具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种新型的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法，属于化学制药领域。本发明提供的化合物具有式(I)所示结构，该化合物具备良好的水溶性、治疗靶向性，且药效学指标高，药物毒性低，为制备抗肿瘤药物提供了一种新的思路。

权利要求

1.具有式（III）所示结构的化合物：

2.具有式（Ⅳ）所示结构的化合物：

3.权利要求1-2任一项所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

4.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述抗肿瘤药物是以权利要求1或2所述的化合物中的至少一种为活性成分，加入药用载体制成的制剂。

5.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于：由紫杉醇和保护的胸腺五肽的C-端羧基在缩合试剂的存在下，缩合反应后得到的产品用去保试剂去保护，纯化、冻干而得。

6.权利要求2所述的化合物的制备方法，其特征在于：由多烯紫杉醇和保护的胸腺五肽的C-端羧基在缩合试剂的存在下，缩合反应后得到的产品用去保试剂去保护，纯化、冻干而得。

7.根据权利要求5或6所述的化合物的制备方法，其特征在于保护的胸腺五肽为：保护胸腺五肽结构Ⅰ：Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

保护胸腺五肽结构Ⅱ：Fmoc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

保护胸腺五肽结构Ⅲ：Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

保护胸腺五肽结构Ⅳ：Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH。

8.根据权利要求7所述的化合物的制备方法，其特征在于保护的胸腺五肽为保护胸腺五肽结构Ⅲ：Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH。

9.根据权利要求5或6所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述的缩合试剂，选自N,N'-二环己基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二酰亚胺和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。

10.根据权利要求9所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述的缩合试剂选自N,N'-二异丙基碳二酰亚胺。

11.根据权利要求5或6所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述去保试剂为三氟醋酸、三异丙基硅烷、二巯基乙二醇、水的混合。

12.根据权利要求11所述的化合物的制备方法，其特征在于：三氟醋酸、三异丙基硅烷、二巯基乙二醇、水的重量配比为：三氟醋酸︰三异丙基硅烷︰二巯基乙二醇︰水=80-100︰1-5︰1-5︰1-5。

13.根据权利要求12所述的化合物的制备方法，其特征在于：三氟醋酸、三异丙基硅烷、二巯基乙二醇、水的重量配比为：三氟醋酸︰三异丙基硅烷︰二巯基乙二醇︰水=94︰2︰2︰2。

说明书

具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型的具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法，属于化学制药领域。

背景技术

[0002] 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是由红豆杉属植物提取的一种具有抗癌活性的四环二萜类化合物，美国布迈-施贵宝公司的制剂-紫杉醇浓缩注射液(泰素)经FDA审批，于1992年12月获准上市。用于治疗卵巢癌。最新调查资料表明，目前，世界最畅销的抗癌药物中，紫杉醇列为首位，美国国立癌研究所推测紫杉醇在今后15年内仍为世界上最重要的抗癌药物。国内目前也有数家企业生产紫杉醇注射液。

[0003] 由于紫杉醇难溶于水，目前国内外紫杉醇制剂均采用同一配方，即以聚氧乙基蓖麻油和无水乙醇为助溶载体。但这些助溶剂会引起多种毒副反应，如过敏反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心脏血管毒性等。即使在紫杉醇注射给药前预先注射皮质醇类(如西塞米松)、苯海拉明和H受体拮抗剂(如西咪替丁、雷尼替丁等)，仍不能有效彻底防止所有患者的毒副反应，仍会导致部分患者注射紫杉醇后发生过敏反应。常引起中等程度以上的变态反应，多数为I型变态反应，包括支气管痉挛引起的呼吸困难、荨麻疹和低血压以及面部潮红和皮疹。变态反应多发生于给药后24h～1周，以皮疹、面部潮红及四肢疼痛为主，发生率18.2％。临床仍然有很多病人会出现危及生命的超过敏反应的症状，另外高血压、糖尿病、溃疡病和过敏性体质患者也因无法应用普通紫杉醇药物，只能眼看着最佳治疗时机的丧失。

[0004] 另外，临床给药时，制剂经水稀释时会产生沉淀，静脉滴注时，尚需加用一个0.22μm微孔膜滤过装置，使用不便。目前国内外对紫杉醇制剂进行了研究，注射用紫杉醇脂质体工艺较复杂，不稳定。紫杉醇微乳制剂使用大量的表面活性剂，毒性大。

[0005] 多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物，为紫杉醇类抗肿瘤药。其性质跟紫杉醇类似，生物利用度比紫杉醇好，毒副作用稍小。通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用。多烯紫杉醇多烯他赛可与游离的微管蛋白结合，促进微管蛋白装配成稳定的微管，同时抑制其解聚，导致丧失了正常功能的微管束的产生和微管的固定，从而抑制细胞的有丝分裂。

[0006] 本领域需要开发更多的低毒新化合物，为抗癌领域提供更多的选择。发明内容：

[0007] 本发明的目的在于为抗肿瘤药物领域提供一种高效低毒的新的化合物。

[0008] 本发明的技术方案：具有式(I)所示结构的化合物：

[0009]

[0010] 其中：

[0011] R1为：

[0012] R2为：

[0013] 进一步地， R2为 为紫杉醇五肽，其结构为：

[0014]

[0015] 当R1为-H时，R2为： 为多烯紫杉醇五肽，其结构为：

[0016]

[0017] 本发明的目的之二是：提供了上述化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

[0018] 本发明的目的之二是：提供一种抗肿瘤药物，它是以上述化合物中的至少一种为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的制剂。

[0019] 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。5-甲基-1，3苯二酚或其衍生物的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型：喷剂，气雾剂，液体制剂如注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等，固体制剂如片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等。

[0020] 本发明的药物给药途径为注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等。

[0021] 本发明的另一个目的，提供上述化合物的制备方法，它是由式(II)所示的化合物和保护的胸腺五肽的C-端羧基在缩合试剂的存在下，缩合反应后得到的产品用去保试剂去保护，纯化、冻干而得，

[0022]

[0023] 进一步地，紫杉醇五肽、多烯紫杉醇五肽是由紫杉醇或多烯紫杉醇的2’-羟基和保护的胸腺五肽的C-端羧基在缩合试剂的存在下，经反应后生成保护的紫杉醇五肽或多烯紫杉醇五肽，用去保试剂去保护，经高效液相色谱纯化、冻干而得。

[0024] 胸腺五肽为人工合成的多肽药物，由精氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、酪氨酸五种氨基酸组成。是目前市场上处方量最大的免疫调节剂。

[0025] 胸腺五肽主要用于恶性肿瘤病人经放化疗后，免疫功能损伤者；乙型肝炎的治疗；重大外科手术及严重感染；自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎，红斑狼疮；II型糖尿病、更年期综合征；年老体衰免疫功能低下者。

[0026] 胸腺五肽极易溶于水，毒副作用极小，当急性毒性试验剂量达3000mg/kg时，亦未发现死亡和毒性反应，这个剂量相当于人体临床用药量的18万倍。胸腺五肽的半衰期为30秒，胸腺五肽在人体血浆中很快由蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸。

[0027] 胸腺五肽的作用之一是诱导T细胞分化。它可选择性地诱导Thy-1-的前胸腺细胞+转化为Thy-1 的T细胞。其T细胞分化作用由胞内cAMP水平升高介导。胸腺五肽的另一基本作用是对成熟外周血T细胞的特异受体结合，使胞内cAMP水平上升，从而诱发一系列胞内反应，这也是它免疫调节功能的基础。在正常机体状态下胸腺五肽显现免疫刺激作用，能显著增高脾淋巴细胞的E玫瑰花结形成率及转化率，对免疫应答的初次或再次反应的不同阶段都有增强作用，能增多IgM类型和IgG或IgA类型的抗体形成细胞。胸腺五肽还可增强巨噬细胞的吞噬功能，增加多形核嗜中性白细胞的酶和吞噬功能，升高循环抗体含量，增强红细胞免疫功能。胸腺五肽能活化CD4和CD8阳性细胞，使专一的Tc细胞寿命维持更长时间，同时也可活化Th细胞，诱导Ts细胞的功能。胸腺五肽的抗感染力和治疗作用与它增进TC细胞活性相关。在抗感染免疫中适量胸腺五肽可明显增加干扰素的产生。诱导和促进T细胞分化成熟；调节T淋巴细胞亚群比例使CD4/CD8趋于正常；增强巨噬细胞吞噬功能；增强红细胞免疫功能；提高自然杀伤细胞的活力；提高白介素-2的产生水平与受体表达水平；增强外周血单核细胞γ干扰素的产生；增强血清中SOD活性。

[0028] 在上述制备方法中使用的保护胸腺五肽，选自以下保护胸腺五肽结构，其优选结构为保护胸腺五肽结构III。

[0029] 保护胸腺五肽结构I：Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0030] 保护胸腺五肽结构II：Fmoc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0031] 保护胸腺五肽结构III：Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0032] 保护胸腺五肽结构Ⅳ：Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0033] 在制备紫杉醇五肽衍生物中使用的缩合试剂，选自N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HTBU)，优选缩合试剂为N，N′-二异丙基碳二酰亚胺。

[0034] 在制备紫杉醇五肽衍生物中使用的去保试剂，选自不同配比的三氟醋酸、三异丙基硅烷、二巯基乙二醇、水；优选配比为：三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝80-100∶1-5∶1-5∶1-5；更优的是：三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝
94∶2∶2∶2。

[0035] 本发明的有益效果是：本发明化合物溶解性高，紫杉醇五肽和多烯紫杉醇五肽在水中的溶解度均大于20mg/ml，远远高于紫杉醇和多烯紫杉醇在水中的溶解度。毒性低，紫杉醇五肽LD50为101.56±5.63mg/kg，95％可信限为98.21～100.37；多烯紫杉醇五肽LD50为118.79±5.86mg/kg，95％可信限为96.24～104.49。与对照组相比，单纯紫杉醇注射组的LD50为37.84±5.19mg/kg，95％可信限为95.29～102.68。本发明化合物其具备良好的水溶性、治疗靶向性，其药效学指标得到提高，间接延长了胸腺五肽的半衰期，使其免疫调节活性得到了增强。

附图说明

[0036] 图1是紫杉醇五肽HPLC图谱；

[0037] 图2是多烯紫杉醇五肽HPLC图谱；

[0038] 图3是紫杉醇五肽质谱图；

[0039] 图4多烯紫杉醇五肽质谱图；

[0040] 图5对照品氨基酸组成HPLC图谱；

[0041] 图6紫杉醇五肽水解氨基酸组成HPLC图谱；

[0042] 图7多烯紫杉醇五肽水解氨基酸组成HPLC图谱。具体实施方式：

[0043] 具有式(I)所示结构的化合物：

[0044]

[0045] 其中：

[0046] R1为：

[0047] R2为：

[0048] 本发明提供的抗肿瘤药物，它是本发明化合物中的至少一种为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的制剂。

[0049] 所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。5-甲基-1，3苯二酚或其衍生物的药物组合物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型：喷剂，气雾剂，液体制剂如注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等，固体制剂如片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂等。

[0050] 本发明的药物给药途径为注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等。

[0051] 本发明化合物的制备方法，它是由式(II)所示的化合物和保护的胸腺五肽C-端羧基在缩合试剂的存在下，缩合反应后得到的产品用去保试剂去保护，纯化、冻干而得，[0052]

[0053] 进一步地，紫杉醇五肽、多烯紫杉醇五肽是由紫杉醇或多烯紫杉醇的2’-羟基和保护的胸腺五肽C-端羧基在缩合试剂的存在下，经反应后生成保护的紫杉醇五肽或多烯紫杉醇五肽，用去保试剂去保护，经高效液相色谱纯化、冻干而得。

[0054] 在上述制备方法中使用的保护胸腺五肽，选自以下保护胸腺五肽结构，其优选结构为保护胸腺五肽结构III。

[0055] 保护胸腺五肽结构I：Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0056] 保护胸腺五肽结构II：Fmoc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0057] 保护胸腺五肽结构III：Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH；

[0058] 保护胸腺五肽结构Ⅳ：Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH。

[0059] 在制备紫杉醇五肽衍生物中使用的缩合试剂，选自N，N′-二环己基碳二亚胺、N，N′-二异丙基碳二酰亚胺、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯中的至少一种，优选缩合试剂为N，N′-二异丙基碳二酰亚胺。

[0060] 在制备紫杉醇五肽衍生物中使用的去保试剂，选自不同配比的三氟醋酸、三异丙基硅烷、二巯基乙二醇、水；优选配比为：三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝80-100∶1-5∶1-5∶1-5；更优的是：三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝
94∶2∶2∶2。

[0061] 以下通过具体实施例的方式对本发明做进一步详述，但不应理解为是对本发明的限制。

[0062] 实施例1制备紫杉醇五肽

[0063] 取保护胸腺五肽结构I[Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH]32.8g(24mmol)、紫杉醇10.2g(12mmol)、1-羟基-苯并-三氮唑3.3g(24mmol)和4-二甲氨基吡啶0.15g(1.2mmol)，用50ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，搅拌滴加N，N-二异丙基碳二亚胺3.7ml、室温搅拌反应过夜，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次。

[0064] 在沉淀中加入50ml 20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应1小时，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次，40℃减压干燥过夜。

[0065] 在沉淀中加入300ml去保护剂(三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝94∶2∶2∶2)，室温反应1小时，加入3000ml冰乙醚，过滤收集沉淀，经高效液相色谱纯化后冻干，得紫杉醇五肽9.7g，收率为53.3％。

[0066] 实施例2制备紫杉醇五肽

[0067] 取保护胸腺五肽结构II[Fmoc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH]26.7g(24mmol)、紫杉醇10.2g(12mmol)、1-羟基-苯并-三氮唑3.3g(24mmol)和4-二甲氨基吡啶0.15g(1.2mmol)，用50ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，搅拌滴加N，N-二异丙基碳二亚胺3.7ml、室温搅拌反应过夜，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次。

[0068] 在沉淀中加入50ml 20％哌啶/N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌反应1小时，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次，40℃减压干燥过夜。

[0069] 在沉淀中加入300ml去保护剂(三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝94∶2∶2∶2)，室温反应1小时，加入3000ml冰乙醚，过滤收集沉淀，经高效液相色谱纯化后冻干，得紫杉醇五肽7.6g，收率为41.8％。

[0070] 实施例3制备紫杉醇五肽

[0071] 取保护胸腺五肽结构III[Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH]29.9g(24mmol)、紫杉醇10.2g(12mmol)、1-羟基-苯并-三氮唑3.3g(24mmol)和4-二甲氨基吡啶0.15g(1.2mmol)，用50ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，搅拌滴加N，N-二异丙基碳二亚胺3.7ml、室温搅拌反应过夜，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次，40℃减压干燥过夜。

[0072] 在沉淀中加入300ml去保护剂(三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝94∶2∶2∶2)，室温反应1小时，加入3000ml冰乙醚，过滤收集沉淀，经高效液相色谱纯化后冻干，得紫杉醇五肽12.9g，收率为70.9％。

[0073] 实施例4制备紫杉醇五肽

[0074] 取保护胸腺五肽结构Ⅳ[Boc-Arg-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH]23.8g(24mmol)、紫杉醇10.2g(12mmol)、1-羟基-苯并-三氮唑3.3g(24mmol)和4-二甲氨基吡啶0.15g(1.2mmol)，用50ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，搅拌滴加N，N-二异丙基碳二亚胺3.7ml、室温搅拌反应过夜，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次，40℃减压干燥过夜。

[0075] 在沉淀中加入300ml去保护剂(三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝94∶2∶2∶2)，室温反应1小时，加入3000ml冰乙醚，过滤收集沉淀，经高效液相色谱纯化后冻干，得紫杉醇五肽9.2g，收率为50.5％。

[0076] 实施例5制备多烯紫杉醇五肽

[0077] 取保护胸腺五肽结构III[Boc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-Tyr(tBu)-OH]29.9g(24mmol)、多烯紫杉醇9.2g(12mmol)、1-羟基-苯并-三氮唑3.3g(24mmol)和4-二甲氨基吡啶0.15g(1.2mmol)，用50ml N，N-二甲基甲酰胺溶解，搅拌滴加N，N-二异丙基碳二亚胺3.7ml、室温搅拌反应过夜，将反应液倒入500ml的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用水洗涤3次，40℃减压干燥过夜。

[0078] 在沉淀中加入300ml去保护剂(三氟醋酸∶三异丙基硅烷∶二巯基乙二醇∶水＝94∶2∶2∶2)，室温反应1小时，加入3000ml冰乙醚，过滤收集沉淀，经高效液相色谱纯化后冻干，得多烯紫杉醇五肽11.2g，收率为65.5％。

[0079] 实施例1-5产品结构确证：

[0080] 1、纯度分析：紫杉醇五肽HPLC图谱见图1；

[0081]

[0082] Total Area 35388.34

[0083] 多烯紫杉醇五肽HPLC图谱见图2；

[0084]

[0085] Total Area 66196.02

[0086] 结果显示两个样品HPLC纯度均大于98％。

[0087] 2、质谱分析：测定紫杉醇五肽分子量(理论值1515.66)为1516.8(M+1)，多烯紫杉醇五肽分子量(理论值1427.55)为1428.7(M+1)，与理论值一致，见附图3～4。

[0088] 紫杉醇的结构中含有3个羟基，分别是1-羟基，7-羟基和2’-羟基，其中2’-羟基更容易与保护胸腺五肽C端的羧基反应。这是因为1-羟基是叔羟基，空间位阻最大，很难被酯化。7-羟基由于受同侧甲基的影响，虽存在一定位阻，但是能与带保护基团的胸腺五肽发生酯化，只是2’-羟基与带保护基团的胸腺五肽的酯化产物是优势产物，能通过HPLC纯化得到。

[0089] 多烯紫杉醇的结构中含有4个羟基，分别是1-羟基，7-羟基，10-羟基和2’-羟基，其中2’-羟基更容易与保护胸腺五肽C端的羧基反应。这是因为1-羟基是叔羟基，空间位阻最大，很难被酯化。7-羟基和10-羟基一样虽存在一定的空间位阻，但是能与带保护基团的胸腺五肽发生酯化，只是2’-羟基与带保护基团的胸腺五肽的酯化产物是优势产物，能通过HPLC纯化得到。

[0090] 由于胸腺五肽在代谢过程中是从精氨酸的氨基端开始降解，其活性中心也在氨基端，所以新化合物有可能保持胸腺五肽的免疫活性，同时由于胸腺五肽的亲水性有可能改变紫杉醇在水中的溶解性；紫杉醇的抗肿瘤活性中心是它的四环二萜内核，故新化合物将有可能保持或者提高原有的抗肿瘤活性，并降低其毒副作用，将具有很好的临床价值。

[0091] 3、氨基酸组成分析：取上述紫杉醇五肽和多烯紫杉醇五肽酸各5mg，置于样品瓶中，放入加有5ml 6mol/L盐酸的水解瓶中，充入氮气1min，密封后于110℃条件下水解反应24小时，衍生后，用高效液相分析仪进行测定，以相对摩尔比计算各氨基酸的相对比值。

[0092] 图5对照品氨基酸组成HPLC图谱；

[0093]

[0094] 图6紫杉醇五肽水解氨基酸组成HPLC图谱；

[0095]

[0096] 图7多烯紫杉醇五肽水解氨基酸组成HPLC图谱。

[0097]

[0098] 结果显示，各氨基酸的相对比值与理论值一致。

[0099] 试验例1水溶性测定

[0100] 实施例1-5的样品按《中国药典》2010版方法测定，紫杉醇五肽和多烯紫杉醇五肽在水中的溶解度均大于20mg/ml，远远高于紫杉醇和多烯紫杉醇在水中的溶解度。

[0101] 试验例2急性毒性试验

[0102] 试验方法：

[0103] 预实验

[0104] 将雌雄各半的健康昆明小白鼠随机分为5*2组，每组4只。配制0.5％紫杉醇五肽原液，0.5％多烯紫杉醇五肽原液和0.3％紫杉醇原液，可进一步稀释为不同浓度药液。小鼠尾静脉注射给药，各组给药剂量按照等比数列递减。记录每组动物的死亡率。目的在于找到并确定造成0％与100％动物死亡的剂量范围。

[0105] 正式实验

[0106] (1)先将小鼠雌雄分开，逐一称重。雌、雄小鼠分别按照体重由小到大(或由大到小)排序。然后按照分层随机原则将小鼠分为5*2组，每组10只。

[0107] (2)根据预实验中造成0％与100％动物死亡的剂量范围，在其间设计5个不同剂量组，使剂量按照等比数列递减。给药后观察并记录动物的死亡时间和数目。连续观察14天。按照改进寇氏法计算LD50值和95％可信限。

[0108] 试验结果表明：小鼠急性毒性试验，一次性尾静脉注射给药测定，测得紫杉醇五肽LD50为101.56±5.63mg/kg，95％可信限为98.21～100.37；多烯紫杉醇五肽LD50为118.79±5.86mg/kg，95％可信限为96.24～104.49。与对照组相比，单纯紫杉醇注射组的LD50为37.84±5.19mg/kg，95％可信限为95.29～102.68。

[0109] 试验例3抗肿瘤活性测定

[0110] 将上述合成的紫杉醇五肽进行九种肿瘤细胞系和人正常细胞的细胞毒性筛选，与紫杉醇((taxol)相比较。采用的方法是MTT(四氮唑)法。

[0111] 将对数生长期的人癌细胞按1200-1500个/100uL接种于96孔培养板。24小时后加入不同浓度药物(0.1pmol/L至10umol/L共9个浓度)及相应溶剂对照(1/10体积)，每组平行4孔，于37℃继续培养72小时后，弃上清，每孔加100uL新鲜配制的含0.5mg/mL MTT(四氮唑)的培养基，继续培养4小时，弃培养上清，加100uL DMSO溶解MTT沉淀，用微型振荡器振荡混匀，在Bio-Rad 450型酶标仪上测定570nm处光密度值(650nm为参考波长)，用计算机软件(SigmaPlot)辅助拟合量效曲线，并计算IC50(半数抑制浓度)。

[0112] 表1为紫杉醇五肽和紫杉醇对体外培养的肿瘤细胞和正常细胞的生长抑制作用(IC50nmol/L)的比较。

[0113] 研究表明，化合物紫杉醇五肽在低浓度时对多数肿瘤细胞系有明显的抑制作用，其对肿瘤细胞系抑制作用的IC50，与紫杉醇相当或略高。如表1所示，化合物紫杉醇五肽对多数肿瘤细胞有良好的细胞毒性作用，其肿瘤杀伤谱与紫杉醇相同。

[0114] 表1

[0115]

[0116] 试验例4抗肿瘤活性测定

[0117] 将上述合成的多烯紫杉醇五肽进行九种肿瘤细胞系和人正常细胞的细胞毒性筛选，与多烯紫杉醇((taxol)相比较。采用的方法是MTT(四氮唑)法。

[0118] 将对数生长期的人癌细胞按1200-1500个/100uL接种于96孔培养板。24小时后加入不同浓度药物(0.1pmol/L至10umol/L共9个浓度)及相应溶剂对照(1/10体积)，每组平行4孔，于37℃继续培养72小时后，弃上清，每孔加100uL新鲜配制的含0.5mg/mL MTT(四氮唑)的培养基，继续培养4小时，弃培养上清，加100uL DMSO溶解MTT沉淀，用微型振荡器振荡混匀，在Bio-Rad 450型酶标仪上测定570nm处光密度值(650nm为参考波长)，用计算机软件(SigmaPlot)辅助拟合量效曲线，并计算IC50(半数抑制浓度)。

[0119] 表2为多烯紫杉醇五肽和多烯紫杉醇对体外培养的肿瘤细胞和正常细胞的生长抑制作用(IC50nmol/L)的比较。

[0120] 研究表明，化合物多烯紫杉醇五肽在低浓度时对多数肿瘤细胞系有明显的抑制作用，其对肿瘤细胞系抑制作用的IC50，与多烯紫杉醇相当或略高。如表1所示，化合物多烯紫杉醇五肽对多数肿瘤细胞有良好的细胞毒性作用，其肿瘤杀伤谱与多烯紫杉醇相同。

[0121] 表2

[0122]