一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法

摘要

本发明公开了一种使用人工染色体构建转基因斑马鱼的技术及其辅助质粒。本专利使用这一技术构建了蓝色荧光转换黄色荧光的心血管系统转基因系。步骤包括：1）特异性人工染色体获得及目的基因的构建2）人工染色体重组插入目的基因3）重组的人工染色体导入斑马鱼受精卵4）阳性转基因系筛选。本技术发明是一种具有国际领先水平的细菌人工染色体重组工程技术，极大的提高了转基因构建效率，将为我国生物医学基础研究和药物研究提供有力的工具。

权利要求

1.一种使用细菌人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在于通过如下步骤实现：A、flk BAC导入工程菌SW105，其中flk BAC为CH211-231B5；

B、采用目的片段5’引物 ：5’-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 和目的片段3’引物 ：5’-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCAGAGTAGTGAGGAG-3’ 扩增pPCRBloxYkanFrt中的荧光转换基因元件, pPCRBloxYkanFrt序列如SEQ ID No.1所示；

C、荧光转换基因元件电击导入含flk BAC的感受态细胞，并大量培养；

D、清除插入基因片段所带筛选抗性，获得清除插入基因片段所带筛选抗性的简洁的BAC片段；

E、引入Tol/ISceI 转座位点提高整合效率：含有Tol/ISceI 转座元件的质粒模板序列如SEQ ID No.2所示，使用特异性引物将Tol/ISceI转座元件扩增，向步骤D所得的已经引入荧光转换基因元件的flk BAC中引入该转座元件，其中Tol/ISceI 插入位点1引物:上 游 引 物 ：5‘-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’下 游 引 物 ：5‘-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’

Tol/ISceI 插入位点2引物:

上 游 引 物：5‘-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’下游引物：5‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3’； F、使用含有步骤E获得的BAC和转座酶的注射溶液对斑马鱼胚胎进行注射； G、潜在的成功转基因鱼筛选。

说明书

一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑

马鱼的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种细菌人工染色体的重组工程技术，及应用其构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。

背景技术

[0002] 心脏是人体的第一个发育的器官，是所有生命活动的能量供给动力中心。它通过大血管，微血管和血液构建的循环系统脉冲式的压迫血流将氧气和营养供给组织和器官，同时带走代谢产物。心血管疾病是死亡率最高的疾病，每年大约有30%的死亡与之有关。内皮细胞是心血管的最内层的细胞，具有多种合成和代谢功能，包括调节血栓及其溶解，血小板黏附，调控血管节律和血流，通过控制白细胞，单核细胞和淋巴细胞调节免疫和炎症反应。内皮细胞的损伤，会导致动脉粥样硬化和心肌梗死等多种致命心血管疾病。血管内皮生长因子(VEGF)受体flk广泛分布在整个心血管内皮系统，对于模式动物斑马鱼心血管系统flk 基因进行荧光标记，可以方便的观察研究心血管病理进程。Cre-LoxP 重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。基于Cre-loxP系统的荧光转换功能可以对相关基因在心血管的表达进行监控，揭示基因与疾病的关系。

[0003] 细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）是一种基于细菌质粒的系统，被广泛应用于基因组测序及图谱绘制，疾病基因的定点克隆，近来开始被用于转基因动物的建立。相对于其他克隆系统而言，BAC系统有着很强的可操作性及应用优势。BAC携带了完整的基因表达启动子及相应调控元件，对构建高精度转基因斑马鱼系及其他转基因动物有着极其重要的意义。BAC系统可以被看作一个较大的质粒，与所有分子遗传学的常规技术兼容。通过重组工程菌SW105进行BAC重组, 方便准确的修饰BAC。这种工程菌提供了Exo, Beta 和 Gam3种功能，Gam 保护导入的线性DNA免遭RecBCD 酶切，Exo 提供了5’到3’核酸外切活性，Beta与被外切后的单链DNA结合，提供保护。

[0004] 本发明融合了人工染色体重组，Cre-loxP 系统等多种技术，通过技术优化，提高了效率，构建了高精度的心血管系统荧光转换斑马鱼，为后基因组时代心血管疾病与基因功能研究及应用提供了有效工具。

发明内容

[0005] 发明目的

[0006] 本发明提供一种构建心血管系统带有蓝色荧光并可转换为黄色荧光的转基因斑马鱼模型的方法。

[0007] 技术方案

[0008] 一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现：

[0009] A、flk BAC导入工程菌SW105，其中flk BAC为CH211-231B5；

[0010] B、采用目的片段5’引物 ：5’-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 和

[0011] 目的片段3’引物 ：5’-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCAGAGTAGTGAGGAG-3’ 扩增pPCRBloxYkanFrt中的荧光转换基因元件；

[0012] C、荧光转换基因元件的电击导入含flk-BAC感受态细胞，并大量培养；

[0013] D、清除插入基因片段所带筛选抗性；

[0014] E、引入Tol/ISceI转座位点提高整合效率：其中Tol/ISceI插入位点1引物:

[0015] 上 游 引 物：5‘-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’

[0016] 下 游 引 物：5‘-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’

[0017] Tol/ISceI插入位点2引物:

[0018] 上 游 引 物：5‘-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’

[0019] 下 游 引 物：5‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3’；

[0020] F、斑马鱼胚胎的注射；

[0021] G、潜在的成功转基因鱼筛选。

[0022] 有益效果

[0023] 1）对于心血管系统广泛表达的血管内皮生长因子(VEGF)受体flk进行荧光标记。

[0024] 2）采用完整的flk 基因表达启动子及相应调控元件以调节荧光报告子表达，而非简单的部分短片段的质粒构建。

[0025] 3）主要技术细节包括flk BAC的前期处理，引物设计，感受态工程菌的准备，温度诱导重组，flk BAC的重组后鉴定及大量提取技术。

[0026] 4）无需分离启动子，相对于受限于启动子构建标记的转基因系的技术，很大程度上提高了转基因系构建的广泛性，为基础医学和应用科学研究提供了自由。

[0027] 5）本专利技术在应用BAC重组工程的同时，融合了近期出现的转座技术，使用Tol2 和IsceI 转座子，提高了人工染色体整合到斑马鱼基因组的效率，提高了构建的成功率。

[0028] 6）将重组后的flk BAC导入斑马鱼胚胎。包括显微注射方法，剂量步骤，优化的Fo交配筛选方案。

附图说明

[0029] 图1 血管系统标记基因flk BAC克隆: CH211-231B5 结构示意图；

[0030] 图2 插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒；

[0031] 图3 插入到BAC中的转座基因序列质粒，包括tol2 及IsceI 位点；

[0032] 图4 cre-lox原理示意图：未加cre的基因只表达蓝色荧光，不表达终止信号后片段。加入cre后可于lox位点处切割重组，基因因此表达黄色荧光；

[0033] 图5 细菌人工染色体重组原理示意图；

[0034] 图6 重组后BAC酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳；

[0035] 图7 构建好的转基因斑马鱼心血管系统呈蓝色荧光，在Cre mRNA的作用下转化为黄色荧光；

[0036] 图8插入到BAC中的蓝色变黄色荧光基因序列质粒，其电泳检测确定PCR结果的电泳图。

具体实施方式

[0037] 实施例1：培育心血管系统带荧光并可进行荧光颜色转换的斑马鱼转基因系。

[0038] 含flk BAC工程菌的准备

[0039] 1）flk BAC的来源

[0040] flk基因广泛分布于心血管系统，其BAC克隆为: CH211-231B5（图1），该信息可直接到zfin.org 查询。本发明中使用的 flk BAC购自CHORI-211文库（Children's Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA. http://bacpac.chori.org）， flk BAC的大小为156.559kb，序列详见GenBank： BX24796.6 。

[0041] 2）flk BAC导入工程菌SW105

[0042] a． 将 含flk BAC克 隆 的 菌 株（Children's Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA）在含12.5 μg/ml氯霉素抗性的LB培养基平o板划线，37C培养过夜。

[0043] b．挑取4个克隆，在含12.5 μg/ml 氯霉素抗性的5ml LB液态培养基37oC培养过夜。

[0044] c．进行BAC的小量提取，参见下述步骤5。

[0045] d．使用SpeI 37oC酶切过夜，在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳检测BAC大小是否正确。

[0046] e．将SW105菌株(SW105, 购自National Cancer Institute at Frederick, oUSA)在5ml 无抗生素的LB培养液中，30C振摇过夜。次日，1：100稀释于25ml培养液中，o
于30C振摇4-5小时，直到OD600值为0.6。

[0047] f．将菌液在冰中冷却2min, 5000g，0oC离心3min。

[0048] g．去上清，加入1ml冰水，在冰中重悬15min。然后加入9ml冰水，重悬。

[0049] h．5000g，0oC离心3min，去上清。重悬于1ml冰水。转移1mL重悬菌液至预冷的Eppendorf管中。台式小离心机 2min 4℃离心14000转，2min离心后，移除900μL上清，重悬沉淀于100μL。

[0050] i．将100μL菌液转入电转化皿中，设定参数为25 μF, 1.75 kV及 200 ohms. 电击后马上加入1mL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的eppendorf管中，32℃摇床培养1h。开始预热培养板。1h复壮之后，室温14000转离心1min。除去850μL上清，重悬于
150μL上清中。将所有150μL涂板。32℃过夜培养。细菌在这一温度下生长缓慢，所以等待较长时间才能看到克隆。

[0051] j．挑取4个克隆，在含12.5 μg/ml 氯霉素抗性的5ml LB液态培养基37oC培养o过夜。进行BAC的小量提取，参见下述步骤5。使用SpeI 37C酶切过夜，在0.7%的琼脂糖凝胶上电泳鉴定BAC是否正确。

[0052] k．将鉴定正确的菌株保存待用。加入330μL60%甘油到1mL菌液中，零下80℃冻存。

[0053] ．用于插入BAC的荧光转换基因元件的准备

[0054] 1）荧光报告基因质粒模板及引物设计

[0055] 荧光报告基因包含在质粒pPCRBloxYkanFrt(见Seq NO.1)中，使用以下引物将该目的片段扩增（质粒模板如图2）。该质粒含有cre-loxp 作用位点，工作原理如图4。

[0056] 目的片段5’引物 ：5’-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ (见Seq NO.3)

[0057] 目的片段3’引物 ：5’-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCAGAGTAGTGAGGAG-3’ (见Seq NO.4)

[0058] 2) 目基因片段的扩增与纯化

[0059] 设置PCR反应，使用Failsafe试剂盒（FailSafe™ PCR System ,购自Epicentre biotechnologies, USA）扩增长片段，模板量为1 ng DNA。电泳检测确定PCR结果正确后（如图8），使用QIAquick纯化，每柱低于400毫克琼脂糖，洗脱至40μL去离子水。每40μL洗脱样品加入2-3μl DpnI酶切60 min，去除模板。反应条件如下：

[0060] 160 μl PCR 产物

[0061] 20 μl 10x buffer 4

[0062] 10 μl H2O

[0063] 10 μl DpnI

[0064] 200 μl 总体积

[0065] 酶切后于1%琼脂糖凝胶电泳分离产物，使用Minelute纯化。PCR产物同样也使用Minelute柱进行纯化。200 μL样品，加入600 μl QG溶液及200μL异丙醇，混匀后上样。使用PE溶液清洗两次，第一次750 μL第二次250μL，至少5次30秒离心除去所有PE，每次更换新管；完全干燥后洗脱至12μL水中。获得荧光转换基因元件，测定其浓度，正常浓度不低于100 μg/mL。

[0066] 含flk-BAC感受态细胞的准备

[0067] 准备好培养平皿，抗性要正确，准备5mL过夜培养的flk BAC菌液（来自步骤1），培养温度32℃，加入氯霉素抗性和LB培养基。培养过夜，稀释2mL过夜培养的菌液致25mL，加入氯霉素。600纳米处测定OD值，大约为0.015至0.02。打开冷冻离心机，快速冷却模式。准备好42℃水浴摇床。准备好100mL灭菌水，2个电转化小缸，2个eppendorf管，2个15mL试管及冰。准备好培养平皿，抗性要正确。25mL培养液达到吸光值约 0.055-0.066时，转移12.5mL培养液到另一个锥形瓶。42℃水浴诱导15min，另外一瓶放入32℃作为未诱导组。 5min后，将两瓶迅速放置冰上，冷却大约10min。转移10 mL培养菌液置于预冷的14mL管中，零下4℃5000转离心3min。离心后移除上清。加入1mL冰冷的无菌水，在冰水中摇动重悬沉淀5至10min。零下4℃5000转离心3min。重复3次后，快速冰上重悬菌液。转移1mL重悬菌液至预冷的Eppendorf管中。台式小离心机 2min4℃离心14000转，
2min离心后，移除900μL上清，重悬沉淀于100μL，获得含有flk-BAC感受态细胞菌液。

[0068] ．荧光转换基因元件的电击导入

[0069] 将5μL荧光转换基因元件加入到重悬的flk-BAC细胞菌液中, 混匀两次。转移细胞-DNA混合物至预冷的小槽内，确认细胞位于金属板间。使用1.7 kV电传孔器。电击后马上加入1mL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的eppendorf管中，32℃摇床培养1h。开始预热培养板。1h复壮之后，室温14000转离心1min。除去850μL上清，重悬于150μL上清中。将所有150μL涂板。32℃过夜培养。细菌在这一温度下生长缓慢，所以等待较长时间才能看到克隆。对于成功的重组，可以看到有大于1000个克隆在诱导的板上，但是在未诱导的板上没有。从诱导板上挑6个克隆，接种于5mL的LB管中，加入相应抗生素，32℃摇菌过夜。获得菌液用于接下来的提取及鉴定。反应原理如图5所示；

[0070] 5．BAC的小量提取及鉴定

[0071] 从32℃摇过夜的5mL获得菌液中取4mL，4500转离心15min。去上清，加入250μLP1溶液(50 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A)，重悬菌液，转移至eppendorf管中。加入250μLP2(200 mM NaOH, 1% SDS)，室温静止5min。加入
250μLN1(1.6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol )，小离心机14000离心
5min，上清转移至新的eppendorf管中。重复离心，收集上清。加入750μL异丙醇，零下
20℃静置10min以上。最高速离心10min，去上清，70%乙醇清洗，干燥， 获得小量的BAC 。 重悬置40μL酶切反应液中，34μL水，4μL10x缓冲液，2μL酶。鉴定结果如图6所示。

[0072] 6．BAC大量提取

[0073] 将上述鉴定正确的菌株，32℃过夜培养。5500转离心20min。在50mLP1中加入200μL RNA酶溶液，重悬菌液。加入50mL P2溶液，翻转4-6次，室温静置5min。加入50mLP3溶液(3.0 M potassium acetate, pH 5.5)，翻转4-6次，用滤纸漏斗过滤。使用Qia的大提结合柱，结合DNA，60mL清洗液清洗。5次每次3mL65℃预热的洗脱溶液，进行洗脱回收。
加入10.5mL异丙醇，混匀后置于高压灭菌的corex玻璃离心管中。12,500转4℃高速离心
30min后，使用70%乙醇清洗。让沉淀物干燥，并观察。重悬沉淀到200-400μL水中。离心
1min，转移上清至1mL管中即可获得大量的BAC。加入330μL60%甘油到1mL菌液中，零下
80℃冻存。

[0074] 清除插入基因片段所带筛选抗性

[0075] 因为插入的荧光转换基因元件含Flp/Frt反应位点(如图2所示)，并且SW105菌株含有阿拉伯糖诱导的启动子控制Flp 表达。

[0076] 对于步骤5鉴定好的克隆，培养单克隆于5mL LB培养基中，32℃过夜。第二天取1mL该SW105菌株稀释至10mL溶液。32℃2-3h振动培养至600纳米吸光度为0.5。加入
100μL10%左旋L(+)阿拉伯糖（Sigma A-3256），使诱导Flp1个小时。然后涂到板上鉴定，-4 -6
10 到10 稀释。平板分含有氯霉素及卡那霉素抗性。正确的敲除应该在氯霉素平板看到克隆，卡那霉素没有克隆。挑菌落小提鉴定，获得清除插入基因片段所带筛选抗性的简洁的BAC片段。

[0077] 引入Tol/ISceI 转座位点提高整合效率

[0078] 1）含有Tol/ISceI 序列(见Seq NO.2)的质粒模板如图3所示，使用特异性引物将Tol/ISceI 转座元件扩增。

[0079] 2）引物设计:

[0080] Tol/ISceI 插入位点1引物:

[0081] 上 游 引 物：5‘-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’ (见Seq NO.5)

[0082] 下 游 引 物：5‘-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’ (见Seq NO.6)

[0083] Tol/ISceI插入位点2引物:

[0084] 上 游 引 物：5‘-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’ (见Seq NO.7)

[0085] 下 游 引 物：5‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3’ (见Seq NO.8)

[0086] 3）设置PCR反应，使用Failsafe试剂盒扩增长片段，模板量为1 ng DNA。电泳检测确定PCR结果正确后，使用QIAquick纯化。

[0087] 4）将5μL Tol/ISceI 元件PCR产物加入到步骤7所得的flk-BAC细胞菌液中, 混匀两次。转移细胞-DNA混合物至预冷的小槽内，确认细胞位于金属板间。使用1.7 kV电传孔器。电击后马上加入1mL室温SOC至小槽内。转移菌液至新的eppendorf管中，32℃摇床培养1h。开始预热培养板。1h复壮之后，室温14000转离心1min。除去850μL上清，重悬于150μL上清中。将所有150μL涂板。32℃过夜培养。挑6个克隆，接种于5mL的LB管中，加入相应抗生素，32℃摇菌过夜。获得菌液进行BAC提取及鉴定。引入转座位点提高整合效率的意义在于大幅提高基因重组的成功率，缩短构建周期。

[0088] 斑马鱼胚胎的注射

[0089] 将野生型AB斑马鱼配置于小交配缸中，中间插有隔板过夜，次日早晨取出隔板，小鱼开始交配产卵。收集鱼卵，使用E3溶液清洗。去除未受精的鱼卵。尽快将鱼卵在注射盘中排列好，设置好注射器。注射溶液配方为：（10μL）终浓度80纳克/微升引入转座子的BAC，1xDanio 缓冲液，1x酚红溶液，1微升转座酶，相应量的水。注射1纳升至一细胞期的胚胎细胞中。将注射好的胚胎放于28.5℃孵箱中，48h后观察荧光。将表达正确的马赛克鱼挑出，第五天时转入小鱼保姆区养大。

[0090] 潜在的成功转基因鱼筛选

[0091] 当斑马鱼长至2.5-3个月后，开始筛选。首先使用群内交配，标记好胚胎与对应的亲代鱼。亲代的鱼最好单独养到每个缸里，做好标记。每对鱼看过100个胚胎，如果都呈阴性，可说明亲代阴性。使用表格做好记录，不断排除阴性鱼。通常BAC有1-2%的几率找到一条转基因鱼。插入Tol/ISceI 转座子的BAC这一几率有较大提高约8%，而且具有较强的启动子表达，见图6，图7。