一种制备IL28B的方法及专用重组菌

摘要

本发明公开了一种制备IL28B的方法及专用重组菌。本发明的重组酵母菌，是将SEQ ID NO：1所示基因导入宿主酵母菌中得到的。实验证明，用本发明的重组菌制备IL28B，表达量高。且表达产物具有较强的活性。因此，本发明重组菌及本发明方法在IL28B的制备领域中有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种人白细胞介素28B的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述人白细胞介素28B的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。

3.一种重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因插入表达载体pPinkα-HC的多克隆位点得到的。

4.一种重组酵母菌，是将SEQ ID NO：1所示编码基因导入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌为如下四种菌株中的至少一种：ade2蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/prb1蛋白酶缺陷型毕赤酵母和ade2/prb1/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母。

5.根据权利要求4所述的重组酵母菌，其特征在于：所述编码基因是通过权利要求3所述重组表达载体导入的。

6.权利要求4或5所述的重组酵母菌在制备人白细胞介素28B中的应用。

7.一种制备人白细胞介素28B的方法，包括如下步骤：

1）将权利要求4或5所述的重组酵母菌预培养至对数生长期；

2）用甲醇对步骤1）得到的菌进行诱导培养，诱导培养完毕，收集上清液，即得到人白细胞介素28B；

所述步骤1）中，所述预培养包括如下步骤：将权利要求4所述的重组酵母菌接种于用于预培养酵母菌的培养基中，培养至培养体系的OD600为5.0～6.0；

所述步骤2）中，在所述用甲醇进行诱导之前，包括如下步骤：将步骤1）得到的菌体重悬于用于诱导酵母菌的培养基中，再培养10-14h；

所述用于预培养酵母菌的培养基为BMGY培养基；所述用于诱导酵母菌的培养基为BMMY培养基；

所述预培养和所述诱导培养的温度均为30℃；

所述步骤2）中，所述甲醇占诱导培养体系体积百分比的0.5%-4.0%；所述诱导培养的时间为36h-72h。

说明书

一种制备IL28B的方法及专用重组菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一种制备IL28B的方法及专用重组菌。

背景技术

[0002] 感染性疾病是严重威胁人类健康的公共卫生问题。据世界卫生组织2002年报告，在对人类危害最严重的疾病病种中，有约80％是传染病和寄生虫病。而在临床微生物感染症中，由病毒引起的约占75％。病毒性疾病由于具有传染性强、传播迅速、流行广泛、死亡率高、缺乏特异性药物等特点，给人类健康与经济社会发展带来巨大的危害。

[0003] 在众多抗病毒制剂中，几十年前发现的干扰素(IFN)及基于干扰素的各种治疗方案目前仍然是治疗多种病毒感染的最基本的治疗策略。人类白细胞介素29(HumanInterleukin 29，hIL-29)家族成员包括三个重要分子，它们分别是：IL-29，IL-28A和IL-28B，又分别称为干扰素λ1，λ2和λ3，属于一大类新发现的III型干扰素。2003年，由Sheppard等的工作首次报道了人IL28A、IL28B及IL29基因及其编码产物，具有干扰素样活性(Sheppard P，Kindsvogel W，Xu W，Henderson K，Schlutsmeyer S，WhitmoreTE，Kuestner R，Garrigues U，Birks C，Roraback J，Ostrander C，Dong D，Shin J，Presnell S，Fox B，Haldeman B，Cooper E，Taft D，Gilbert T，Grant FJ，Tackett M，Krivan W，McKnightG，Clegg C，Foster D，Klucher KM.IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol.2003 Jan；4(1)：63-8.Epub 2002 Dec 2.)。自
2003年被发现以来，III型干扰素在很大程度上一直被认为是I型干扰素的一个“穷亲戚”，许多功能似乎和I型干扰素重叠而且直至现在也少有其作为一个独立的、具有重要临床作用的细胞因子的证据。一直以来，人们对III型干扰素的生物学研究主要集中在IL29和IL28A。

[0004] 依据受体相似性，IFN-λs属于II型细胞因子家族。II型细胞因子家族包含三个类型的干扰素(I、II、III型)以及白细胞介素10(IL-10)相关的细胞因子。I型干扰素包括IFN-α和IFN-β，II型干扰素即为IFN-γ。III型干扰素包括IL29，IL28A和IL28B。其中，IL28B与IL28A氨基酸序列高度同源(96％)，而与IL29的同源性较低(81％)(Sheppard P，Kindsvogel W，Xu W，Henderson K，Schlutsmeyer S，Whitmore TE，Kuestner R，Garrigues U，Birks C，Roraback J，Ostrander C，Dong D，Shin J，Presnell S，Fox B，Haldeman B，Cooper E，Taft D，Gilbert T，Grant FJ，Tackett M，Krivan W，McKnightG，Clegg C，Foster D，Klucher KM.IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R.Nat Immunol.2003 Jan；4(1)：63-8.Epub 2002 Dec 2.)。目前，针对三种不同的IFN-λs细胞因子生物学特性的比较数据还很有限。尽管II型细胞因子在氨基酸水平上差异很大，但它们在结构上却是通过各自相关的异源二聚体跨膜蛋白受体，共享一个α螺旋模式和信号。但是，干扰素的生物学活性最终取决于没有关联的受体细胞质区域，因而可能导致这些干扰素之间结构相似但生物学功能不同。这意味着除了他们的受体在不同细胞类型中分布模式不同外，不同类型的II型细胞因子在功能上也是不同的。

[0005] III型干扰素具有多种生物学功能，其刺激细胞可产生数百种干扰素诱导基因(ISGs)。Marcello等利用丙型肝炎病毒(HCV)复制子细胞培养系统检测了在IFN-α和IFNλ刺激条件下ISG的表达、蛋白产量和HCV RNA的复制。在这个系统中两种细胞因子最终都抑制了HCV的复制。但STAT的活化动力学和所诱导的潜在效应基因却不同。特别是，IFN-αs诱导的基因达到高峰后迅速下降，而IFN-λs所诱导的基因稳步增长。因此，I型和III型干扰素之间功能上的区别和相互作用可能是由于信号转导通路的这个细节引起(Marcello T，Grakoui A，Barba-Spaeth G，Machlin ES，KotenkoSV，MacDonald MR，Rice CM.Interferons alpha and lambda inhibit hepatitis C virusreplication with distinct signal transduction and gene regulation kinetics.Gastroenterology.2006 Dec；131(6)：1887-98.Epub 2006 Oct 1.)。IFN-λs的功能尚未完全阐明，产生IFN-λs的细胞分布不同，但他们都可以利用合适的受体对IFN-λs做出应答。IFN-λs在免疫细胞上的功能与IFN-α相似，是非常复杂多样的。猕猴接种HIV抗原后，IFN-λs能降低Th2型细胞因子(IL-4和IL-5和IL-13和IL-14和IL-15)的产生，这可能有利于Th1免疫途径，增加调节性T细胞，提高CD8T细胞的细胞毒性和应答记忆(DaiJ，Megjugorac NJ，Gallagher GE，Yu RY，Gallagher G.IFN-lambda1(IL-29)inhibitsGATA3 expression and suppresses Th2 responses in human naive and memory T cells.Blood.2009 Jun 4；113(23)：5829-38.)。然而，又有学者表明，免疫细胞亚群(单核细胞，NK细胞，T细胞)对IFN-λ1和IFN-λ2的反应迟钝，推测原因是外周血单核细胞产生的一种可溶性受体引起。IFN-λs的抗病毒作用已比较明确，在体外IFN-λs可保护人细胞系抵抗水泡口炎病毒(VSV)和心肌炎病毒引起的细胞病变；IFN-λ1可抑制HBV和HCV在肝细胞中的复制(Doyle SE，Schreckhise H，Khuu-Duong K，Henderson K，Rosler R，Storey H，Yao L，Liu H，Barahmand-pour F，Sivakumar P，Chan C，Birks C，FosterD，Clegg CH，Wietzke-Braun P，Mihm S，Klucher KM.Interleukin-29 uses a type 1interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes.Hepatology.2006 Oct；44(4)：896-906.)。

[0006] III型IFNs的产生。一般来说，IFN-λ家族和IFN-α都具有抗病毒的免疫调节的功能，但他们也有重要的差异。所有有核细胞均可产生IFN-αs，而IFN-λs只能有少数细胞类型表达。浆单核细胞衍生的树突状细胞(pDC和MDDC)和巨噬细胞在应答流感病毒感染和/或细菌和病毒模拟分子(即Toll-like receptor agonistslipopolysaccharide and poly I：C)时产生IFN-λs(Megjugorac NJ，Gallagher GE，GallagherG.IL-4 enhances IFN-l1(IL-29)production by plasmacytoid DCs via monocyte secretion ofIL-1Ra.Blood 2010；115：4185e90.)。有趣的是，将巨噬细胞与IFN-α预培养可显著增加IFN-λs的产生，这也是二者信号通路相互影响的证据。有证据表明，IFN-λs的分泌可能是受细胞因子的影响，例如，pDCs细胞通过单核细胞介导的信号应答于IL-4，产生更多的IFN-λs。还有证据表明IFN-λs在皮肤生物学具有特定的作用，那里的调节性T细胞和树突状细胞很容易产生IFN-λs，作用于角质形成细胞和黑色素细胞。与HCV感染密切相关的细胞，肝癌细胞系(HepG2和Huh7.5)，体外培养的原代肝细胞和肝活检标本中获得的肝组织，均会应答于病毒感染而产生IFN-λs(Mihm S，Frese M，Meier V，Wietzke-Braun P，Scharf JG，Bartenschlager R，Ramadori G.Interferon type I geneexpression in chronic hepatitis C.Lab Invest.2004 Sep；84(9)：1148-59.)。相反的，人类原代中枢神经组织不产生IFN-λs。

[0007] 近年来的研究表明，IL28B基因多态性对于HCV感染者对IFN治疗的病毒学应答具有一定的影响。与细胞因子IL28B相关的单核苷酸多态性(SNPs)，在群体水平上，是决定HCV感染治疗结果的一个主要的宿主因素(Ge D，Fellay J，Thompson AJ，Simon JS，Shianna KV，Urban TJ，Heinzen EL，Qiu P，Bertelsen AH，Muir AJ，Sulkowski M，McHutchison JG，Goldstein DB.Genetic variaion in IL28B predicts hepatitis Ctreatment-induced viral clearance.Nature.2009 Sep 17；461(7262)：399-401.)。由此，人们有理由相信IL28B参与体内的病毒学应答，尽管目前机制方面并不十分清楚。目前，关于IL29的功能研究较多，美国zymogenetics公司与BMS联合研发的PEG-IL29细胞因子已经进入临床研究，并展示出良好的抗HCV前景。但是IL28B作为药物的研究目前还是个空白。

[0008] 重组蛋白类药物的制备方法主要包括：大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞、昆虫细胞、动植物生物反应器等基因工程方法。酵母表达系统具有如下优点：属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的功能；强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平；适合大规模工业化生产；可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；以甲醇作为诱导物，生产成本低，无毒。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的是提供一种优化的人白细胞介素28B的编码基因。

[0010] 本发明所提供的优化的人白细胞介素28B的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

[0011] 含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明的保护范围。

[0012] 其中，重组表达载体，是将SEQ ID NO：1所示基因插入表达载体pPinkα-HC的多克隆位点得到的。

[0013] 具体的，是将SEQ ID NO：1所述基因插入表达载体pPinkα-HC的Stu I和KpnI酶切位点间得到的。

[0014] 其中，重组酵母菌，是将SEQ ID NO：1所示编码基因导入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具体为毕赤酵母，再具体为如下四种菌株中的至少一种：ade2蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母、ade2/prb1蛋白酶缺陷型毕赤酵母和ade2/prb1/pep4蛋白酶缺陷型毕赤酵母。

[0015] 上述重组酵母菌中，所述编码基因是通过上述任一所述重组表达载体导入的。

[0016] 上述任一所述的重组酵母菌在制备人白细胞介素28B中的应用也属于本发明的保护范围。

[0017] 本发明的另一个目的是提供一种制备人白细胞介素28B的方法。

[0018] 本发明所提供的制备人白细胞介素28B的方法，包括如下步骤：

[0019] 1)将上述任一所述的重组酵母菌预培养至对数生长期；(诱导前进行培养的主要目的是让菌体达到对数生长期，该期是细胞增殖最旺盛活力最好的时期，适合蛋白的诱导表达)

[0020] 2)用甲醇对步骤1)得到的菌进行诱导培养，诱导培养完毕，收集上清液，即得到人白细胞介素28B。

[0021] 所述步骤2)中，所述甲醇占诱导培养体系的0.5％-10.0％或0.5％-4.0％(体积百分比)，具体为1％-4％、或2％-4％或2％-3％。

[0022] 所述步骤2)中，所述诱导培养的时间为36h-72h，具体为48h-72h或60h-72h。

[0023] 所述步骤1)中，所述预培养包括如下步骤：将上述任一所述的重组酵母菌接种于用于培养酵母的培养基中，培养至培养体系的OD600为5.0～6.0；

[0024] 所述步骤2)中，在所述用甲醇进行诱导之前，包括如下步骤：将步骤1)得到的菌体重悬于用于诱导酵母菌的培养基中，再培养10-14h；

[0025] 所述用于培养酵母菌的培养基为用于培养毕赤酵母菌的培养基，具体为BMGY培养基；所述用于诱导酵母菌的培养基为用于诱导毕赤酵母菌的培养基，具体为BMMY培养基；

[0026] 所述培养的温度为30℃。

[0027] 实验证明，用本发明的重组菌制备IL28B，表达量高，纯化过程简便，且表达产物具有较强的活性。因此，本发明重组菌及本发明方法在IL28B的制备及免疫调节、抗病毒治疗等领域中有广阔的应用前景。

附图说明

[0028] 图1为pPinkαHC-Opt-hIL28B重组质粒的酶切鉴定。

[0029] 图2为opt-hIL28B在PichiaPink strain 2号菌株中高表达克隆的筛选。

[0030] 图3为opt-hIL28B重组蛋白高效表达株的表达条件的优化。本图为12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色结果。

[0031] 图4为重组hIL28B蛋白的纯化。本图为12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色结果。

[0032] 图5为重组hIL28B蛋白的质谱分析。

[0033] 图6为利用本发明制备并纯化的opt-hIL28B重组蛋白及购自美国R&D公司的重组IL28B、IL29蛋白及购自先灵葆雅公司的IFN-α2b对人肝癌细胞系HepG2细胞内信号通路分子STAT1(Tyr701)磷酸化的激活。

具体实施方式

[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0036] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。胎牛血清及DMEM培养基购自Invitrogen公司，质粒大量提取试剂盒、转染试剂购自Giantagen公司。一次性细胞培养板以及移液管等耗材购自Corning公司。

[0037] 实施例1、重组菌的制备及应用

[0038] 一、重组菌制备

[0039] 1、基因

[0040] 人工合成经密码子优化后的人IL-28B基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。密码子优化前的基因名称为hIL28B，密码子优化后的基因名称为opt-hIL28B。与hIL28B基因相比，opt-hIL28B基因的核苷酸序列发生变化，氨基酸序列不变。该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。密码子优化前的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0041] 2、重组表达载体

[0042] pPinkα-HC载体购自美国Invitrogen公司，目录号：A11153。

[0043] 将人工合成的opt-hIL28B基因，通过Stu I和KpnI酶切位点克隆到PichiaPink酵母菌专用表达载体pPinkα-HC的相应酶切位点中，获得的重组表达质粒记作pPinkαHC-opt-hIL28B。

[0044] 将重组质粒pPinkαHC-opt-hIL28B进行酶切鉴定，结果如图1。图中，M1：DNA分子量标准(TAKARA公司：DL 2,000)；M2：DNA分子量标准(TAKARA公司：DL15,000)；1：pPinkαHC-opt-hIL28B质粒以Xho I和Kpn I双酶切；2：pPinkαHC-opt-hIL28B质粒以Spe I单酶切。结果：双酶切泳道可见在500bp上方有插入片段被切出。表明构建的重组表达质粒正确。

[0045] 将重组质粒pPinkαHC-opt-hIL28B进行测序鉴定。结果显示在载体pPinkα-HC的Stu I和Kpn I酶切位点间沿着从Stu I至Kpn I的方向，插入的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

[0046] 测序结果完全正确的质粒用Giantagen公司GIANTPREP质粒大量提取试剂盒(目录号：G060303)按说明书进行大量制备。

[0047] 3、重组菌

[0048] (1)pPinkαHC-opt-hIL28B质粒DNA的线性化

[0049] 取10μg pPinkαHC-opt-hIL28B重组质粒，用限制性内切酶Spe I按照说明书建议的反应体系进行线性化，线性化后的DNA经纯化后，溶于10ul的无菌去离子水中。

[0050] (2)酵母菌感受态细胞的制备

[0051] 酵母菌株1#、2#、3#和4#均购自美国Invitrogen公司，目录号：A11154。这四株菌均属于目录号为A11154的试剂盒，不同菌株都有清晰的标记，使用者很容易区分开。

[0052] PichiaPink表达系统中酵母菌株1#、2#、3#和4#分别为蛋白酶缺陷型，缺陷的基因分别为ade2、ade2/pep4、ade2/prb1和ade2/prb1/pep4。ade2、prb1、pep4是公知的，酵母菌株1#、2#、3#和4#均购自美国Invitrogen公司，其说明书上标明它们是通过基因敲除方式构造的缺陷株。

[0053] 1.分别挑取PichiaPink酵母表达系统中的菌株的单菌落，接种至含有10ml YPD培养基的125ml三角瓶中，30℃，260r/min培养1天；

[0054] 2.分别取上述步骤中复苏后的四种菌株培养物100～500μl，接种至含有100ml新鲜YPD培养基的1L三角摇瓶中，调整接菌浓度使初始OD600＝0.2，30℃，260rpm/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；

[0055] 3.将步骤2中酵母细胞培养物转移至300ml无菌离心瓶中，4℃，1500g离心5min，弃上清，菌体沉淀用200ml冰预冷的无菌水重悬；

[0056] 4.按步骤3离心，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

[0057] 5.按步骤3离心，用10ml的冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

[0058] 6.按步骤3离心，用300ul的冰预冷的1M山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为500ul。制备好的感受态置冰上放置，并且当天使用。

[0059] (3)酵母菌的电转化

[0060] 1.分别取5μg pPinkαHC-opt-hIL28B纯化后的线性化DNA与80μl四种菌株的感受态细胞混合均匀，转移至0.2cm冰预冷的电转杯中，冰浴5min；

[0061] 2.运用Bio-Rad公司的MicroPulser Electroporator，进行电转，电转条件为2kV，25Ω，200μF；电击时间为5ms左右。电击完毕后，加入1ml冰预冷的YPDS培养基将菌体混合均匀，转移至30℃，静置培养2h；

[0062] 3.每管取100～300μl菌体悬液涂布于PAD选择培养板上，将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现；

[0063] 4.从步骤3中每板分别挑取3-8个白色克隆至新鲜的PAD选择培养板中，重新划线分离纯化培养至出现单菌落。

[0064] PAD、YPDS均购自美国Invitrogen公司，目录号：A11156。PichiaPink Media Kit。

[0065] 同时设如下两组对照：

[0066] 对照1：转入SEQ ID NO：3所示编码基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制备方法与实验组基本相同，只是转入的基因不同，为优化前基因。

[0067] 对照2：转入空载体pPinkα-HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制备方法与实验组基本相同，不同的是只转入空载体pPinkα-HC。

[0068] 二、蛋白的表达

[0069] BMGY培养基组成及各成分在培养基中的浓度如下：1％酵母粉(yeast extract)，2％蛋白胨(peptone)，1.34％ YNB，0.0004％生物素(biotin)，1％甘油，用100mM、pH 6.0的磷酸盐缓冲液(potassium phosphate)补足体积。所述百分含量除甘油为体积百分比外，其余均为质量百分含量。

[0070] BMMY培养基组成及各成分在培养基中的浓度如下：1％酵母粉(yeast extract)，2％蛋白胨(peptone)，1.34％ YNB，0.0004％生物素(biotin)，0.5％甲醇，用100mM、pH
6.0的磷酸盐缓冲液(potassium phosphate)补足体积。所述百分含量除甲醇为体积百分比外，其余均为质量百分含量。

[0071] (一)重组hIL28B在四种不同菌株中表达量的比较及高表达株的筛选

[0072] 实验组和对照组在相同条件下进行蛋白表达和目的蛋白含量检测。

[0073] 1.挑取含有opt-hIL28B的单菌落接种至含有10ml BMGY培养基的125ml三角瓶中，30℃，260rpm/min培养1天；

[0074] 2.将培养物转移至50mL锥底离心管中，1500g室温离心5min，弃上清，沉淀重悬于1ml BMMY培养基中，30℃，260rpm/min培养过夜；

[0075] 3.次日加入100ul 40％(体积百分比)甲醇水溶液，30℃，260rpm/min继续培养过夜；

[0076] 4.第二天1500g×10min离心收集上清，取20ul经SDS-PAGE分析比较不同菌株中表达量的变化。结果显示，与hIL28B相比密码子优化后的opt-hIL28B在PichiaPink表达系统strain1#、strain2#、strain3#、strain4#四种不同菌株中的表达量均上升。

[0077] 5.opt-hIL28B在PichiaPink表达系统strain1#、strain2#、strain3#、strain4#四种不同菌株中表达量的比较。分别挑取转入SEQ ID NO：1所示编码基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#各32个克隆进行诱导表达，收集上清液，用Bicinchoninic acid(BCA)法检测上清液中各蛋白的表达量，结果取平均数，具体如下：

[0078] 实验组：转入SEQ ID NO：1所示编码基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表达量依次为：0.149ug/ul、0.163ug/ul、0.062ug/ul、0.049ug/ul。显示opt-hIL28B在strain2#的表达量高于其他三种菌株。

[0079] 对照1：转入SEQ ID NO：3所示编码基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表达量依次为：0.106ug/ul、0.117ug/ul、0.043ug/ul、0.032ug/ul。

[0080] 对照2：转入空载体pPinkα-HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中均没有检测到目的蛋白的表达。

[0081] 6.opt-hIL28B在PichiaPink表达系统strain2#菌株中高表达克隆的筛选。在确定opt-hIL28B在strain2#中的表达量高于其他三种菌株的基础上，进一步大规模挑取转有opt-hIL28B的strain2#单菌落进行诱导表达，通过SDS-PAGE分析比较(图2)，筛选出5株opt-hIL28B的高表达株，选择其中表达量最高的2号菌株进一步进行下游实验。电泳为12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。

[0082] (二)重组hIL28B高效表达株的表达条件优化。

[0083] 1.将筛选出的opt-hIL28B高效表达2号菌株接种至含有10ml BMGY培养基的125ml三角瓶中，30℃，260rpm/min培养1天；

[0084] 2.将步骤1中的培养物分别接种至5个含有50mLBMGY培养基的1L三角瓶中，30℃，260rpm/min培养1天；

[0085] 3.第二天1500g×5min离心，弃上清，沉淀重悬于10mLBMMY培养基中，30℃，260rpm/min培养过夜；

[0086] 4.次日分别加入100％甲醇至终浓度(即甲醇占培养体系的体积百分比)为0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％，30℃，260rpm/min诱导，分别在诱导时间为36h、48h、
60h、72h时收取上清进行蛋白表达量检测和SDS-PAGE检测。

[0087] 结果如图3所示，在相同诱导时间下，2％与3％终浓度的甲醇诱导的目的蛋白表达量相对较高：在相同终浓度的甲醇诱导下，诱导时间为60h与72h时目的蛋白表达量相对较高。电泳为12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。具体表达量如下：

[0088] 表1、各种条件下的蛋白表达量(ug/ul)

[0089]36h 48h 60h 72h
0.5％ 0.078 0.086 0.090 0.083
1.0％ 0.089 0.113 0.138 0.135
2.0％ 0.095 0.146 0.152 0.141
3.0％ 0.133 0.167 0.178 0.163
4.0％ 0.105 0.142 0.148 0.139

[0090] (三)重组hIL28B蛋白的大量表达

[0091] 1.将筛选出的opt-hIL28B高效表达2号菌株接种至含有10ml BMGY培养基的125ml三角瓶中，30℃，260rpm/min培养1天；此步骤的培养目的是对2号菌株进行复苏、提高活性以便下一步的预培养。

[0092] 2.将上述步骤中的培养物接种至含有250mLBMGY培养基的1L三角瓶中，30℃，260rpm/min过夜培养至OD600＝5.0～6.0左右；此步骤的培养目的是将复苏后的2号菌株培养至对数生长期，以便下一步的诱导表达。

[0093] 3.1500g×5min离心，弃上清，沉淀重悬于50mL BMMY培养基中，30℃，260rpm/min培养过夜。此步骤是对培养至对数生长期的2号菌株进行诱导表达。

[0094] 4.次日加入甲醇至终浓度(即甲醇占培养体系的体积百分比)为3.0％，30℃，260rpm/min诱导60h后，收菌离心取上清(即为蛋白粗提液)备用，同时取部分上清进行蛋白表达量检测和SDS-PAGE检测。

[0095] 结果，蛋白的表达量为0.205ug/ul。

[0096] (四)重组hIL28B蛋白的纯化

[0097] 1.柱平衡：将阳离子交换柱SP-Agarose填料(购自美国GE公司)装填至层析柱中，用5倍柱体积灭菌纯化水平衡纯化，以除去残留的20％乙醇。再用buffer A(50mMHEPES，PH＝7.0)平衡SP柱；

[0098] 2.上样：以2ml/分钟的流速进样品，待样品完全进柱后，用5倍体积的平衡bufferA(50mM HEPES缓冲液，PH＝7.0)去除未结合蛋白；

[0099] 3.洗脱：洗涤5倍柱体积的溶液后，至280纳米吸光度回落基线。再分别换用含NaCl终浓度为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M的洗脱液(bufferB)洗脱5倍柱体积的溶液并收集洗脱液；

[0100] 洗脱液为向HEPES缓冲液中添加不同浓度的NaCl得到的；其中NaCl在洗脱液中的终浓度为0.1M、0.2M、0.3M、0.4M；HEPES缓冲液的浓度为50mM、PH＝7.0。

[0101] 将不同盐浓度洗脱收集液进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色鉴定，结果如图4所示，目的蛋白主要集中在0.3M洗脱液中，收取0.3M收集液，SDS-PAGE鉴定后，重组蛋白冻干保存。电泳为12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。

[0102] 三、蛋白的验证

[0103] 重组蛋白的质谱分析

[0104] 为鉴定制备的重组hIL28B蛋白的属性，将图4中目标蛋白条带切取下来，送西农生(北京)生物技术有限公司进行基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)，结果如图5所示，将所得的肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)运用MASCOT软件搜索比对最新的NCBI蛋白数据库以鉴定目的蛋白，发现肽段序列与hIL28B匹配，表明制备的重组蛋白的氨基酸序列正确。

[0105] 四、重组人hIL28B蛋白调节的细胞内信号通路分析

[0106] HepG2细胞购于中国医学科学院基础医学研究所。

[0107] INFs通过激活JAK-STAT通路发挥其抗病毒作用，能否上调磷酸化STATs的水平是判断IFNs有无活性的重要依据。本发明以HepG2细胞(购于中国医学科学院基础医学研究所)接种于6孔板长满单层后，分别加入0、10、100ng/ml纯化后的重组人IL-28B蛋白，同时以IFN-α2b(购于先灵葆雅公司)、以及R&D公司生产的IL-29、IL-28B处理组作为对照，37℃孵育60min。收细胞，每孔加入100μL 1×SDS loadingbuffer重悬，煮沸10min，12000rpm室温离心5min，取10ul上清经western Blotting检测磷酸化STAT1(Tyr701)的水平。磷酸化STAT1抗体购自美国R&D公司。检测方法为免疫印迹。

[0108] 使用纯化后不同浓度的重组hIL28B蛋白刺激HepG2细胞后，检测到了p-STAT1含量的变化，具体如图6。本发明制备的重组hIL28B蛋白的活性与R&D公司生产的IL-28B相似，优于R&D公司生产的IL-29。

[0109] 各种INFs通过激活JAK-STAT通路发挥其抗病毒作用，能否上调磷酸化STATs的水平是判断IFNs有无活性的重要依据。重组人IL-28B蛋白能够上调磷酸化STATs的水平是鉴定本发明获得的重组人IL-28B蛋白的生物学活性的一个指标。