芦苇植物络合素基因PaPCS及其应用

摘要

本发明公开了一种芦苇植物络合素基因PaPCS及所述基因PaPCS的植物表达载体pROK2，和其在培育抗重金属植物中的应用。本发明所述的采用转PaPCS基因提高草坪草高羊茅累积重金属和抗重金属能力的方法可广泛用于培育抗重金属的生物量大、生长快的植物品种。实验证明，本发明的转基因植株比非转基因植株的富集重金属的能力得到了提高。

权利要求

1.一种芦苇植物络合素基因PaPCS，其特征在于：所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述芦苇植物络合素基因PaPCS 在培育抗重金属植物高羊茅中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述高羊茅中含有权利要求1所述的芦苇植物络合素基因PaPCS。

说明书

芦苇植物络合素基因PaPCS及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种芦苇植物络合素基因PaPCS及其在培育抗重金属植物中的应用，和重金属污染土壤的修复。

背景技术

[0002] 随着工业的发展，重金属污染已成为全球关注的问题。目前，我国有数千万公顷的重金属污染土壤，极大地危害了人类健康。因此，有效地去除重金属污染成为当前十分迫切的任务。

[0003] 植物修复技术(phytoremediation)的分子生物学研究是当前环保领域的研究热点。传统的植物修复主要依赖于从污染环境中寻找超富集植物，不仅花费时间长，而且所发现的超富集植物通常都具有生物量小，生长缓慢，缺少将污染物通过根部运输到地上部分的能力等问题，极大地限制了植物修复的应用和发展。利用转基因技术筛选和培育具有高生物量的速生重金属富集或超富集植物，是开发和利用植物修复技术进行污染土壤净化的有效新途径。

[0004] 基因工程在植物重金属的富集方面已取得了一些相关的研究进展，已识别和克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于重金属污染的土壤修复研究。许多实验表明，将动、植物本身与重金属脱毒相关的基因转入高生物量植物，异源表达产物可介导转基因植物耐受和高积累重金属。

[0005] 植物络合素(Phytochelatins，PCs)是由重金属诱导而合成的一类小分子多肽，能鳌合重金属，从而减轻重金属对植物的毒害，是植物应对重金属胁迫的最重要机制。其合成限速酶基因主要有植物络合素合酶基因(PCS)及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(γ-ECS)，已在生物量小的拟南芥和印度芥菜中证实了它们富集重金属的功能。

[0006] 芦苇(Phragmites australi(Cav.)Trin.ex Steud)具有很强的净化污染的能力，2+ 2+ 2+
可超富集重金属(Cd 、Pb 、Zn )，为湿地处理污水的主要物种，其重金属富集关键酶基因的克隆研究尚未见报道。高羊茅(Festuca arundinacea Tall Fescue)为世界范围内广泛种植、生物量大、生长快的优良草坪草。尚未见对它们进行重金属富集相关基因转化的报道。利用基因工程获得的高富集/抗重金属草坪草经不断切割、回收，可减少土壤重金属的富集量，从而实现修复重金属污染土壤的目的。因此，开展转基因草坪草富集重金属的研究具有重要意义。但是，经检索，将芦苇的植物络合素合酶基因转入高羊茅等草坪草以提高它的抗重金属的性能尚未见报道。

发明内容

[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种芦苇植物络合素基因PaPCS，及含有所述基因PaPCS的植物表达载体pROK2，和其在培育抗重金属植物中的应用。

[0008] 本发明所述芦苇植物络合素基因PaPCS，其特征在于：所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0009] 本发明所述含有权利要求1所述基因PaPCS的植物表达载体pROK2，其特征在于：所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

[0010] 本发明所述芦苇植物络合素基因PaPCS在培育抗重金属植物中的应用。

[0011] 其中：所述植物优选是高羊茅，其含有权利要求1所述的芦苇植物络合素基因PaPCS。

[0012] 本发明从芦苇中分离得到植物络合素合酶基因PaPCS(核苷酸序列如序列表SEQID No.1所示)，并将其转到高生长量的草坪草高羊茅中以实现土壤重金属污染的修复和抗重金属能力。

[0013] 将芦苇植物络合素合酶基因PaPCS导入植物细胞，植物就可以获得富集重金属的能力，为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对本发明所述植物表达载体pROK2进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，优选的载体是pROK2。

[0014] 本发明所述的采用转PaPCS基因提高草坪草高羊茅累积重金属和抗重金属能力的方法可广泛用于培育抗重金属的生物量大、生长快的植物品种，其中所述植物优选高羊茅。

[0015] 本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到芦苇的植物络合素合酶基因PaPCS，并通过根瘤农杆菌介导的方法转入生物量大、生长快的植物品种特别是高羊茅中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的富集重金属和抗重金属的能力得到了很大程度的提高。

附图说明

[0016] 图1植物表达载体pROK/PaPCS。

[0017] 图2PaPCS转化高羊茅、卡那霉素筛选和再生植株A.愈伤组织；B.与农杆菌共培养；C.Kan筛选愈伤组织；D.再生植株；E.Kan筛选再生植株F.移栽入土。

[0018] 图3PCR分析(A)和Southern blot实验(B)验证转基因植株中存在PaPCS基因。其中：泳道TP-1、TP-2：筛选得到的转基因高羊茅；P：质粒；WT：阴性对照(野生型高羊茅DNA)；M：marker。

[0019] 图4镉处理(0.15mM CdCl2)5天后野生型和转基因高羊茅的生物量。

[0020] 其中：TP-1、TP-2：转基因高羊茅；WT：野生型高羊茅；每一株系测量12株取平均值。

[0021] 图5镉处理(0.15mM CdCl2)5天后野生型和转基因高羊茅的Cd含量。

[0022] 其中：TP-1、TP-2：转基因高羊茅；WT：野生型高羊茅；每一株系测量4株取平均值。

具体实施方式

[0023] 实施例1、PaPCS的克隆

[0024] 1.1芦苇总RNA的提取

[0025] (1)芦苇材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。

[0026] (2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1mlTRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀。

[0027] (3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min。

[0028] (4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min。

[0029] (5)2-8℃12000r/min离心10min，弃上清。

[0030] (6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清。

[0031] (7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。

[0032] 1.2逆转录合成第一链cDNA

[0033] (1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分：

[0034] 用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl)2.0ul

[0035] Olige(dT)anchored primer(2μM)2.0μl

[0036] (2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。

[0037] (3)在10μl反应体系中加入下列成分：2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。

[0038] 1.3PCR

[0039] 以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。

[0040] (1)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成

[0041] 引物P1：5′-CTTCCAG(A/T)CTCA(G/A)TCGGAGC-3′

[0042] 引物P0：5′-ATTGC(G/C)ACTCCT(T/A)GACAGCA-3′

[0043] (2)PCR反应体系

[0044]

[0045] (3)PCR反应程序

[0046] 94℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳。

[0047] 1.43′-RACE

[0048] 以 上 述 逆 转 录 合 成 第 一 链 cDNA 为 模 板，以 引 物 P3：5′-AAGTATTGTGTTGAAGATTT-3′和anchored primer为引物，PCR法扩增基因3′-端序列。

[0049] 1.55′-RACE

[0050] 按照TaKaRa 5′-Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5′-RACE产物。

[0051] 1.6目的片段的回收

[0052] (1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5mlEppendorf管中。

[0053] (2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。

[0054] (3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-IIBuffer，均匀混合。

[0055] (4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

[0056] (5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

[0057] (6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。

[0058] (7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min。

[0059] (8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min。

[0060] (9)12000rpm离心1min洗脱DNA。

[0061] (10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr。

[0062] (11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。

[0063] 1.7连接

[0064] 用上述的回收目的片段与pGMT载体(购自宝生物工程有限公司，下同)按摩尔比约1∶1的比例进行连接，连接体系如下：

[0065]

[0066] 混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质，用于后面的反应。

[0067] 1.8CaCl2法制备感受态细胞

[0068] (1)挑取DH10B单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

[0069] (2)按1∶100-1∶50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.3-0.6。

[0070] (3)将菌液冰浴10min，4℃4000rpm离心10min，收集菌体。

[0071] (4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl2悬浮后，冰浴30min。

[0072] (5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl2，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。

[0073] 1.9热击法转化Ecoli DH10B

[0074] (1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.7中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。

[0075] (2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)。

[0076] (3)冰浴3-5min。

[0077] (4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。

[0078] (5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。

[0079] (6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。

[0080] 110碱裂解法提取大肠杆菌质粒

[0081] (1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；

[0082] (2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；

[0083] (3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；

[0084] (4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；

[0085] (5)加入150μl冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；

[0086] (6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；

[0087] (7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；

[0088] (8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；

[0089] (9)12000rpm，离心3min；

[0090] (10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

[0091] (11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；

[0092] (12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。

[0093] (13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；

[0094] (14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；

[0095] (15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；

[0096] (16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。

[0097] 1.11质粒酶切验证

[0098] 用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示：

[0099] 重组质粒 16μl

[0100] EcoRI限制性内切酶 2μl

[0101] 10×Buffer 2μl

[0102] 将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

[0103] 1.11DNA测序

[0104] 挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博尚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

[0105] 经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与禾本科的PCS同源，命名为芦苇植物络合素合酶基因PaPCS。

[0106] 实施例2、植物表达载体的构建

[0107] 2.1目的基因的获得

[0108] 引物设计及PCR反应的体系和条件：

[0109] (1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROK2(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点SacI和XbalI。

[0110] P4：5′-GCTCTAGAATGGAGATGCCGTCTCTGTA-3′

[0111] SacI

[0112] P5：5′-GTCGAGCTCCTAATGTGATGGTGGCACATG-3′

[0113] XbalI

[0114] (2)PCR反应体系：

[0115]

[0116] (3)PCR反应条件为

[0117] 94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。

[0118] 2.2表达载体的构建

[0119] 将带有SacI，XbalI酶切位点的cDNA与质粒分别进行SacI和XbalI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下：

[0120] (1)酶切反应体系和条件：

[0121]

[0122] 上表体系30℃1h，下表体系37℃1h

[0123]

[0124] (2)质粒酶切反应体系和条件：

[0125]

[0126] 上表体系30℃1h，下表体系37℃1h

[0127]

[0128]

[0129] 连接反应用T4DNA Ligase进行，体系和条件同pGEM-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK/PaPCS的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。

[0130] 2.3测序

[0131] 将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有芦苇PaPCS的cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因PaPCS的植物表达载体pROK/PaPCS(图1)。

[0132] 实施例3、农杆菌介导的芦苇植物络合素合酶基因PaPCS的高羊茅转化[0133] 4.1DNA导入农杆菌

[0134] 4.1.1农杆菌感受态细胞的制备

[0135] (1)活化农杆菌AGL1(购自宝生物工程有限公司)，然后挑取单菌落到10mlYEP中，28℃振摇过夜。

[0136] (2)取2ml菌液于100mlYEP中稀释，28℃振摇过夜。将菌液倒入离心管后，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10m in后去上清。

[0137] (3)用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液每管5ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g离心10min。

[0138] (4)弃去上清，用含15％甘油的预冷的。0.05mol/L的CaCl2溶液每管1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟后，即成感受态细胞悬液。

[0139] (5)将感受态细胞分装成200μl的小份，-70℃保存待用。

[0140] 4.1.2转化

[0141] (1)向200μl农杆菌感受态细胞中加入0.5-1.0μg重组质粒pROK/PaPCS，冰上放置5min后，立即放入液氮中5min。取出离心管，37℃保温5min后，用1mLYEP在无菌条件下稀释，28℃振摇2-4h。

[0142] (2)取200涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)和40mg/L利福平(Rio)的YEP平板中，28℃培养得到单菌落。

[0143] 4.1.3转化鉴定

[0144] (1)挑取农杆菌单菌落，扩增抽提重组质粒pROK/PaPCS。

[0145] (2)将重组质粒pROK/PaPCS转化至DH10B感受态细胞并进行鉴定。

[0146] 4.2农杆菌介导的高羊茅转化

[0147] (1)草坪草愈伤组织的诱导

[0148] 高羊茅种子在70％乙醇中浸泡3Osec，经10％NaClO消毒10min，无菌水漂洗8次，接种于愈伤诱导培养基上，得到的愈伤用同样的培养基继代。

[0149] (2)筛选培养基选择压力的确定

[0150] 将未转化的高羊茅愈伤组织转移到含不同卡那霉素浓度(0，5，10mg/L)的继代培养基上，25℃暗培养两周，然后转移到新的含相应卡那霉素浓度的继代培养基上继续25℃暗培养两周。得到最佳筛选浓度为5mg/L。

[0151] 4.2.1农杆菌准备

[0152] (1)从-70℃冰箱取出含重组质粒的农杆菌AGL1，于含有抗生素的LB固体培养基上活化。

[0153] (2)两天后YEP培养基上长出农杆菌单菌落，挑取单菌落于含有抗生素的10ml液体培养基中振摇培养。

[0154] (3)两天后，液体培养的农杆菌OD600为0.8±0.01，将农杆菌划线培养于含有抗生素的固体培养基上。用来转化的农杆菌在培养基上需要生长3天左右。

[0155] 4.2.2转化方法

[0156] (1)草坪草愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上预培养7天。

[0157] (2)农杆菌在固体培养基上生长3天后，离心收集农杆菌再悬浮培养在含乙酰丁香酮的继代培养基上，使初始的OD600＝0.8。

[0158] (3)将预培养的愈伤收集到无菌的三角瓶中，倒入上述的农杆菌液，浸没愈伤，静置30min，接着用无菌滤纸吸干愈伤表面多佘菌液后，转移到铺有滤纸的共培养基上共培养3天。

[0159] (4)共培养3天后，从共培养基上收集愈伤到三角瓶中，经过如下洗涤先用无菌水漂洗愈伤，然后用加有Cef(头孢霉素)的继代培养基洗，这样作为一个循坏，洗2-3个循环，然后无菌滤纸吸干。

[0160] (5)然后将愈伤组织转移到选择培养基上，进行筛选。

[0161] (6)经过一个月(两轮)的筛选后，将愈伤组织转移到分化培养基上进行再分化。

[0162] (7)再分化的愈伤转移到生根培养基上进行生根培养。最后移栽入土[0163] 4.3CTAB法提取转基因植株基因组DNA

[0164] (1)称取0.5g的高羊茅叶子，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。

[0165] (2)混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。

[0166] (3)将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，4℃下10000g离心10min。

[0167] (4)将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。

[0168] (5)4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min

[0169] (6)加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。

[0170] 4.4PCR检测转基因植株

[0171] 以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增芦苇PaPCS。

[0172] (1)PCR反应体系

[0173]

[0174]

[0175] (2)PCR反应程序

[0176] 94℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。

[0177] 反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

[0178] 转化过程如图2所示，结果共移栽成活了95株转PaPCS基因的抗性植株，在移栽成活了95株转PaPCS基因的抗性植株中检测得到了7株转PaPCS基因的阳性植株。

[0179] 4.5Southern杂交验证

[0180] 选取2株阳性植株(TP-1、TP-2)进行Southern杂交验证。步骤如下：

[0181] (1)CTAB法提取阳性植株，野生型植株DNA

[0182] (2)SacI酶切阳性植株和野生型植株DNA，电泳

[0183] (3)转膜

[0184] ①碱变性：室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。变性液：0.5M NaOH；1.5MNaCl。

[0185] ②中和：将凝胶转移到中和液15min。中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5MNaCl；

[0186] ③转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。进行转移。(转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。转移液用20×SSC。注意在膜与胶之间不能有气泡。整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。)转移液(20×SSC)：NaCl 175.3g；柠檬酸三钠82.2g，NaOH调pH至7.0，加ddH2O至1000ml。

[0187] ④转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80℃烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。

[0188] (4)按照Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II说明书标记PaPCS，并进行杂交及检测。

[0189] 检测发现所选的PaPCS转基因植株(TP-1、TP-2)的基因组均整合了单拷贝的目的基因(图3)。

[0190] 4.7镉处理下转基因高羊茅生长及Cd富集

[0191] (1)样品预处理：野生型和转基因植株营养液中生长1个月后，加入0.15mM CdCI2处理五天后测量生长量变化，并分别取根叶及全植株80度烘箱晾干测量镉富集量。

[0192] (2)样品消解：称取干材料1.000～5.000g于三角烧瓶中，放数粒玻璃珠，加10ml混合酸(或再加1～2ml硝酸)，加盖过夜，加一小漏斗在电炉上消解，若变棕黑色，再加混合酸。直至冒白烟，消化液无色透明、放冷移入10～25ml容量瓶，用水定容至刻度，摇匀。同时做试剂空白。

[0193] (3)测定

[0194] (1)仪器参考条件：波长228.8nm；狭缝0.2～1.0nm；灯电流5～7mA；干燥温度85℃，5s；120℃，30s；灰化温度350℃，15～20s；原子化温度1700～2100℃，4～5s，背景校正为氘灯或塞曼效应扣背景。

[0195] (2)标准曲线绘制：将仪器参考仪器条件调至最佳状态。待稳定后分别吸取上面配制的镉标准使用0.001，0.003，0.005，0.007，0.010mg/ml各10～20mL，或由仪器自动配制后注入石墨炉，同时吸取20g/L磷酸氢二铵溶液5.0mL，进样总体积20～30.0mL，注入石墨炉，在调整好的仪器条件下测定。测得其吸光值，并求得吸光值与浓度关系的一元线性回归方程，或由仪器自动计算出标准曲线测定结果。

[0196] (3)样品测定：将试剂空白液和样液分别吸10～20mL，或由仪器自动配制后注入石墨炉，同时吸取20g/L磷酸氢二铵溶液5.0mL，进样总体积20～30.0mL，注入石墨炉，在调整好的仪器条件下测定。测得其吸光值，代人标准系列的一元线性回归方程中求得样液中镉含量，或由仪器自动计算出样品含量结果。

[0197] 比较转基因高羊茅与野生型高羊茅的生长情况发现，处理5天后转基因株系的生物量均高于野生型(图4)。0.15mM CdCl2处理5天后，转PaPCS植株的镉富集量大于野生型(图5)。表明PaPCS在高羊茅中的表达提高了其镉抗性和镉富集能力。