凡纳滨对虾精荚低温保存方法

摘要

本发明公开了一种凡纳滨对虾精荚低温保存的方法，包括精荚采集、精荚固定、精荚保存和精子染色过程，采用浓度为1.8～3.0％的自制I型液态鼠尾胶原0.3～0.4份为培养层收缩的介质，与2×1640培养液0.3～0.4份，美国GIBCO公司的胎牛血清0.1～0.2份，美国Sigma公司的Matrigel(一种可溶性基底膜基质)0.1份，配制得到凡纳滨对虾精荚培养层。该培养层具有在常温条件下呈粘稠状，而在4℃条件下会凝固的特性，能包裹精荚。在常温条件下将精荚分装于EP管，采用配制的培养层包裹精荚，将包裹精荚EP管置于冰箱中，在4℃的低温下保存。本发明具有操作简单、精荚结构保存完整、精子存活率高、保存时间长、低温保存效果稳定等特点，易于推广应用。精荚的保存时间至少为3个月，精子成活率达到80％以上。

权利要求

1.一种凡纳滨对虾精荚低温保存的方法，包括精荚采集、精荚固定、精荚保存和精子染色过程，其特征在于：在常温条件下将精荚分装于EP管，采用配制的培养层包裹精荚，将包裹精荚EP管置于冰箱中，在4℃的低温下保存，具体操作过程为：(1)精荚采集：在无菌细胞间内的超净工作台上左手握住对虾尾部，右手握住头部，然后用右手食指隔开最后一对步足，左手拇指挤压精荚，将采集的精荚先放入EP管中；

(2)精荚固定：常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上将每个精荚分装于EP管中，快速加入配制培养层包裹精荚，然后用封口膜封口；

(3)精荚保存：将(2)步包裹精荚的EP管放置于细胞培养室内的4℃保鲜箱中；

(4)精子染色：轻轻挤出精液并按1:10稀释，取0.9mL的精子悬浊液移入试管中，加入

0.1mL的0.4%的台盼蓝溶液，混匀，3分钟后将其滴入血细胞计数板中，在显微镜下观察着色的精子个数和精子总数，计算精子存活率；

所述的培养层具有固定和提供精荚所需的营养物质，其配方成分、体积份数及配制方法为：0.3～0.4份浓度为1.8～3.0%的自制I型液态鼠尾胶原与0.3～0.4份浓度为

20.8g/L的2×1640培养液，0.1～0.2份美国GIBCO公司的胎牛血清，0.1份美国Sigma公司的Matrigel装于放在冰盒的EP管中，充分混匀，加入0.1%的NaOH溶液，调节pH值

7.2～7.4，备用；

所述的培养液采用美国GIBCO公司的1640培养基1袋，充分溶解于500ml过滤除菌的盐度为30‰的海水中，配制成浓度为20.8g/L的2×1640培养液，并加入2.38gHEPES缓冲剂于溶液中至其终浓度为10mmol/L，加入用无菌的1mol/LNaOH调节pH至6.8～7.4之间，加入青霉素和链霉素调节其终浓度为100万单位，再经过0.22μm的滤器过滤分装成50mL/瓶，备用；

所述的自制I型液态鼠尾胶原是将大鼠鼠尾，置于75%的酒精中浸泡30min，于无菌条件下撕下大鼠尾皮，将尾巴切成几段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0.1%的醋酸中，置于4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌，48h后以3000r/min的速度离心收集上清既得胶原溶液，计算所制备的胶原溶液的浓度。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述的精荚保存，每1周取出1个精荚用台盼蓝染色观察其成活率，放入培养层的体积数随着精荚的大小进行调节，确保3个月以上所保存的精子成活。

说明书

凡纳滨对虾精荚低温保存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种动物精子低温保存的方法，特别是一种凡纳滨对虾精荚低温保存方法。

背景技术

[0002] 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又名南美白对虾，是世界规模化养殖对虾品种之一，为我国产量最高的对虾。虽然在养殖业上越来越重要，但其精子保存技术依然很少，大大限制了选择育种的可行性。目前，哺乳动物及鱼类的精子冷冻保存的方法多采用液氮超低温冷冻法，精子冷冻保存技术存在着冻精活率不够高、受精率不高、冻精保存量小，达不到实用化水平等诸多问题，而且由于对虾的精子和其他动物的精子不同，对虾的精子团被提供其营养物质的精荚包裹。由于精荚的存在，液氮低温保存时精荚会形成冰晶，造成精子的死亡。在国外，Chow等(1985)在自来水和10％甘油混合物中平衡罗氏沼虾15-30min，然后将精荚转移到1mL的玻璃试管冻存在液氮中。该方法只是证实了通过甘油平衡作用能够对精荚起到部分的保护作用，但是不能阻止精荚形成冰晶过程。Dumont等-1
(1992)发现以二甲基亚砜(DMSO)为抗冻保护剂，在液氮中以1.6℃min 的速度冷冻南-1 -1
美白对虾精子比0.3℃min 和1.8℃min 有更好的效果。柯亚夫等(1996)用含有10％DMSO和5～10％甘油的稀释液冷冻中国对虾精子，发现中国对虾精子在0-4℃平衡20～
30min能够避免对虾精子发生顶体反应。该方法虽然保存了精子，但是在处理精荚过程中对精子活力造成了一定的影响，而且去掉精荚的精子在复苏后很难进行受精过程，成活率仅达60％。因此该方法不能完全满足利用保存的精子进行后续研究工作的条件。

发明内容

[0003] 本发明的目的是：为凡纳滨对虾种质保存、遗传多样性保护、遗传育种和生产提供一种操作简单、精荚结构保存完整、精子存活率高、保存时间长、实用化的凡纳滨对虾精荚低温保存方法。

[0004] 本发明是按以下技术方案实现的：

[0005] 凡纳滨对虾精荚低温保存的方法，包括精荚采集、精荚固定、精荚保存和精子染色过程，方法是：在常温条件下将精荚分装于EP管，采用配制的培养层包裹精荚，将包裹精荚EP管置于冰箱中，在4℃的低温下保存，具体操作过程为：

[0006] (1)精荚采集：在无菌细胞间内的超净工作台上左手握住对虾尾部，右手握住头部，然后用右手食指隔开最后一对步足，左手拇指挤压精荚，将采集的精荚先放入EP管中。

[0007] (2)精荚固定：常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上将每个精荚分装于进口EP管中，快速加入配制培养层包裹精荚，然后用封口膜封口。

[0008] (3)精荚保存：将(2)步包裹精荚的EP管放置于细胞培养室内的4℃保鲜箱中。

[0009] (4)精子染色及计算成活率：轻轻挤出精液并按1∶10稀释，取0.9mL的精子悬浊液移入试管中，加入0.1mL的0.4％的台盼蓝溶液，混匀，3分钟后将其滴入血细胞计数板中，在显微镜下观察着色的精子个数和精子总数。精子存活率＝(精子总数-蓝色精子数)/精子总数×100％。

[0010] 以上所述的精荚保存，每1周取出1个精荚用台盼蓝染色观察其成活率，放入培养层的体积数随着精荚的大小进行调节，确保3个月以上所保存的精子成活。

[0011] 以上所述的培养层，具有固定和提供精荚所需的营养物质，其配方成分、体积份数及配制方法为：0.3～0.4份浓度为1.8～3.0％的自制I型液态鼠尾胶原与0.3～0.4份2×1640培养液，0.1～0.2份美国GIBCO公司的胎牛血清，0.1份美国Sigma公司的Matrigel(一种可溶性基底膜基质)，装于放在冰盒的EP管中，充分混匀，加入0.1％的NaOH溶液，调节pH值7.2～7.4。

[0012] 以上所述的培养液：采用美国GIBCO公司的1640培养基1袋，充分溶解于500ml过滤除菌的盐度为30‰的海水中，配制成浓度为20.8g/L的2×1640培养液，并加入2.38g HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲剂于溶液中至其终浓度为10mmol/L，加入用无菌的1mol/L NaOH调节pH至6.8～7.4之间，加入青霉素和链霉素调节其终浓度为100万单位，再经过0.22μm的滤器过滤分装成50mL/瓶，备用。

[0013] 以上所述的自制I型液态鼠尾胶原，将大鼠鼠尾，置于75％的酒精中浸泡30min，于无菌条件下撕下大鼠尾皮，将尾巴切成几段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0.1％的醋酸中，置于4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌，48h后以3000r/min的速度离心收集上清既得胶原溶液，计算所制备的胶原溶液的浓度，具体方法为：取一个滤纸片于烘箱充分烘干后称滤纸重量，记为W0；将制备的液态胶原滴数滴于滤纸，称重量，记为W1；将滴有液态胶原的滤纸于烘箱充分烘干称重量，记为W2，由下面公式可求的所制备胶原的浓度：

[0014] 胶原浓度＝(W2-W0)/(W1-W0)

[0015] 本发明的的优点和积极效果：

[0016] 本发明具有操作简单、精荚结构保存完整、精子存活率高的特点。将对虾精荚保存在4℃的无菌的培养层中，该培养层具有固定和提供营养的作用。结果显示1.8～3.0％的鼠尾胶原适合用于作为培养层收缩的介质，精荚的保存时间至少为3个月以上，精子成活率达到80％以上。

具体实施方式

[0017] 下面通过实施例，对本发明的技术方案进一步具体的说明。

[0018] 实施例1：

[0019] 一、固定和提供精荚所需的营养物质培养层的配制：

[0020] (一)培养液：

[0021] 将美国GIBCO公司的1640培养基1袋，充分溶解于500ml过滤除菌的盐度为30‰的海水中，配制成浓度为20.8g/L的2×1640培养液，并加入2.38g HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲剂于溶液中至其终浓度为10mmol/L，加入用无菌的1mol/L NaOH调节pH 7.2，加入青霉素和链霉素调节其终浓度为100万单位，再经过0.22μm的滤器过滤分装成50mL/瓶，备用。

[0022] (二)自制I型液态鼠尾胶原：

[0023] 取大鼠鼠尾1条，置于75％的酒精中浸泡30min，于无菌条件下撕下大鼠尾皮，将尾巴切成几段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0.1％的醋酸中，置于4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌，48h后以3000r/min的速度离心收集上清既得胶原溶液，计算所制备的胶原溶液的浓度，具体方法为：取一个滤纸片于烘箱充分烘干后称滤纸重量，记为W0；将制备的液态胶原滴数滴于滤纸，称重量，记为W1；将滴有液态胶原的滤纸于烘箱充分烘干称重量，记为W2，胶原的浓度，备用。

[0024] (三)培养层：

[0025] 用刻度吸管吸取0.4mL 1.8％的液态鼠尾胶原分别与0.4mL的2×1640浓缩液，0.1mL胎牛血清(美国GIBCO公司)，美国Sigma公司的0.1mL美国sigma公司Matrigel(一种可溶性基底膜基质)装于放在冰盒的1.5mL的EP管中，充分混匀，加入0.1％NaOH溶液调节pH值7.2。

[0026] 二、低温保存操作过程

[0027] 常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上左手握住对虾尾部，右手握住头部，然后用右手食指隔开最后一对步足，左手拇指挤压精荚，将采集的精荚先放入EP管中。常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上将每个精荚分装于进口EP管中，快速加入配制培养层包裹精荚，然后用封口膜封口。将包裹精荚的EP管放置于细胞培养室内的4℃保鲜箱中。所保存的精荚，每1周取出1个精荚用台盼蓝染色观察其成活率，放入培养层的体积数随着精荚的大小进行调节，4个月检测所保存的精子成活率达到80.6％。

[0028] 实施例2：

[0029] 一、固定和提供精荚所需的营养物质培养层的配制：

[0030] (一)培养液：

[0031] 将美国GIBCO公司的1640培养基1袋，充分溶解于500ml过滤除菌的盐度为30‰的海水中，配制成浓度为20.8g/L的2×1640培养液，并加入2.38g HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲剂于溶液中至其终浓度为10mmol/L，加入用无菌的1mol/L NaOH调节pH7.3，加入青霉素和链霉素调节其终浓度为100万单位，再经过0.22μm的滤器过滤分装成50mL/瓶，备用。

[0032] (二)自制I型液态鼠尾胶原：

[0033] 取大鼠鼠尾1条，置于75％的酒精中浸泡30min，于无菌条件下撕下大鼠尾皮，将尾巴切成几段，抽出白色尾腱，浸入150ml的0.1％的醋酸中，置于4℃冰箱，并用磁力搅拌器进行搅拌，48h后以3000r/min的速度离心收集上清既得胶原溶液，计算所制备的胶原溶液的浓度，具体方法为：取一个滤纸片于烘箱充分烘干后称滤纸重量，记为W0；将制备的液态胶原滴数滴于滤纸，称重量，记为W1；将滴有液态胶原的滤纸于烘箱充分烘干称重量，记为W2，胶原的浓度。

[0034] (三)培养层：

[0035] 用刻度吸管吸取0.4mL 3.0％的液态鼠尾胶原与0.3mL的2×1640培养液，0.2mL美国GIBCO公司的胎牛血清，0.1mL美国Sigma公司的Matrigel装于放在冰盒的1.5mL的EP管中，充分混匀，加滴0.1％NaOH溶液调节pH值7.3。

[0036] 二、低温保存操作过程

[0037] 常温条件下在无菌细胞间内的超净工作台上左手握住对虾尾部，右手握住头部，然后用右手食指隔开最后一对步足，左手拇指挤压精荚，将采集的精荚先放入EP管中。常