酶的活性，干扰花生四烯酸的生物合成或代谢过程；而且具有明显的应用价值，能够实现亚油酸和t10c12-CLA的生物合成。

[0057] 表2pai细胞部分脂肪酸成分的改变

[0058]脂肪酸组分 NIH/3T3 GFP D E F
t10c12-CLA 1.78±0.44 2.19±0.31 3.49±0.45* 3.66±0.60* 7.09±1.98*
C18:0 14.13±0.01 14.07±0.48 12.54±0.15* 11.85±0.51* 11.93±0.13*
18:1n9 18.00±1.21 18.45±2.00 18.40±0.81 18.65±0.31 17.35±0.55
18:2n6 11.80±0.81 12.46±0.71 15.54±0.57* 14.58±0.09* 14.38±1.03*
20:4n6 13.35±1.23 13.31±0.77 10.57±0.49* 11.13±0.25* 9.03±0.85*[0059] 表格说明：表中各数据(平均值±SD)代表相应脂肪酸组分占细胞脂肪酸总量的百分比，来自4次重复实验的结果。三株pai细胞系(D、E、F)与GFP及NIH/3T3细胞对照细胞系间的差异用t-检验分析，*表示差异显著(p＜0.05)。NIH/3T3表示NIH/3T3细胞，GFP为转pIRES-AcGFP的NIH/3T3细胞，D、E、F为3株转pPAI的NIH/3T3细胞。