发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用

摘要

本发明涉及“发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用”属于生物技术领域。本发明采用发根农杆菌并利用微量注射方法诱导花生根系，得到了嵌合植株，同时对该体系的方法，进行了优化，以上胚轴为外植体微量注射方式侵染花生的方法，最大的转化效率为61％，同时验证了经密码子优化的cry8Ea1和cry8Ha1基因对暗黑鳃金龟幼虫的生物活性。本发明成功建立了花生根诱导体系，为外源基因导出花生植株，提供了快速验证方法，为进一步得到转基因花生植株提供了技术支持。

权利要求

1.发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法的应用，其特征在于所述发根农杆菌中含有外源基因载体，菌种活化时的培养基中还含有载体所带的相应抗生素，所述外源基因载体中的基因为经密码子优化的cry8Ea1或cry8Ha1,其核苷酸序列如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示；所述外源基因载体中基因的上游添加了Ω序列、Kozak序列，下游添加了内质网定位信号，所述外源基因载体中添加了上述序列的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示；骨架载体为插入了两个MAR序列的基础载体pCAMBIA2300；cry8Ea1或cry8Ha1基因由组成型启动子35S驱动，所述发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法包括如下步骤：（1）活化菌种，将发根农杆菌在含有链霉素、利福平的LB固体培养基上划线培养，长出单菌落，挑取单菌落在含有链霉素、利福平的LB液体培养基中220rpm，30℃培养至OD600=0.2-0.8，

7 7

（2）微量注射，取发根农杆菌对花生外植体上胚轴微量注射，接种量为1×10-5×10 ；

（3）接菌的外植体放置到含有乙酰丁香酮的共培养基上培养1-3天，乙酰丁香酮的含-1 -1量为5μmol l -100μmol l ；

（4）转移到继代培养基上，培养6-25天，

所述发根农杆菌的菌株为发根农杆菌K599，所述共培养基和继代培养基为MS基础培养基。

7

2.根据权利要求1所述的方法，所述发根农杆菌的接种量为每个外植体5×10 个细-1胞，共培养2天，共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为50μmol l 。

3.根据权利要求1所述的方法，所述微量注射为采用微量注射器，分三点在上胚轴注射。

4.根据权利要求1所述的方法，所述花生外植体为完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养5天左右后的小苗，切去下胚轴得到。

说明书

发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及是发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法及其应用。

背景技术

[0002] 发根农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，会引起植物的发状根(Moore L.，Warren G.，and Strobel G.Involvement of a plasmid in the hairy root disease of plants caused by Agrobacterium rhizogenes.Plasmid，1979，2：617-26.)，并合成冠瘿碱。发根农杆菌中的大质粒决定了感染植物合成的冠瘿碱的种类，根据分泌冠瘿碱的不同，将发根农杆菌分为黄瓜碱、异黄瓜碱、甘露碱和农杆碱型4种。发根农杆菌中rol基因整合到植物基因组后表达，使侵染的组织分化出大量的根。发根农杆菌因侵染效率高、宿主广泛，目前成功的诱导100多种植物产生发状根(Georgiev M.，Pavlov A.，and Bley T..Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，74：1175-1185.)。发根农杆菌功能基因及发状根诱导机制的研究，加速了发根农杆菌在积累化合物等方面的应用，主要是在药用植物中生产次级代谢产物，其次研究根瘤形成机制及相关基因功能和植物的遗传转化。

[0003] 发根农杆菌在花生上的应用，主要是侵染野生的发根农杆菌，在诱导的根系中提取花生根中的白黎芦醇，并没有通过发根农杆菌转化外源基因的报道。建立发根农杆菌介导的根诱导体系，对体系进行优化，获得的嵌合植株为外源基因在花生根中的功能验证提供实验材料。

发明内容

[0004] 针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法，成功的获得了嵌合植侏，为外源基因在花生根中的快速的功能验证提供了实验基础，本发明还通过烟草基因的成功转入，表明本发明建立的诱导体系可以成为转基因成功与否的快速验证体系。

[0005] 发根农杆菌介导的花生根诱导体系的建立方法，包括如下步骤：

[0006] (1)活化菌种，将发根农杆菌在含有有链霉素、利福平的LB固体培养基上划线培养，长出单菌落，挑取单菌落在含有链霉素、利福平的LB液体培养基中220rpm，30℃培养至OD600＝0.2-0.8，

[0007] (2)微量注射，取发根农杆菌对花生外植体上胚轴微量注射，接种量为7 7
1×10-5×10 ；

[0008] (3)接菌的外植体放置到共培养基上培养1-3天；

[0009] (4)转移到继代培养基上，培养6-25天。

[0010] 所述共培养基为MS基础培养基。

[0011] 所述共培养基中的乙酰丁香酮的含量为5μmol l-1-100mol l-1。

[0012] 所述继代培养基为MS基础培养基。

[0013] 优选：取指数期的发根农杆菌，接种量为每个外植体5×107个细胞，共培养2天，-1共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为50μmol l 。

[0014] 所述微量注射为采用微量注射器，在上胚轴上分三点注射。

[0015] 所述花生外植体为完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养5天左右后的小苗，切去下胚轴得到。

[0016] 所述完整胚的子叶在培养前需要做无菌处理。

[0017] 所述无菌处理的方法为将花生去壳，75％乙醇中放置1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，无菌水洗3次，放置无菌纸上至晾干。

[0018] 上述方法的应用，其特征在于，所述发根农杆菌中含有外源基因载体。

[0019] 所述外源基因载体中的基因为cry8Ea1或/和cry8Ha1。

[0020] 所述外源基因载体中基因的上游添加了Ω序列、Kozak序列，下游添加了内质网定位信号，其核苷酸序列如SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示；骨架载体为插入了两个MAR序列的基础载体pCAMBIA2300，其结构如图10所示；cry8Ea1或cry8Ha1基因由组成型启动子35S驱动。

[0021] 本发明采用发根农杆菌并利用微量注射方法诱导花生根系，得到了嵌合植株，同时对该体系的方法，进行了优化，以上胚轴为外植体微量注射方式侵染花生的方法，最大的转化效率为61％，同时验证了经密码子优化的cry8Ea1(SEQ ID NO1，公开见专利号：200410009808)和cry8Ha1(SEQ ID NO2，公开见专利号：200710120020)基因对暗黑鳃金龟幼虫的生物活性。

[0022] 本发明成功建立了花生根诱导体系，为外源基因导出花生植株，提供了快速验证方法，为进一步得到转基因花生植株提供了技术支持。

附图说明

[0023] 图1花生发状根的诱导

[0024] A：花生播种5天 B：上胚轴不同的点注射发根农杆菌 C：瘤状物 D：产生发状根 E：诱导的根系

[0025] 图2花生诱导根的RT-PCR鉴定

[0026] 图3花生组织GUS染色鉴定

[0027] A和B：上胚，C和D：上胚轴，E和F：根

[0028] A、C和E：注射发根农杆菌K599(pGFPGUSplus)

[0029] B、D和F：未接种发根农杆菌

[0030] 图4花生诱导根的Southern杂交

[0031] A：载体pGFPGUSplus B：诱导根Southern杂交

[0032] N：接种发根农杆菌(空菌)的诱导根GFP：pGFPGUSplus/EcoR I+Nco I[0033] P1/P2：接种发根农杆菌(pGFPGUSplus)的诱导根

[0034] 图5发根农杆菌K599生长曲线

[0035] 图6发根农杆菌活力对根诱导能力的影响

[0036] 图7不同共培养时间RT-PCR检测

[0037] M：DM2000 K：发根农杆菌K599(pGFPGUSplus) N：非转基因花生根

[0038] 图8不同共培养时间诱导根GUS染色鉴定

[0039] 图9乙酰丁香酮浓度对诱导根的影响

[0040] 图10基础载体pDMAR构建流程图

[0041] 图11烟草MAR序列及中间载体pRMAR的PCR及酶切鉴定

[0042] 1：DM2000，2：Negative control，3：MAR(primer：TMARF/R)，4：Negative control(ddH2O)，5：MAR+(primer MCF/TMARR)，6：pRMAR/Nco I，7：λDNA/Sty I[0043] 图12重叠PCR产物分析结果

[0044] 1：DM2000，2、4、6：Negative control(ddH2O)，3：EcoRVF fragment amplified by primer EcoR VF and Pme I R，5：EcoR VR fragment amplified by primer Pme I F and EcoRVR，7：EPme I fragment，8：λDNA/Sty I，

[0045] 图13中间载体pEPme I-RMAR的PCR及酶切鉴定

[0046] 1：DM2000 2：Negative control(ddH2O) 3：pEPme I-RMAR(primerEcoR VF/TMARR) 4：pEPme I/Pme I 5：MAR fragment(primer TMARF/R) 6：pEPme I-RMAR/Nco I 7：λDNA/Sty I

[0047] 图14植物表达载体pDMAR的PCR及酶切鉴定

[0048] 1：DM2000，2：Negative control(ddH2O)，3：pDMAR(primer EcoRVF/TMARR)，4：pEPme I-RMAR/EcoRV，5：pLMAR/EcoRV，6：pDMAR/EcoRV，7：λDNA/Sty I

[0049] 图15cry8类基因两侧Ω序列、Kozak序列和内质网定位信号的检测

[0050] 1：DM2000；2，4：Negative control(ddH2O)；3：cry8Ea1 fragment；5：cry8Ga1 fragment图16植物表达载体pDMARN的酶切分析

[0051] 1：λDNA/Sty I，2：T-Nos(EcoR I+Sac I)，3：pDMAR(EcoR I+Sac I)，4：pDMARN(EcoR I+Sac I)，5：DM2000

[0052] 图17植物表达载体pDMARSN的酶切分析

[0053] 1：DM2000，2：pG2AB4(Hind III+BamH I)3：pDMARN(Hind III+BamH I)，4：pDMARSN(Hind III+BamH I)，5：λDNA/Sty I

[0054] 图18植物表达载体pSN8E、pSN8H结构示意图

[0055] 图19植物表达载体pSN8E的PCR及酶切分析

[0056] 1：DM2000，2：Negative control(ddH2O)，3：pSN8E(rt8eF2/rt8eR2)，4：pSN8E(BamH I+Sac I)，5：T-8E(BamH I+Sac I)，6：pDMARSN(BamH I+Sac I)7：λDNA/Sty I[0057] 图20植物表达载体pSN8H的PCR及酶切分析

[0058] 1：DM2000，2：Negative control(ddH2O)，3：pSN8H(jc8HF/jc8HR)，4：T-8H(BamH I)，5：pDMARSN(BamH I+Kpn I)

[0059] 图21转pSN8E和pSN8H载体诱导根RT-PCR鉴定

[0060] M：DM2000 P：发根农杆菌(含有载体pSN8E或pSN8H) N：非转化根

[0061] 图22花生根系暗黑鳃金龟生物活性测定情况

[0062] A：含有cry8Ea1基因根系的嵌合植株 B：非转基因植株 C：存活暗黑鳃金龟幼虫[0063] 图23嵌合植株暗受黑鳃金龟幼虫危害情况

[0064] 图24转cry8Ea1、cry8Ha1基因嵌合植株危害统计结果

[0065] SE：含有cry8Ea1基因根系的嵌合植株 SH：含有cry8Ha1基因根系的嵌合植株 CK：未注射花生 CKA：注射发根农杆菌花生(无载体)

具体实施方式

[0066] LB固体培养基，LB液体培养基，

[0067] 共培养基为MS基础培养基，乙酰丁香酮的含量为5μmol l-1-100mol l-1。

[0068] 继代培养基为MS基础培养基。

[0069] 上述培养基可以是市售，也可以自行配制。

[0070] 载体pGFPGUSplus，发根农杆菌K599，保存在本申请人的实验室，可以对外界免费发放。pCAMBIA2300，市售。

[0071] 花生为市售的任一品种。

[0072] 1.发根农杆菌介导的微量注射方式侵染花生

[0073] 1)将花生去壳，75％乙醇中放置1min，弃乙醇，0.1％升汞中放置4min，无菌水洗3次，放置无菌纸上至晾干；

[0074] 2)用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，含有完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养5天左右；

[0075] 3)活化菌种：将保存的发根农杆菌K599(含有载体pGFPGUSplus)在含有链霉素、利福平、卡那霉素的抗生素的LB固体培养基上划线培养，30℃培养36小时，培养至长出单菌落；挑取单菌落至5mL含有有链霉素、利福平、卡那霉素的抗生素的LB液体培养基中，220rpm，30℃培养。

[0076] 4)花生小苗剪去下胚轴，用微量注射器取适量的发根农杆菌，在上胚轴上分3点注射；

[0077] 5)接菌的外植体放置到共培养培养基进行共培养；

[0078] 6)转移到继代培养基上，培养25天左右。

[0079] 花生种子表面消毒培养5天后(图1A)，去掉下胚轴，用微量注射器分3点接种发根农杆菌(图1B)。一周后有瘤状物的产生(图1C)，两周左右，有明显的诱导根产生(图1D)，25天后产生足够用于分子检测、鉴定及生物活性测定的诱导根系(图1E)。

[0080] 提取发状根的总RNA，经引物对actF/R和VirH/R检测，无扩增信号，排除了来自花生及发根农杆菌K599基因组的污染。反转录，合成cDNA，RT-PCR的结果显示，诱导根样品扩增得到600bp左右的条带，为gfp基因的扩增信号，而没有virH基因的扩增信号(图2)，表明没有来自发根农杆菌的污染，外源gfp基因在花生诱导根中能正常的转录。注射发根农杆菌(含有载体pGFPGUSplus)的花生上胚轴(图3A、C)及诱导根(图3E)经GUS染色后，有蓝点出现，而未注射发根农杆菌的负对照(图3B、D、F)没有GUS蓝点出现，表明外源的GUSplus基因在花生的上胚轴及诱导根中能表达有活性的蛋白。

[0081] 提取发状根的基因组，将扩增得到的600bp的gfp基因片段标记，进行Southern杂交，诱导根样品中的P1和P2有杂交信号出现，证明外源gfp基因整合到花生诱导根的基因组中。

[0082] 以上的结果分别从DNA、RNA及蛋白水平证明，通过发根农杆菌介导引入诱导根的外源基因能整合到基因组中，并能正常转录，表达为有活性的蛋白，用该体系将目的基因转入花生根系中是可行的。

[0083] 2.发根农杆菌介导花生遗传转化体系的优化

[0084] 2.1基因型对发根农杆菌根诱导能力的影响

[0085] 选取7种不同的花生品种分别接种了发根农杆菌，平均的发根天数都在11天左右，除了花育28所需的发根时间稍长，平均发根数在6～9个，花育28和新花1号的发根数则只有4～6个(表1)。虽然在发根天数和发根数上存在差异，所有7个测试的花生品种接种发根农杆菌后都能产生诱导根，初步说明发根农杆菌介导的花生遗传转化是不受受基因型的限制的。

[0086] 表1发根农杆菌对不同基因型花生根诱导能力的比较

[0087]

[0088] 注：含有相同字母的值差异不显著(P＜0.05)。

[0089] NC*：白沙1016注射ddH2O，作为负对照。

[0090] 2.2发根农杆菌活力及接种量对花生遗传转化效率的影响

[0091] 为了探讨发根农杆菌活力对花生遗传转化效率的影响，绘制了发根农杆菌的生长曲线(图5)。根据绘制的生长曲线分别在指数期(OD600＝0.2和0.8)、过渡期(OD600＝3.5)及平稳期(OD600＝5.0)取样，注射花生外植体。

[0092] 统计的发根天数和发根数的结果显示，随OD600的增加，发根数逐渐的减少，OD600为5.5时，几乎丧失了根诱导能力，平均的诱导根数仅为1.93个(图6)。指数期和过渡期的发根农杆菌诱导根所需的时间在9天左右，而平稳期的发根天数则明显的长于其他3个处理，在15天左右。RT-PCR检测结果显示，指数期的阳性率在20％以上(表2)，由于过渡期和平稳期产生诱导根的外植体较少，没有检测到阳性的样品，GUS阳性率的结果与RT-PCR的结果吻合。以上的结果表明，取自指数期的发根农杆菌根诱导能力优于过渡期和平稳期的菌。

[0093] 表2发根农杆菌活力对遗传转化效率的影响

[0094]

[0095] 但是指数期的转化率只有20％左右，比较低，可能是接种细胞数少造成的。取指数7 7 8 8
期的发根农杆菌，接种数量分别为10，5×10，1×10 或5×10 个细胞，考察接种量对发状根诱导的影响。结果显示4个处理发根数没有显著的差异，而发根天数随接种量的增加而
7
减少(表3)。当接种的细胞数为5×10 个细胞时，gfp基因的RT-PCR阳性率到达饱和，并
8
没有随接种量的增加继续增加。当接种的细胞数增加到10 个细胞时，除菌和抑菌就比较
7
困难，因此，确定5×10 个细胞为最佳接种量。

[0096] 表3发根农杆菌接种量对发状根诱导的影响

[0097]

[0098] 2.3共培养时间对发根农杆菌介导花生遗传转化效率的影响

[0099] 接种了发根农杆菌的外植体，分别共培养1、2、3和4天。共培养2天，外植体发根所需天数明显的比其他3个处理时间短，为5.73±1.78天；4个处理中，外植体发根数共培养2天时平均11个(表4)，与其他3个处理有显著的差异，多于其他处理。

[0100] 表4共培养时间对发状根诱导的影响

[0101]

[0102] 注：含有相同字母的值差异不显著(P＜0.05)。

[0103] NC*：白沙1016注射ddH2O，作为负对照。

[0104] 提取不同处理得到的诱导根的总RNA，RT-PCR检测的结果显示(图7)，共培养1天和2天得到的gfp基因为阳性的诱导根比较多。取4个处理的诱导根，GUS染色的结果(图8)与RT-PCR检测的结果基本一致。综合以上的结果，共培养2天的外植体平均在接种不到6天的时间开始产生诱导根，平均产生的诱导根平均为11个，gfp基因RT-PCR的阳性率和GUS阳性率都为52％(表5)，效率高于其他3个处理，确定为最佳的培养时间。

[0105] 表5共培养时间对转化效率的影响

[0106]

[0107] 2.4乙酰丁香酮对发根农杆菌介导花生遗传转化效率的影响

[0108] 共培养培养基中乙酰丁香酮浓度的设定了4个不同的浓度，其中乙酰丁香酮浓度-1为50μmol l 时，平均发根数为16.42个，显著多于其他处理(图9)。提取不同处理得到-1
的诱导根的总RNA，RT-PCR检测的结果显示，乙酰丁香酮浓度为50μmol l 时得到的gfp-1
基因为阳性的诱导根为47％(表6)，当乙酰丁香酮浓度达到100μmol l 时，转化效率反而降低。取4个处理的诱导根，GUS染色的结果与RT-PCR检测的结果基本一致，乙酰丁香-1
酮浓度为50μmol l 时GUS阳性率最高。综合以上的结果，共培养培养基中乙酰丁香酮的-1
最佳浓度为50μmol l 。

[0109] 表6乙酰丁香酮浓度对发状根诱导的影响

[0110]

[0111] 经过上述四种条件的探索，明确了最佳的转化条件如下：取指数期的发根农杆菌，接种量为每个外植体5×107个细胞，共培养2天，共培养培养基中乙酰丁香酮的浓度为50μmol l-1。在最适的转化条件下，转化效率达到61％(表7)。

[0112] 表7最佳转化条件下的转化效率

[0113]

[0114] 3.发根农杆菌介导的花生根诱导体系的应用

[0115] 3.1植物表达载体的构建

[0116] 烟草TobRB7基因3’非编码区发现了一段核基质附着序列(GenBank登录号：NTU67919)，克隆MAR序列，用于构建含顺式重复MAR序列的基础载体，避免外源基因由于位置效应导致的基因沉默。设计引物TMARF/R，序列如下：

[0117] TMARF：5’-CCATGGTCGATTAAAAATCCCAATT-3’

[0118] TMARR：5’-CCATGGACTATTTTCAGAAGAAGTT-3’

[0119] Nco I

[0120] 将克隆到的MAR序列添加到pCAMBIA2300的LB及RB附近，拟构建基础载体pDMAR，流程见图10。在上/下游引物TMARF/R中同时引入了的Nco I酶切位点，以提取的烟草基因组为模板，用KOD聚合酶扩增得到了1200bp左右的目的条带，结果见图11泳道3，回收。通过DNAMAN分析，pCAMBIA2300载体在右边界RB附近(8622bp)有Pme I酶切位点，因此，将回收的MAR序列与Pme I消化的pCAMBIA2300载体片段相连，得到pRMAR中间载体。pRMAR测序结果表明，得到的MAR片段与GenBank公布的序列比对完全一致，说明已经得到烟草核基质附着序列。为了进一步验证MAR片段插入的位置及方向是否正确，首先用限制性内切酶Nco I消化中间载体pLMAR，除载体骨架片段外，得到1200bp和1300bp的片段(图11泳道6)，前者与MAR片段大小一致，后者是载体骨架上含有的Nco I位点(7300bp)与MAR片段上的Nco I位点产生的1300bp的片段；然后在多克隆位点(MCS)设计了MCF引物(5’-CCTTTCGCCAGCTGGCGTAA-3’)，以载体pRMAR为模板，引物对MCF/TMARR扩增得到1300bp的目的条带(图11泳道5)。上述结果表明，中间载体pRMAR中MAR片段插入到pCAMBIA2300载体的8622bp处，得到在载体右边界附近添加了MAR序列的中间载体pRMAR。

[0121] 为了引入第二个MAR序列，在左臂(LB)附近6236bp的位置通过重叠PCR突变出一个Pme I，重叠PCR见图12。重叠PCR的扩增区域为5055bp到7463bp，将得到的2400bp片段与pMD19载体相连，得到的中间载体pEPme I用限制性内切酶Pme I消化后得到3600bp左右的片段，而且测序结果表明扩增的片段在设计的位置有Pme I酶切位点。将MAR片段与经Pme I消化的pEPme I载体片段相连，得到中间载体pEPme I-RMAR。PCR及酶切鉴定的结果表明，中间载体pEPme I-RMAR含有MAR片段(图13泳道5和6)，另一对的引物EcoRVF/TMARR扩增得到2400bp的目的条带(图13泳道3)，证明MAR以顺式方向插入载体。

[0122] EcoRVF：GATATCCTCCCTGATCGA(起始于pCAMBIA2300载体的5055bp位置)[0123] EcoRVR：GATATCTCCACTGACGTA(起始于pCAMBIA2300载体的7463bp位置)[0124] Pme I F：CGGACGTTTaaAcTGTAC

[0125] Pme I

[0126] Pme I R：GTACAGTTTaaAcGTCCG

[0127] 将中间载体pEPme I-RMAR用EcoRV消化，得到2400bp的载体片段和含有MAR片段的3600bp片段(图14泳道4)；载体pRMAR用EcoRV消化，得到7500bp的载体骨架片段和2400bp的片段(图14泳道5)。将含有MAR序列的片段与载体骨架片段相连，得到含有顺式重复MAR序列的植物表达载体pDMAR。PCR扩增结果得到2400bp的目的条带(图14泳道3)，EcoRV消化得到3600bp及7500bp的条带，证明植物表达载体pDMAR正确。

[0128] 通过PCR的方法，分别在优化后的cry8类基因上下游添加了Ω序列、Kozak序列和内质网定位信号，扩增cry8Ea1和cry8Ha1基因的引物序列分别为Omega1F/M8ER(KDEL)、Omega1F/Omega2F/Omega3F(8H)/MHR(KDEL)。将回收得到的2000bp的目的条带(图15)连接到pMD19载体上，测序正确，得到添加了表达元件的mcry8Ea1(SEQ ID NO3)和mcry8Ha1(SEQ ID NO4)片段。

[0129] Omega1F：GGATCCTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAAC

[0130] Omega2F：ACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTAC[0131] Omega3F(8H)：ATTACTATTTACAATTAC GAATCAGAAAGGGCGGCAGG

[0132] M8ER(KDEL)：GAGCTCTTATCA GGTACCAGACAGATCTCT

[0133] M8HR(KDEL)：GAGCTCTTATCA GAGCTCCAAGTTATTGAC

[0134] 注：下划线标识的是Ω序列，加粗标识的是Kozak序列，斜体的标识的是内质网定位信号。

[0135] 用EcoR I和Sac I同时消化载体T-Nos和含有顺式重复MAR序列的载体pDMAR，回收200bp的nos终止子片段(图16泳道2)和载体骨架片段(图16泳道3)，连接得到含有nos终止子的植物表达载体pDMARN，EcoR I和Sac I酶切鉴定得到的目的片段和原有大小相同(图16泳道4)。

[0136] 然后，在表达载体上添加组成型启动子35S。将含有35S启动子的载体和载体pDMARN同时用Hind III和BamH I消化后，回收800bp的35S启动子片段(图17泳道2)和载体骨架片段(图17泳道3)，连接得到含有35S启动子的植物表达载体pDMARSN，Hind III和BamH I酶切鉴定得到的目的片段和原有片段大小相同(图17泳道4)，至此获得了含有组成型启动子35S的植物表达载体。

[0137] 最后，将添加元件的cry8Ea1(专利号：200410009808)和cry8Ha1(专利号：200710120020)同时用BamH I和Sac I消化后，分别连接到由组成型启动子驱动的载体pDMARSN上，得到含cry8类基因的植物表达载体pSN8E和pSN8H(图18)，经PCR及酶切鉴定后正确(图19、20)。

[0138] 3.2含转基因根系嵌合植株的获得

[0139] 将对暗黑鳃金龟有特异杀虫活性的cry8Ea1、cry8Ha1基因导入到花生根系中，植物表达载体为pSN8E和pSN8H。切去下胚轴的花生小苗，分别注射含有植物表达载体pSN8E和pSN8H的发根农杆菌，25天后剪取根尖样品，提取总RNA。总RNA经检测引物actF/R、VirHF/R鉴定没有花生基因组和发根农杆菌污染，反转录后，RT-PCR鉴定，部分注射含有载体pSN8E发根农杆菌的诱导根能扩增得到490bp左右的目的条带，部分注射含有载体pSN8H发根农杆菌的诱导根能扩增得到600bp左右的目的条带，并且所有的样品都没有扩增到700bp的目的条带，证明没有发根农杆菌污染。共得到转pSN8E的阳性嵌合植株有21株，转pSN8H的阳性嵌合植株有33株(图21)。结果表明，经密码子改造的cry8Ea1和cry8Ha1基因植物表达载体，能导入花生根系，并在根系中正常的转录。

[0140] 3.3转cry8Ea1和cry8Ha1基因根系的生物活性测定

[0141] RT-PCR鉴定为阳性的嵌合植株移栽成活后，每盆接种初孵暗黑鳃金龟幼虫2头，接种幼虫的平均体重为14.2mg。30天后统计结果，转pSN8H载体的嵌合植株中有4株发现有存活的暗黑鳃金龟幼虫，其余的17株移栽盆内均未发现活虫，而非转基因对照植株都有存活的暗黑鳃金龟幼虫，并且体重平均增加了26倍(表8)。含转基因根系的嵌合植株地上部分生长旺盛，根系发达，而非转基因植株枯死，地下根系被严重破坏(图22)。

[0142] 表8转pSN8H载体诱导根生物活性鉴定

[0143]

[0144] 注：SHK为经RT-PCR鉴定cry8Ha1基因为阳性的嵌合植株，CK为注射ddH2O的对照植株，CKA为注射不含植物表达载体的发根农杆菌对照植株

[0145] 危害分级的结果显示，非转基因植株及注射空菌的对照植株危害等级都为2级，植株萎蔫，甚至死亡，根系全部被幼虫啃食；而转pSN8E和pSN8H载体的嵌合植株危害等级为2级的比例分别为6.3％和19.0％，分别有31.3％和14.3％的植株危害等级为1，地上部分正常生长，无明显危害状况，但根系不发达，大部分植株的危害等级为0级(图23)，分别占62.5％和66.7％(图24)。生测的结果表明，经密码子改造的cry8Ea1和cry8Ha1基因在花生根系中能表达为有活性的蛋白，对暗黑鳃金龟幼虫有较好的杀虫活性。