一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的方法

摘要

一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)的方法，属于发酵技术领域。本发明包括如下步骤：(1)种子液培养；(2)发酵培养。通过采用两阶段氯化钠添加策略和氨基酸组合添加策略相结合的方法，使HEMF的发酵生产率获得大幅度提高。本发明方法可替代化工合成方法生产HEMF，产品香气纯正、浓厚。本发明发酵方法使HEMF的生产成本低，效率高，而且可有效减轻对环境的污染；并且采用本发明的发酵方法能够提高产量及质量，在工业化生产中具有应用价值。

权利要求

1.一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮，简称为HEMF，的方法，其特征在于包括如下步骤： （1）种子培养：取活化后的斜面菌体KS18增香型耐高盐酵母菌，挑取一满环接入50 mL种子培养基中，接种后于25-37℃，100-250 rpm下进行发酵培养20-35 h；

所述斜面及种子培养基的组成成分g/L计：葡萄糖 20-25g/L，蛋白胨 10-15g/L，酵母粉 5-10g/L，NaCl 120-240g/L，以自来水定容，pH 5.0-6.0；

（2）发酵培养：将培养好的种子培养液，按照5%-15%的接种量接入发酵培养基中，接种后于25-37℃，100-250 rpm下培养140-200 h获得HEMF；

所述的发酵培养过程中采用两阶段氯化钠添加策略和氨基酸组合添加策略相结合的方法；初始氯化钠浓度为120-200 g/L，在发酵30-60 h时添加氯化钠至200-240 g/L浓度，并且在发酵过程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合添加，含量为1-10 g/L；

所述的发酵培养基的组成成分g/L计：己糖70-100g/L，戊糖25-50g/L，氮源1-10g/L，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合 1-10g/L，KH2PO4 10-15g/L，MgSO4·7H2O 5-10g/L，NaCl

120-240g/L，以自来水定容，pH 5.2-5.4；

所述己糖选用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、山梨醇中的一种或几种；

所述戊糖选用木糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、木酮糖中的一种或几种；

氮源选用花生饼粉、蛋白胨、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种。

说明书

一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲

基-3(2H)-呋喃酮的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及到一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的方法，属于发酵技术领域。

背景技术

[0002] 2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮，简称HEMF。自然界主要存在于酱油中，故称其为酱油酮，具有高强度的甜焦糖香，酱香特色。是有机化合物杂环香体类呋喃同系衍生物中极其重要而且用途极为广泛的香料之一。

[0003] HEMF是上世纪七十年代日本化学家从发酵酿造成的浓口型酱油中分离出，并确认为酱油中的主体香。HEMF即酱油中致香的特有成份，此后，许多国家以不同方法合成。在研究HEMF特性中，发现它不仅是人感官易于接受的良好香料，而且是制作香料中有价值的组成部分。它添加在酿造食品如调味料、酒、无酒精饮料及果制品如：果酱、果浆、罐头等食品中，将具有改进或加强其天然香味作用，并能提高或代替天然香料。同时，HEMF是美国食用制造者协会(FEMA)认可的安全食用香料。最近日本学者研究发现酱油酮还具有抗肿瘤活性。

[0004] 目前市场上销售的HEMF基本都是化学合成的，少量的是以天然材料为原料合成的天然等同的HEMF。天然HEMF由于价格昂贵，只用于有特殊要求的食品中。天然HEMF与化学合成的HEMF相比，香气纯正、浓厚，具有不可替代性，在市场销售份额中将不断增加。因此，利用微生物发酵法生产天然HEMF，具有广阔的前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种用发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮的方法，代替现行使用的化工合成方法生产HEMF。且该方法生产成本低，效率高，产品香气纯正、浓厚，具有不可替代性。

[0006] 本发明的技术方案：一种发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮，简称为HEMF，的方法，该HEMF由下述发酵方法生产：

[0007] （1）种子培养：取活化后的斜面菌体KS18增香型耐高盐酵母菌，挑取一满环接入50 mL种子培养基中，接种后于25-37℃，100-250 rpm下进行发酵培养20-35 h；

[0008] 所述KS18增香型耐高盐酵母菌已在[食品与发酵工业 2010年第36卷第3期31-35]公开。

[0009] 所述斜面及种子培养基的组成成分g/L计：葡萄糖 20-25，蛋白胨 10-15，酵母粉5-10，NaCl 120-240，以自来水定容，pH 5.0-6.0；

[0010] （2）发酵培养：将培养好的种子培养液，按照5%-15%的接种量接入发酵培养基中，接种后于25-37℃，100-250 rpm下培养140-200 h获得HEMF；

[0011] 所述的发酵培养过程中采用两阶段氯化钠添加策略和氨基酸组合添加策略相结合的方法；初始氯化钠浓度为120-200 g/L，在发酵30-60 h时添加氯化钠至200-240 g/L浓度，并且在发酵过程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合添加，含量为1-10 g/L。

[0012] 所述的发酵培养基的组成成分g/L计：己糖70-100，戊糖25-50，氮源1-10，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合 1-10，KH2PO4 10-15，MgSO4·7H2O 5-10，NaCl 120-240，以自来水定容，pH 5.2-5.4；

[0013] 所述己糖选用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、山梨醇中的一种或几种；

[0014] 所述戊糖选用木糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、木糖、核酮糖、木酮糖中的一种或几种；

[0015] 氮源选用花生饼粉、蛋白胨、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母膏中的一种或几种。

[0016] 本发明的有益效果：本发明方法可替代化工合成方法生产HEMF，这样不仅生产成本低，效率高，而且可有效减轻对环境的污染。并且采用本发明的发酵方法在一定程度上提高产量及质量，通过本方法，使得HEMF的产量达到120-130 mg/L。

附图说明

[0017] 图1发酵法生产HEMF的工艺流程图。

具体实施方式

[0018] 实施例1

[0019] 发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮，步骤为：

[0020] (1) 取活化后的斜面菌体(KS18增香型耐高盐酵母菌)，挑取一满环接入50 ml种子培养基中，接种后于30℃，150 rpm下进行发酵培养30 h；

[0021] (2) 将培养好的种子培养液，按照10%的接种量接入发酵培养基中，接种后于30℃，150 rpm下培养140 h获得HEMF。

[0022] 步骤(1)中所述的菌种名称为KS18增香型耐高盐酵母菌，属耐180-240 g/L氯化钠浓度的增香酵母菌。

[0023] 步骤(1)中所述的斜面培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 200，琼脂粉 12，pH 5.8-6.0。

[0024] 步骤(1)中所述的种子培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 200，pH 5.8-6.0。

[0025] 步骤(2)中所述的发酵培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 75，木糖25，酵母膏 1，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合 5，KH2PO4 10，MgSO4·7H2O 5，NaCl 200，pH 5.2。

[0026] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用两阶段氯化钠添加策略和氨基酸组合添加策略相结合的方法为：初始氯化钠浓度为200 g/L，在发酵40 h时添加氯化钠至220 g/L浓度，并且在发酵过程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合含量为5 g/L。

[0027] 测定HEMF含量：发酵液在10000 rpm下离心10 min后弃去上清液，用2%过氧化氢脱色过滤后，用高效液相色谱法(HPLC)测定含量为122.1 mg/L。

[0028] 实施例2

[0029] 发酵法生产2(5)-乙基-4-羟基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮，步骤为：

[0030] (1) 取活化后的斜面菌体(KS18增香型耐高盐酵母菌)，挑取一满环接入50 mL种子培养基中，接种后于30℃，150 rpm下进行发酵培养30 h；

[0031] (2) 将培养好的种子培养液，按照10%的接种量接入发酵培养基中，接种后于30℃，150 rpm下培养160 h获得HEMF。

[0032] 步骤(1)中所述的菌种名称为为KS18增香型耐高盐酵母菌，属耐180-240 g/L氯化钠浓度的增香酵母菌。

[0033] 步骤(1)中所述的斜面培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 200，琼脂粉 12，pH 5.8-6.0。

[0034] 步骤(1)中所述的种子培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 200，pH 5.8-6.0。

[0035] 步骤(2)中所述的发酵培养基的组成成分(g/L)：葡萄糖 70，核糖30，蛋白胨 5，甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合 5，KH2PO4 10，MgSO4·7H2O 5，NaCl 200，pH 5.4。

[0036] 步骤(2)中所述的发酵过程中采用两阶段氯化钠添加策略和氨基酸组合添加策略相结合的方法为：初始氯化钠浓度为200 g/L，在发酵40 h时添加氯化钠至220 g/L浓度，并且在发酵过程中使用甘氨酸、丙氨酸和精氨酸组合含量为5 g/L。

[0037] 测定HEMF含量：利用高效液相色谱法测定HEMF含量，方法同实施例1，测得HEMF含量为126 mg/L。