一种筛选/检测乳杆菌的方法和试剂盒

摘要

一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因，还涉及一种快速筛选/检测乳杆菌的方法。本发明提供的试剂盒可从含有大量微生物的待检样本中快速筛选出乳杆菌，便于进一步筛选鉴定未知乳杆菌。节约时间，节省成本，有较强的应用价值。

权利要求

1.一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，其特征在于：包含序列如SEQ ID NO：1~2所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因。

2.一种快速筛选/检测乳杆菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：a，分离单菌落：从待检样本中分离得到菌株单菌落；

b，基因扩增：以步骤a所得菌体基因组DNA为模板，用权利要求1所述试剂盒进行基因扩增；

c，结果检测：对扩增结果进行检测。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤a采用在MRS培养基上划线分离得到菌株单菌落。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤b基因扩增方法为菌落PCR扩增方法。

5、核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对1的用途，其特征在于：其用于扩增或检测来自乳杆菌的基因。

说明书

一种筛选/检测乳杆菌的方法和试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种细菌的检测技术，特别涉及一种乳杆菌的检测技术。

背景技术

[0002] 乳杆菌属(Lactobacillus)是一类公认安全(Generally regarded-as-safe，GRAS)的微生物，具有改善肠道环境，增强宿主免疫力等功能，是对人体有益的益生菌(Probiotics)。目前，乳杆菌不仅在食品和饲料工业上被广泛的应用，而且通过基因工程，正在被开发为疫苗投送载体、微生态纠正剂、全酶制剂等，是当前的研究热点之一。在四川泡菜、奶酪、腊肠、青贮饲料、韩国泡菜等传统发酵食品中都存在大量的乳杆菌，四川泡菜与韩国泡菜、日本泡菜齐名，是世界公认的健康发酵蔬菜制品。为了改善泡菜风味，收集微生物资源，从四川泡菜中已经分离到了植物乳杆菌(L.plantarum)、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)等乳杆菌。四川泡菜种类繁多，品牌林立，还有较多乳杆菌有待分离和鉴定。

[0003] 然而，传统的分离鉴定方法需对细胞形态、大小、排列、运动性、菌落形态等形态特征，营养要求、酶、代谢产物、对药物的敏感性等生理生化特征鉴定等指标进行检测，不仅工作量十分浩大，且对技术熟练度要求较高，难以快速筛选出乳杆菌。通过测定16s rDNA/RNA序列的方式鉴定乳杆菌的方法虽然较为快速，但是对待检样本中任一菌类均进行DNA测序以判定其是否为乳杆菌，耗费的成本太高，不具有实际应用价值。

[0004] Dubernet S.等人设计一对引物，扩增16S rDNA序列3′端到23S rDNA序列之间的区域，根据电泳是否出现250bp条带，可确定23种菌是否是乳杆菌，但是该文献中引物特异性太强，仅能用于检出该文献记载的23种乳杆菌，不能检测出其他乳杆菌以及乳杆菌新种。

[0005] 亟需一种快速的初步筛选乳杆菌的方法，将所有乳杆菌从待检样本含有的大量微生物中筛选出来，以便进一步研究。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的筛选/检测试剂盒和方法。

[0007] 首先，本发明提供了一种快速筛选/检测乳杆菌的试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对1，扩增来自乳杆菌的基因。

[0008] 还提供了一种快速筛选/检测乳杆菌的方法，它包括如下步骤：

[0009] a，分离单菌落：从待检样本中分离得到菌株单菌落；

[0010] b，基因扩增：以步骤a所得菌体基因组DNA为模板，用前述试剂盒进行基因扩增；

[0011] c，结果检测：对扩增结果进行检测。

[0012] 本发明用菌落PCR技术检测待测菌株是否为乳杆菌，操作简单、效率高。

[0013] 其中，所述步骤a采用在MRS培养基上划线分离得到单菌落；

[0014] 其中，所述步骤b基因扩增方法为菌落PCR扩增方法。菌落PCR方法将样品处理跳过DNA抽提这一步骤，直接以菌体热、冻解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，不仅节约时间，增加设备利用率，也降低实验成本。

[0015] 最后，还提供了SEQ ID NO：1～2所示的寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自乳杆菌的基因。

[0016] 用本发明提供的试剂盒可从含有大量微生物的待检样本中快速筛选出所有乳杆菌，便于进一步筛选鉴定未知乳杆菌，节约时间，节省成本，有较强的应用价值。

附图说明

[0017] 图1乳杆菌16S rDNA保守区与近缘细菌相应序列的比对图

[0018] 图2引物特异性实验结果

[0019] 图3泡菜中乳杆菌的PCR扩增检出结果

具体实施方式

[0020] 实验材料

[0021] 从四川省的成都市、自贡市、德阳市、乐山市、眉山地区和资阳地区的居民家中收集自制的泡菜样品共16份。

[0022] 短乳杆菌(L.brevis ATCC 367)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus ATCC 4356)购自中科院微生物研究所菌种保藏库。植物乳杆菌(L.plantarum CICC 6002)、瑞士乳杆菌(L.helveticus CICC 22826)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus CICC 6064)购自中国工业微生物菌种保藏中心。干酪乳杆菌(L.casei ATCC393)购自美国菌种保藏中心(ATCC)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactics MG 1363)由重庆医科大学张德纯教授赠送。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

[0023] 乳杆菌菌株均用MRS培养基(MRS培养基配方为：葡萄糖20g，酪蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，吐温801g，七水硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，加ddH2O至1L)。在37℃培养24h，其它菌株使用肉汤培养基在37℃培养18h。PCR试剂盒(Ex Taq)购自大连宝生物公司(TaKaRa)，胶回收试剂盒购自Omega公司(Bio-Tek USA)。

[0024] 实施例1引物设计

[0025] 如表1所示，根据NCBI的Genome数据库中14种乳杆菌基因组序列，寻找乳杆菌保守序列，将该保守序列与乳杆菌同属乳杆菌科的片球菌(Pediococcus)，与乳杆菌同属乳杆菌目的肠球菌(Enterococcus)、乳球菌(Lactococcus)和明串珠菌(Leuconostoc)，以及与乳杆菌同属芽胞杆菌纲的芽胞杆菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)相应序列比对，设计乳杆菌特异性引物。

[0026] 表1已测序的14种乳杆菌和5种近缘菌种列表

[0027]

[0028] 为了达到从含有大量微生物的待检样本中快速筛选出所有乳杆菌的目的，本发明需设计一对引物，且该引物应满足两个条件：1、该引物可以特意扩增所有乳杆菌的基因片段，包括未知乳杆菌；2、该引物不会扩增其他菌的基因片段。其中，为了初筛得到所有的乳杆菌，第一个条件尤为重要。为了满足这两个条件，根据图1所示的序列比对结果，本发明设计一对引物，其中，

[0029] 上游引物：5′-GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAA-3′(29bp)(如SEQ ID NO：1所示)，其在植物乳杆菌基因组中位置：711～740；

[0030] 下游引物：5′-GTGATCCAGCCGCAGGTTCTCC-3′(22bp)(如SEQ ID NO：2所示)，其在植物乳杆菌基因组中位置：1540～1562。

[0031] 设计的引物由大连宝生物公司合成。

[0032] 实施例2引物特异性实验

[0033] 对嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌、明串珠菌、乳酸乳球菌、枯草芽胞杆菌和表皮葡萄球菌按如下步骤进行PCR扩增检测：

[0034] 1、引物

[0035] 使用实施例1制备的引物。

[0036] 2、模板制备

[0037] 分别从嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌、明串珠菌、乳酸乳球菌、枯草芽胞杆菌和表皮葡萄球菌的单菌落上挑取微量菌体到PCR管中，将PCR管放入微波炉，100％火力下加热3min，然后加入PCR体系。

[0038] 3、PCR扩增

[0039] 以步骤2热处理的菌体作为模板，取步骤1的引物按照下列程序分别扩增：

[0040] 25μL反应体系：模板： 微量热处理菌体

[0041] 引物： 设计的两条引物各0.5微升

[0042] 10×的PCR buffer：2.5微升

[0043] 氯化镁： 2微升

[0044] dNTP： 2微升

[0045] exTaq酶： 0.25微升

[0046] ddH2O： 17.25微升

[0047] 反应程序：94℃5min；95℃40s，57℃30s，72℃100s，30个循环；72℃10min。

[0048] 电泳检测方法：取5μL反应液进行琼脂糖凝胶(0.7％W/V)电泳。

[0049] 4、实验结果

[0050] 实验结果见图2，由图2可知，6种乳杆菌以及与乳杆菌亲缘关系很近的明串珠菌都扩增出了852bp条带。而表皮葡萄球菌、乳酸乳球菌和枯草芽胞杆菌均没有扩增条带。

[0051] 本发明设计的引物理论上可用于扩增乳杆菌保守片段，而本实施例用6个代表菌种验证了该引物确实可以扩增乳杆菌的保守片段，又因明串株菌与乳杆菌的亲缘性较近，16S rDNA序列与乳杆菌高度相似，该引物也能扩增明串株菌的基因片段，进一步验证了本发明引物可以扩增所有乳杆菌的基因片段。同时，明串珠菌为革兰阳性球菌，仅需通过菌体形态观察即可将其与乳杆菌区别开。

[0052] 实验证明本发明提供的引物基本上满足实施例1所述条件1(该引物可以特意扩增所有乳杆菌的基因片段，包括未知乳杆菌)，基本可以满足条件2(该引物不会扩增其他菌的基因片段)，说明本发明设计的引物可用于乳杆菌的快速筛选/检测。

[0053] 实施例3本发明试剂盒的组成及其使用方法

[0054] 1、试剂盒的组成

[0055] 25μL体系：

[0056] 实施例1提供的引物：各0.5微升

[0057] 10×的PCR buffer：2.5微升

[0058] 氯化镁： 2微升

[0059] dNTP： 2微升

[0060] exTaq酶： 0.25微升

[0061] ddH2O： 17.25微升

[0062] 2、试剂盒的使用方法

[0063] 1)、分离单菌落：从待检样本中分离得到菌株单菌落；

[0064] 2)、基因扩增：

[0065] 以步骤1)所得菌体基因组DNA为模板，用试剂盒进行基因扩增，其反应程序：94℃5min；95℃40s，57℃30s，72℃100s，30个循环；72℃10min。

[0066] 3)、结果检测：

[0067] 取5μL反应液进行琼脂糖凝胶(0.7％W/V)电泳，检测PCR扩增结果。

[0068] 实施例4用本发明试剂盒筛选/检测待检样本中的乳杆菌

[0069] 1、检测实验

[0070] 用实施例3提供的试剂盒检测16份泡菜中的乳杆菌。

[0071] 1)、分离单菌落：通过在MRS培养基上的划线分离，从16份泡菜样品中得到了29株菌株(注：来自同一样品，并且形态和染色相同的菌株，被认为是相同的菌株)，革兰氏染色鉴定19株革兰阳性杆菌，6株革兰阳性球菌，4株革兰阴性杆菌。菌株1-14、25-29：革兰阳性杆菌菌株；菌株15-18：革兰阴性杆菌菌株；菌株19-24：革兰阳性球菌菌株。

[0072] 2)、基因扩增：

[0073] 以步骤1)所得菌体基因组DNA为模板，用试剂盒进行基因扩增，其反应程序：94℃5min；95℃40s，57℃30s，72℃100s，30个循环；72℃10min。

[0074] 3)、结果检测：

[0075] 取5μL反应液进行琼脂糖凝胶(0.7％W/V)电泳，检测PCR扩增结果。

[0076] 2、验证试验

[0077] (1)16s rDNA检测

[0078] 使用胶回收技术纯化扩增出的852bp条带，然后送大连宝生物公司测序，利用NCBI网站的BLASTn工具与GenBank已经公开的乳杆菌相应序列进行比对。

[0079] (2)生理生化特性作进一步验证

[0080] 将革兰阳性杆菌菌株分别依照传统细菌鉴定方法以德式乳杆菌为标准，进行下列生化试验检测：葡萄糖发酵试验、氧化氢酶试验、明胶液化试验、硫化氢产生试验和吲哚产生试验。

[0081] 3、实验结果

[0082] (1)扩增结果

[0083] 实验结果如图3所示：

[0084] 菌株1、3、4、6、7、8、9、12、13、14、21、24、25、26、27、28和29扩增出了852bp条带，其中菌株21和24为革兰阳性球菌，其余15株都为革兰阳性杆菌；

[0085] 菌株2、5、10、11、15-20、22-23均无扩增出条带。

[0086] 扩增结果显示菌株1、3、4、6、7、8、9、12、13、14、25、26、27、28和29是乳杆菌，而菌株2、5、10、11、15-24不是乳杆菌。

[0087] 其中，菌株15-20为革兰阴性杆菌菌株，22-23为革兰阳性球菌，而乳杆菌为革兰阳性杆菌菌株，可以确定菌株15-20、22-23不是乳杆菌，无需进一步验证。

[0088] (2)验证结果

[0089] 测序比对结果如下：

[0090] 菌株1、3、4、6、7、8、12、13、14、25、26和28这12株革兰阳性杆菌菌株的852bp片段是相同的，并与多株植物乳杆菌(L.plantarum strain WCFS1、H2、FJAT-CF7、LCR21、ST-III等)的16S rDNA序列均100％相似，鉴定为植物乳杆菌；

[0091] 革兰阳性杆菌菌株27和29的852bp片段和鉴定为植物乳杆菌的前述12株菌株的852bp片段仅有一个碱基的区别，比对结果显示和植物乳杆菌最相似(相似度为99％)，也鉴定为植物乳杆菌；

[0092] 革兰阳性杆菌菌株9的852bp片段和GenBank数据库中所有序列都不相同，和鼠乳杆菌(L.murinus strain Lb、P6和LbP)、姬鼠乳杆菌(L.apodemi)、动物乳杆菌(L.animalis)相似性均为99％，仅有8个碱基不同，与全基因组测序的唾液乳杆菌(L.salivarius UCC118)的相似性为97％，有28个碱基不同，菌株9可以确定为乳杆菌；

[0093] 革兰阳性球菌菌株21和24的16S rDNA序列的852bp片段与类肠膜明串珠菌(Leuconostoc paramesenteroides strain 1216)的相应16S rDNA片段100％相似，将革兰阳性球菌菌株21和24鉴定为类肠膜明串珠菌。

[0094] 生化鉴定结果显示：

[0095] 菌株1-14、25-29的其生化特性均与德式乳杆菌一致，即：发酵葡萄糖产酸，不液化明胶，不产生氧化氢酶、硫化氢和吲哚，符合乳杆菌属的特征，鉴定菌株1-14、25-29均为乳杆菌；

[0096] 菌株2、5、10和11生化鉴定特征为：发酵葡萄糖产酸，液化明胶，产生氧化氢酶和硫化氢、不产生吲哚，不同于乳杆菌的生化特征，与芽胞杆菌属生化特征相同，鉴定菌株2、5、10和11不是乳杆菌。

[0097] 验证结果显示菌株1、3、4、6、7、8、9、12、13、14、25、26、27、28和29是乳杆菌，而菌株2、5、10、11、15-24不是乳杆菌，该结果与本发明试剂盒检测结果一致。说明本发明提供的试剂盒是有效的，可用于快速、准确地检出待检样本中的乳杆菌。

[0098] 综上，实验证明SEQ ID NO：1～2引物可以特意地扩增乳杆菌的基因组，本发明提供的试剂盒能有效地将乳杆菌从含有大量菌类的待检样品检出，说明本发明提供试剂盒可以用于快速、有效的筛选出乳杆菌，便于乳杆菌进一步研究与应用，具有较强的应用价值。