脐带血造血干细胞的增殖控制方法及其用途

摘要

本发明提供一种通过培养来自脐带血的造血干细胞而使其增殖时能以优异的安全性控制来自脐带血的造血干细胞的增殖和分化的方法。在含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中接种所述造血干细胞。这样，只要在所述经超声波处理的脐带血的液体成分存在下，就能够抑制脐带血造血干细胞的增殖和分化。另一方面，通过在含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中接种所述造血干细胞，则相反地能够促进脐带血造血干细胞的增殖。这样，根据本发明，通过使用来自脐带血的血清，能够对脐带血造血干细胞的增殖/分化的抑制以及增殖的促进进行任意调节。

权利要求

1.一种脐带血造血干细胞的增殖的控制方法，其特征在于，该方法包括下述(X)工序：

(X)通过在含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化的工序，所述超声波处理如下进行：在得到5mV以上的声压的条件下，使频率为28～100kHz，使至超声波产生装置的距离为5～30cm，使处理时间为5分钟～60分钟。

2.根据权利要求1所述的控制方法，该方法进一步包括下述(Y)工序：(Y)通过在含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而促进所述造血干细胞的增殖的工序。

3.根据权利要求2所述的控制方法，其中，

在所述(X)工序中，抑制所述造血干细胞的增殖和分化，然后，在所述(Y)工序中，促进通过所述(X)工序被抑制的所述造血干细胞的增殖。

4.根据权利要求2所述的控制方法，其中，

在所述(Y)工序中，促进所述造血干细胞的增殖，然后，在所述(X)工序中，抑制通过所述(Y)工序而增殖的所述造血干细胞的增殖和分化。

5.根据权利要求1所述的控制方法，其中，所述造血干细胞和所述液体成分为来自同一个体的脐带血的造血干细胞和液体成分。

6.根据权利要求5所述的控制方法，其中，所述个体为哺乳类。

7.根据权利要求6所述的控制方法，其中，所述哺乳类为人。

8.一种制造方法，其特征在于，其为脐带血造血干细胞的制造方法，该方法包括以下工序：

利用权利要求1所述的控制方法控制所述造血干细胞的增殖。

9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，将所述造血干细胞在所述含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养至期望使所述造血干细胞增殖的时期为止，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化。

10.根据权利要求8所述的制造方法，其中，在增殖所述造血干细胞后，将所述增殖后的造血干细胞在所述含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养至期望使用所述造血干细胞的时期为止，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化。

11.根据权利要求8所述的制造方法，其中，在含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而促进所述造血干细胞的增殖。

12.一种增殖控制剂，其特征在于，其为用于权利要求1所述的脐带血造血干细胞的增殖的控制方法的增殖控制剂，该增殖控制剂含有下述(a)的增殖抑制剂：

(a)含有经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于抑制所述造血干细胞的增殖和分化的增殖抑制剂，所述超声波处理如下进行：在得到5mV以上的声压的条件下，使频率为28～100kHz，使至超声波产生装置的距离为5～30cm，使处理时间为5分钟～60分钟。

13.根据权利要求12所述的增殖控制剂，其进一步含有下述(b)的增殖促进剂：(b)含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于促进所述造血干细胞的增殖的增殖促进剂。

14.一种增殖控制试剂盒，其特征在于，其为用于权利要求1所述的脐带血造血干细胞的增殖的控制方法的增殖控制试剂盒，该增殖控制试剂盒含有下述(a)的增殖抑制剂：

(a)含有经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于抑制所述造血干细胞的增殖和分化的增殖抑制剂，所述超声波处理如下进行：在得到5mV以上的声压的条件下，使频率为28～100kHz，使至超声波产生装置的距离为5～30cm，使处理时间为5分钟～60分钟。

15.根据权利要求14所述的增殖控制试剂盒，其进一步含有下述(b)的增殖促进剂：(b)含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于促进所述造血干细胞的增殖的增殖促进剂。

16.根据权利要求15所述的增殖控制试剂盒，其中，所述增殖抑制剂的液体成分和所述增殖促进剂的液体成分为来自同一个体的脐带血的液体成分。

17.根据权利要求14所述的增殖控制试剂盒，其为用于控制来自与所述液体成分同一个体的脐带血的造血干细胞的增殖的试剂盒。

18.根据权利要求16所述的增殖控制试剂盒，其中，所述个体为哺乳类。

19.根据权利要求18所述的增殖控制试剂盒，其中，所述哺乳类为人。

说明书

脐带血造血干细胞的增殖控制方法及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及控制来自脐带血的造血干细胞的增殖的方法及其用途，更详细地说，还涉及所述造血干细胞的制造方法、和用于该方法的增殖控制剂、增殖控制试剂盒以及脐带血成分制备装置。

背景技术

[0002] 造血干细胞是能够分化为白细胞、红细胞、血小板等所有血细胞系细胞的具有自我更新能力的多能干细胞，其存在于骨髓液、末梢血、脐带血中。另外已知，将造血干细胞移植到体内的造血干细胞移植作为白血病等难治愈性血液疾病的治疗方法非常有用。在治疗中通常使用骨髓液或末梢血的造血干细胞，但存在采集时对供体造成很大负担的问题。与此相对，脐带血是在分娩时附带获得的，因此供体的负担少，而且移植适应性也优异，所以作为造血干细胞的供给源而受到关注。

[0003] 但是，由供体获得的脐带血与骨髓液或末梢血相比量较少，有时无法得到移植所需要的细胞数。因此，为了将来自脐带血的造血干细胞用于移植，开发出了一种通过培养所述造血干细胞而使其增殖的方法。作为具体的方法，有文献报道了一种为了促进增殖而将所述造血干细胞与间充质干细胞或来自异种动物的支持细胞等共同培养的方法(专利文献1和专利文献2)。此外期望：所述造血干细胞的培养中，例如能够在所期望的时期之前抑制增殖或者抑制分化。因此，例如，有文献报道了将重组了分化抑制基因的病毒载体导入所述造血干细胞的方法等(专利文献3)。但是，导入病毒载体的方法例如可能会影响其他基因的表达，安全性可能不充分。另外，还存在操作繁杂、成本高昂的问题。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1：日本特开2006-61106号公报

[0007] 专利文献2：日本特开2007-202506号公报

[0008] 专利文献3：日本特开平11-127859号公报

发明内容

[0009] 发明要解决的问题

[0010] 因此，本发明的目的在于，提供一种通过培养来自脐带血的造血干细胞而使其增殖时能以优异的安全性控制来自脐带血的造血干细胞的增殖和分化的方法。

[0011] 用于解决问题的方案

[0012] 为了达到上述目的，本发明的脐带血造血干细胞的增殖的控制方法，其特征在于，该方法包括下述(X)工序：

[0013] (X)通过在含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化的工序。

[0014] 本发明的制造方法的特征在于，其为脐带血造血干细胞的制造方法，该方法包括利用本发明的控制方法来控制所述造血干细胞的增殖的工序。

[0015] 本发明的增殖控制剂的特征在于，其为用于本发明的控制方法的增殖控制剂，该增殖控制剂含有下述(a)的增殖抑制剂：

[0016] (a)含有经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于抑制所述造血干细胞的增殖和分化的增殖抑制剂。

[0017] 本发明的增殖控制试剂盒的特征在于，其为用于本发明的控制方法的增殖控制试剂盒，该增殖控制试剂盒含有所述(a)的增殖抑制剂。

[0018] 发明的效果

[0019] 如前所述，根据本发明，例如，可以不使用安全性存在问题的病毒载体，而使用所述来自脐带血的液体成分，从而控制脐带血造血干细胞的增殖和分化。具体地说，能够通过仅使用经超声波处理的脐带血的液体成分而抑制所述增殖和分化。因此，能够以非常优异的安全性、简便的操作调节增殖和分化。特别是，由于是脐带血的液体成分，因而例如能够使用来自与造血干细胞相同个体的脐带血的液体成分。因此，能够更有效地利用脐带血，而且能够并用同一个体的成分，因而也能够提高安全性方面的可靠性。这样，由于本发明能够抑制脐带血造血干细胞的增殖和分化，因而例如在将所述造血干细胞输送到目的地时，或者将所述造血干细胞保存至期望使其增殖的时期为止时等非常有用，可以称为再生医疗领域中能够更进一步促进脐带血造血干细胞的有效利用的方法。

附图说明

[0020] 图1为示出本发明的脐带血成分制备装置的一个例子的概况的平面图。

[0021] 图2为示出本发明的另一个脐带血成分制备装置的一个例子的概况的平面图。

[0022] 图3为示出本发明的另一个脐带血成分制备装置的一个例子的概况的平面图。

[0023] 图4为示出本发明的脐带血成分制备装置中的含细胞血浆容纳部的使用方法的一个例子的透视图。

[0024] 图5为示出本发明的脐带血成分制备装置中的另一个含细胞血浆容纳部的一个例子的平面图。

[0025] 图6为示出本发明的另一个脐带血成分制备装置的一个例子的概况的平面图。

[0026] 图7为示出实施例1中在血清存在下培养脐带血造血干细胞时的造血干细胞数的图表。

具体实施方式

[0027] <增殖控制方法>

[0028] 如上所述，本发明的控制方法的特征在于，其为控制脐带血造血干细胞的增殖的方法，该方法包括下述(X)工序：

[0029] (X)通过在含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化的工序。

[0030] 本发明中，以下也将所述经超声波处理的脐带血的液体成分称为“已处理的液体成分”。血液通常可以大致分为液体成分(液性组分)和细胞成分(细胞组分)，所述液体成分例如为血清或血浆，所述细胞成分例如为血细胞成分(血细胞组分)，可以举出红细胞、白细胞和血小板。本发明中，所述液体成分例如可以为血清，也可以为血浆。本发明中，所述培养基只要含有所述液体成分即可，其他构成没有任何限制。所述培养基中所含的脐带血的液体成分例如还可以含有所述细胞成分、凝血因子等来自脐带血的成分，优选为除去了所述细胞成分的液体成分、除去了所述凝血因子的液体成分、除去了所述细胞成分和所述凝血因子的液体成分。需要说明的是，所述细胞成分的除去和凝血因子的除去并不限定于将它们从脐带血中完全除去。所述凝血因子例如是指纤维蛋白原(I因子)、凝血酶原(II因子)等。

[0031] 本发明中，进行超声波处理的脐带血没有特别限定，例如，可以是脐带血本身，也可以是液体成分。以下，也将超声波处理前的液体成分称为“处理前液体成分”。作为所述液体成分，例如，可以举出血浆或血清。“血浆”通常是指从血液中除去了所述血细胞的液体组分，“血清”通常是指从血液中除去了所述血细胞和数种凝血因子的液体组分。在对所述液体成分实施超声波处理的情况下，所述液体成分例如可以是从脐带血中除去了所述血细胞成分的液体组分、从脐带血中除去了所述凝血因子的液体组分、从脐带血中除去了所述血细胞成分和所述凝血因子的液体组分中任一种，例如，优选为从脐带血中除去了所述血细胞成分的液体组分。另外，在对所述液体成分进行超声波处理的情况下，所述液体成分例如可以含有血小板，作为所述含有血小板的血浆，可以举出所谓的富血小板血浆(Platelet-Rich-Plasma)等。

[0032] 本发明中，所述已处理的液体成分例如可以通过在对脐带血本身进行超声波处理后回收液体成分而制备，也可以从脐带血回收液体成分，然后对其进行超声波处理而制备。另外，在从所述脐带血回收液体成分时，例如优选除了血细胞之外还要除去纤维蛋白原等凝血因子。

[0033] 本发明中，所述脐带血的液体成分(已处理的液体成分)例如优选为由经超声波处理的脐带血血浆得到的血清(已处理的血清)。

[0034] 本发明可进一步包括下述(Y)工序。

[0035] (Y)通过在含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而促进所述造血干细胞的增殖的工序。

[0036] 以下，也将所述未经超声波处理的脐带血的液体成分称为“非处理的液体成分”。与上述已处理的液体成分同样地，非处理的液体成分例如也可以举出血浆和血清等。

[0037] 本发明中，例如先进行抑制增殖和分化的(X)工序与促进增殖的(Y)工序中任一者均可。作为第一方式，例如，可以举出以下方法：首先，在所述(X)工序中，使用所述已处理的液体成分抑制所述造血干细胞的增殖和分化，然后在所述(Y)工序中，使用所述非处理的液体成分促进通过所述(X)工序被抑制的所述造血干细胞的增殖。根据该方式，能够抑制所述造血干细胞的增殖以及分化至所期望的时期为止，并且在所期望的时期开始所述造血干细胞的增殖。即，能够仅通过改变所使用的血清来容易地抑制所述造血干细胞的增殖的起始和停止。

[0038] 另外，作为第二方式，例如，可以举出以下方法：首先，在所述(Y)工序中，使用所述非处理的液体成分来促进所述造血干细胞的增殖，然后在所述(X)工序中，使用所述已处理的液体成分抑制通过所述(Y)工序而增殖的所述造血干细胞的增殖和分化。根据该方式，能够防止所增殖的所述造血干细胞的进一步增殖和分化直至所期望的时期，从而能够对其进行保存。

[0039] 本发明中，作为控制目标的造血干细胞来自脐带血，用于控制增殖的血清也来自脐带血。因此，本发明中，例如能够使用来自同一个体的脐带血造血干细胞和脐带血液体成分。具体地说，能够使用来自同一个体的脐带血的造血干细胞和已处理的液体成分抑制增殖和分化，此外，还能够使用来自同一个体的脐带血的非处理的液体成分促进增殖。因此，在脐带血成分中，不仅能够使用造血干细胞，而且还能够使用用于控制其增殖的液体成分，因而能够更有效地利用脐带血。

[0040] 作为所述个体，没有特别限定，例如，可以举出人、啮齿类、家畜类、除人之外的灵长类等哺乳类等。

[0041] 本发明中，造血干细胞的制备方法没有特别限定，可以采用现有公知的方法，以下示出一个例子，但不限于此。首先，使脐带血中的红细胞沉降，回收上清组分。脐带血为胎盘和脐带中所含的血液，通常，在医院中在分娩时和分娩后从胎盘和脐带中采集至含有抗凝血剂的采血袋内。在所述含有抗凝血剂的脐带血中添加用于分离红细胞的红细胞沉降剂。作为所述红细胞沉降剂，例如可以举出HES(羟乙基淀粉)等。所述红细胞沉降剂的添加量没有特别限定，例如，优选以1～50mg/mL的浓度添加到脐带血中。通过将所述添加了红细胞沉降剂的脐带血静置，分离为含有红细胞的组分和含有造血干细胞的上清组分。分离的条件没有特别限定，例如，温度为15～25℃。需要说明的是，例如，在所述脐带血预先含有所述红细胞沉降剂的情况下，也可以不添加所述红细胞沉降剂(以下相同)。

[0042] 接着，将所述上清组分离心分离，分离为含有造血干细胞的沉降组分和液体组分(上清组分)。离心分离的条件没有特别限定，例如，离心加速度为10780～43120m/2
s(1100～4400×g)、温度为2～37℃，时间为4～30分钟。需要说明的是，如上所述，本发明中优选使用来自同一个体的造血干细胞和液性组分。因此，如后所述，离心分离后的所述液体组分优选用于所述液体成分的制备。所述离心分离后的所述液体组分例如可以是含有血浆的组分(血浆组分)，也可以是含有血清的组分(血清组分)。另外，例如，如上所述，所述离心分离后的所述液体组分还可以含有血小板。如上所述，所述液体成分例如可以由含有血小板的液体成分制备，因而在回收所述沉降组分时，例如，可以在离心分离后的所述液体组分中含有血小板的条件下进行离心分离。该条件没有特别限定，例如，可以根据现有公知的富血小板血浆的回收方法进行，具体地说，例如，离心加速度为2940～11760m/
2
s(300～1200×g)、温度为1～20℃、时间为3～6分钟。

[0043] 接着，由所述沉降组分进行造血干细胞的纯化。具体地说，首先，在所述沉降组分中添加固定有抗CD34抗体的磁珠，使造血干细胞的CD34与所述磁珠的抗CD34抗体反应。通过该抗原抗体反应使所述造血干细胞与所述磁珠结合。接着，将所述添加了磁珠的沉降组分加样至磁性柱中，利用磁力将所述磁珠捕获至所述柱内，除去所述沉降组分中的不需要的成分。这样，能够制备纯化的造血干细胞。

[0044] 本发明中，来自脐带血的已处理的液体成分的制备方法没有特别限定。需要说明的是，本发明中，优选使用来自同一个体的脐带血的造血干细胞和液体成分，因此，以下作为一个例子，结合上述的造血干细胞的制备，对制备液体成分的方法进行说明。

[0045] 首先，如上所述，分离为含有造血干细胞的沉降组分和液体组分(上清组分)。如上所述，所述液体组分例如可以是所述血浆组分，也可以是血清组分。然后，对所述液体组分实施超声波处理。作为超声波处理的方法，没有特别限定，例如，可以举出以下方法。超声波处理的条件没有特别限定，例如，在当利用声压计测定其对于对象物体的超声波而得到5mV以上的声压的条件下，使频率例如为28～100kHz，使至超声波产生装置的距离例如为5～30cm，使处理时间例如为5分钟～60分钟、优选为10分钟～30分钟，从而进行超声波处理。另外，本发明中，例如可以使用通常的超声波产生装置来产生超声波。这样，可以获得所述已处理的液体成分。

[0046] 另外，例如在所述液体组分含有纤维蛋白原等凝血因子的情况下，例如，也可以进一步从所述液体组分中除去所述凝血因子，将所述除去后的液体组分作为所述已处理的液体成分。具体地说，例如在所述液体组分为含有所述凝血因子的血浆组分的情况下，优选除去所述凝血因子，回收血浆，将其作为所述已处理的液性组分而使用。所述凝血因子的除去例如可以在超声波处理之前进行，也可以在超声波处理之后进行。作为所述凝血因子的除去方法，没有特别限定，例如可以举出使纤维蛋白原等凝血因子变性从而作为不溶性组分而除去的方法。作为具体例子，例如可以举出通过纤维蛋白原的变性而形成纤维蛋白从而作为不溶性组分而除去的方法。所述变性方法没有特别限定，例如可以举出热变性，具体地说，可以举出对所述液体组分实施加热处理的方法。加热条件没有特别限定，例如，加热温度优选为50～60℃，加热时间优选为10～120分钟，更优选为30～60分钟。所述不溶性组分的除去例如可以通过将加热处理后的液体组分静置、离心或滤器过滤等而进行。然后，例如，通过回收静置后的上清组分、离心后的上清组分或滤器过滤后的滤液，从而得到所述已处理的液体成分。需要说明的是，静置、离心或滤器过滤等的条件没有任何限定，可以采用现有公知的条件。另外，作为从所述液体组分中除去凝血因子的方法，除此之外还可以举出例如对所述液体组分添加氯化钙、凝血酶等凝固因子等利用血液凝固系统的活化机制的方法。关于具体条件没有任何限定，可以采用现有公知的条件。

[0047] 另一方面，所述非处理的液体成分除了不进行所述超声波处理之外，例如可以与上述同样地制备。

[0048] 本发明中，所述(X)工序、即抑制造血干细胞的增殖和分化的工序，如上所述，可以通过在所述含有经超声波处理的液体成分血清的培养基中接种所述造血干细胞而进行。以下，作为具体例子，示出所述已处理的液体成分为已处理的血清的一个例子。需要说明的是，本发明不限于此，例如，同样也可以使用除血清之外的已处理的液体成分。

[0049] 作为所述培养基，只要含有所述已处理的血清即可，其他构成或条件没有任何限定。作为所述培养基，例如可以举出能够用于培养脐带血的造血干细胞的培养基，作为具体例子，可以使用伊思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)、X-VIVO培养基、STEM-LINE培养基等。所述培养基中的所述已处理的血清的浓度没有特别限定，例如为0.01～20v/v％，优选为0.1～10v/v％，更优选为2.5～10v/v％。每1mL所述培养基中的造血干细胞数例如为1000～10万个。所述培养基可以进一步含有添加物，作为所述添加物，例如可以举出细胞因子、抗生素、盐类、维生素等。

[0050] 在所述含有已处理的血清的培养基中接种的所述造血干细胞例如可以预先放置在使造血干细胞增殖时的一般性培养条件下。如上所述，根据本发明，所述培养基由于含有已处理的血清，因此即使通过培养也能够抑制其增殖和分化。作为所述培养时的温度，例如为37℃。另外，所述造血干细胞例如可以在相同的培养基中放置1～7天左右，但优选每1～7天更换为新的培养基。通过这样更换培养基，例如，可以在1～7天之间抑制所述造血干细胞的增殖和分化，进而通过后述的增殖的促进，还可以开始增殖。更换为新的培养基的方法没有任何限定，例如，如上所述，可以举出每隔规定时间更换培养基的方法、连续或断续地供给新培养基的方法等。在后者的情况下，例如，优选一并连续或断续地废弃部分旧培养基。

[0051] 本发明中，所述(Y)工序、即促进造血干细胞的增殖的工序，如上所述，可以通过在所述含有未经超声波处理的血清的培养基中接种所述造血干细胞而进行。以下，示出其具体例子，但本发明不限于此。

[0052] 作为所述培养基，除了含有所述非处理的血清代替所述已处理的血清以外，可以使用与上述同样的培养基。所述培养基中的所述非处理的血清的浓度没有特别限定，例如为0.01～20v/v％，优选为0.1～10v/v％，更优选为2.5～10v/v％。每1mL所述培养基中的造血干细胞数例如为1000～10万个。所述培养基可以进一步含有与上述同样的添加物，没有特别限定，与上述相同。

[0053] 在所述含有非处理的血清的培养基中接种的所述造血干细胞例如可以预先放置在使造血干细胞增殖时的一般性培养条件下。作为所述培养时的温度，例如为37℃。另外，所述造血干细胞例如可以在相同的培养基中放置1～7天左右，但优选每1～7天更换为新的培养基。若在所述含有非处理的血清的培养基中培养所述造血干细胞，则例如通过7天的培养，与初期接种数相比，能够将细胞数增加至约2～10倍。

[0054] 本发明中，例如在抑制增殖和分化的所述(X)工序之后进行所述(Y)工序时，即，抑制增殖和分化至所期望的时期为止然后从所期望的时期起促进增殖的情况下，只要由所述含有已处理的血清的培养基更换为所述含有非处理的血清的培养基即可。另一方面，例如在抑制增殖和分化的所述(X)工序之前进行所述(Y)工序时，即，使造血干细胞增殖，然后对已增殖的造血干细胞的分化以及进一步增殖进行抑制直至所期望的时期为止，这种情况下只要由所述含有非处理的血清的培养基更换为所述含有已处理的血清的培养基即可。需要说明的是，在重复所述(X)工序和所述(Y)工序时，如上所述，只要根据目的更换培养基即可。

[0055] <制造方法>

[0056] 接着，如上所述，本发明的制造方法的特征在于，其为脐带血造血干细胞的制造方法，该方法包括通过本发明的控制方法来控制脐带血造血干细胞的增殖的工序。

[0057] 本发明的特征在于，在造血干细胞的增殖和分化的抑制中使用本发明的控制方法，其他条件或构成没有任何限定。需要说明的是，只要没有特别说明，则可以与本发明的控制方法同样进行。

[0058] 本发明的制造方法中，作为抑制所述造血干细胞的增殖和分化的抑制工序，包括所述(X)工序，优选进一步包括促进所述造血干细胞的增殖的促进工序。所述促进工序例如为在含有血液的液体成分的培养基中接种脐带血造血干细胞从而促进所述造血干细胞的增殖的工序，优选为所述本发明的控制方法中的所述(Y)工序。

[0059] (X)通过在含有经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而抑制所述造血干细胞的增殖和分化的工序。

[0060] (Y)通过在含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的培养基中培养所述造血干细胞，从而促进所述造血干细胞的增殖的工序。

[0061] 本发明中，所述促进工序中使用的培养基没有特别限定，例如优选为含有液体成分的培养基。作为所述培养基的液体成分，没有特别限定，例如可以举出人脐带血血清、胎牛血清、人末梢血血清等。所述液体成分例如优选为未经超声波处理的液体成分，更优选为如上述的(Y)工序那样未经超声波处理的脐带血的液体成分，特别优选为与造血干细胞同样来自脐带血的非处理的液体成分。

[0062] 本发明中，与所述本发明的控制方法同样地，先进行所述抑制工序和所述促进增殖的工序中任一者均可。作为第一方式，例如，可以举出以下方法：首先，将所述造血干细胞接种在所述含有已处理的液体成分的培养基中至期望使造血干细胞增殖的时期为止，抑制所述造血干细胞的增殖和分化，在所述所期望的时期使所述造血干细胞开始增殖。另外，作为第二方式，例如，可以举出以下方法：首先，在增殖所述造血干细胞后，将所述增殖的造血干细胞接种在含有已处理的液体成分的培养基中至期望使用所述造血干细胞的时期为止，抑制所述造血干细胞的增殖和分化。需要说明的是，增殖和分化的抑制、以及增殖的促进例如能够与上述本发明的控制方法同样地进行转换，即，例如通过根据控制的目的更换所述含有已处理的液体成分的培养基和所述含有非处理的液体成分的培养基来进行转换。

[0063] 本发明中，与上述控制方法同样地，例如，优选使用来自同一个体的脐带血的造血干细胞和液体成分，具体地说，优选使用来自同一个体的脐带血的造血干细胞和已处理的液体成分来抑制增殖和分化，进而使用来自同一个体的脐带血的非处理的液体成分来促进增殖。作为所述个体，没有特别限定，例如可以举出人、除人之外的哺乳类等。

[0064] <增殖控制剂>

[0065] 本发明的增殖控制剂的特征在于，其为用于本发明的控制方法的增殖控制剂，该增殖控制剂含有下述(a)的增殖抑制剂：

[0066] (a)含有经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于抑制所述造血干细胞的增殖和分化的增殖抑制剂。

[0067] 本发明的增殖控制剂只要含有所述经超声波处理的脐带血血清即可，其他构成没有任何限定。本发明的增殖控制剂例如还可以用于本发明的脐带血造血干细胞的制造方法中。

[0068] 本发明的增殖控制剂还可以进一步含有下述(b)的增殖促进剂。需要说明的是，所述(a)的增殖抑制剂和所述(b)的增殖促进剂由于显示出抑制和促进这样的相反的作用，因而例如作为分别独立的试剂被包含在增殖控制剂中。

[0069] (b)含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于促进造血干细胞的增殖的增殖促进剂。

[0070] 本发明的增殖控制剂中，所述增殖抑制剂的液体成分和所述增殖促进剂的液体成分优选为来自同一个体的脐带血的液体成分。需要说明的是，本发明的增殖控制剂中，只要没有特别说明，则所述增殖抑制剂中的已处理的液体成分和所述增殖促进剂中的非处理的液体成分与上述相同。

[0071] <增殖控制试剂盒>

[0072] 本发明的增殖控制试剂盒的特征在于，其为用于本发明的控制方法的增殖控制试剂盒，该增殖控制试剂盒含有下述(a)的增殖抑制剂：

[0073] (a)含有经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于抑制所述造血干细胞的增殖和分化的增殖抑制剂。

[0074] 本发明的增殖控制试剂盒只要含有所述增殖抑制剂即可，所述增殖抑制剂与所述本发明的增殖控制剂中的相同。本发明的增殖控制试剂盒例如还可以用于本发明的脐带血造血干细胞的制造方法中。

[0075] 本发明的增殖控制试剂盒例如还可以进一步含有下述(b)的增殖促进剂。通过含有所述增殖促进剂，能够容易地进行脐带血造血干细胞的增殖的促进、以及增殖和分化的抑制。所述增殖促进剂与所述本发明的增殖控制剂中的相同。

[0076] (b)含有未经超声波处理的脐带血的液体成分的、用于促进造血干细胞的增殖的增殖促进剂。

[0077] 本发明的增殖控制试剂盒中，所述增殖抑制剂和所述增殖促进剂以相反的目的使用，因而优选收纳在分开的容器中。

[0078] <脐带血成分制备装置>

[0079] 本发明的脐带血成分制备装置在本发明的控制方法或本发明的制造方法中使用，用于由同一脐带血制备脐带血造血干细胞、经超声波处理的脐带血的液体成分和未经超声波处理的脐带血的液体成分。利用本发明的脐带血成分制备装置，能够在一个该装置中制备作为控制目标的脐带血造血干细胞、用于抑制增殖和分化的液体成分、以及用于促进增殖的液体成分。以下示出本发明的第1～第4脐带血成分制备装置。

[0080] 本发明的第1脐带血成分制备装置的特征在于，其具备：

[0081] 存积脐带血的存积部、

[0082] 容纳红细胞的红细胞容纳部、

[0083] 容纳造血干细胞的造血干细胞容纳部、

[0084] 容纳血浆的第1和第2血浆容纳部、及

[0085] 容纳血清的第1和第2血清容纳部，

[0086] 所述存积部与所述红细胞容纳部、所述造血干细胞容纳部、第1和第2血浆容纳部分别连接，

[0087] 所述第1血浆容纳部与所述第1血清容纳部连接，

[0088] 所述第2血浆容纳部与所述第2血清容纳部连接，

[0089] 所述存积部能够导入红细胞沉降剂，

[0090] 所述红细胞容纳部能够导入在所述存积部中由脐带血沉降的红细胞，[0091] 所述造血干细胞容纳部能够导入在所述存积部中由所述红细胞沉降后的上清沉降得到的造血干细胞，

[0092] 所述第1血浆容纳部和第2血浆容纳部分别能够导入所述存积部中的所述红细胞和造血干细胞沉降后的上清，

[0093] 所述第1血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行超声波处理和纤维蛋白形成处理，

[0094] 所述第1血清容纳部能够导入经超声波处理的血清，所述经超声波处理的血清为在所述第1血浆容纳部中由所述超声波处理和纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0095] 所述第2血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行纤维蛋白形成处理，[0096] 所述第2血清容纳部能够导入未经超声波处理的血清，所述未经超声波处理的血清为在所述第2血浆容纳部中由所述纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分。

[0097] 本发明的第2脐带血成分制备装置的特征在于，其具备：

[0098] 存积脐带血的存积部、

[0099] 容纳含有造血干细胞的血浆的含细胞血浆容纳部、

[0100] 容纳造血干细胞的造血干细胞容纳部、

[0101] 容纳血浆的第1和第2血浆容纳部、及

[0102] 容纳血清的第1和第2血清容纳部，

[0103] 所述存积部与所述含细胞血浆容纳部连接，

[0104] 所述含细胞血浆容纳部与所述造血干细胞容纳部、第1和第2血浆容纳部分别连接，

[0105] 所述第1血浆容纳部与所述第1血清容纳部连接，

[0106] 所述第2血浆容纳部与所述第2血清容纳部连接，

[0107] 所述存积部能够导入红细胞沉降剂，

[0108] 所述含细胞血浆容纳部能够导入所述含有造血干细胞的血浆，所述含有造血干细胞的血浆为在所述存积部中由脐带血沉降得到的含有红细胞的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0109] 所述造血干细胞容纳部能够导入在所述含细胞血浆容纳部中由所述含有造血干细胞的血浆沉降得到的造血干细胞，

[0110] 所述第1血浆容纳部和第2血浆容纳部分别能够导入所述含细胞血浆容纳部中的除去所述造血干细胞后的上清，

[0111] 所述第1血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行超声波处理和纤维蛋白形成处理，

[0112] 所述第1血清容纳部能够导入经超声波处理的血清，所述经超声波处理的血清为在所述第1血浆容纳部中由所述超声波处理和纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0113] 所述第2血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行纤维蛋白形成处理，[0114] 所述第2血清容纳部能够导入未经超声波处理的血清，所述未经超声波处理的血清为在所述第2血浆容纳部中由所述纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分。

[0115] 本发明的第3脐带血成分制备装置的特征在于，其具备：

[0116] 存积脐带血的存积部、

[0117] 容纳含有造血干细胞的血浆的含细胞血浆容纳部、

[0118] 容纳血浆的第1和第2血浆容纳部、及

[0119] 容纳血清的第1和第2血清容纳部，

[0120] 所述存积部与所述含细胞血浆容纳部连接，

[0121] 所述含细胞血浆容纳部与第1和第2血浆容纳部分别连接，

[0122] 所述第1血浆容纳部与所述第1血清容纳部连接，

[0123] 所述第2血浆容纳部与所述第2血清容纳部连接，

[0124] 所述存积部能够导入红细胞沉降剂，

[0125] 所述含细胞血浆容纳部能够导入所述含有造血干细胞的血浆组分，所述含有造血干细胞的血浆组分是在所述存积部中由脐带血沉降得到的含有红细胞的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，进而，将所导入的所述血浆组分分离为含有造血干细胞的沉降组分和上清组分后，能够隔离具有所述沉降组分的下部区域和具有所述上清组分的上部区域，

[0126] 所述含细胞血浆容纳部的下部区域成为造血干细胞的容纳部，

[0127] 所述第1血浆容纳部和第2血浆容纳部分别能够导入所述含细胞血浆容纳部的上部区域中的所述上清组分，

[0128] 所述第1血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行超声波处理和纤维蛋白形成处理，

[0129] 所述第1血清容纳部能够导入经超声波处理的血清组分，所述经超声波处理的血清组分是在所述第1血浆容纳部中由所述超声波处理和纤维蛋白形成处理后的上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0130] 所述第2血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行纤维蛋白形成处理，[0131] 所述第2血清容纳部能够导入未经超声波处理的血清，所述未经超声波处理的血清为在所述第2血浆容纳部中由所述纤维蛋白形成处理后的上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分。

[0132] 本发明的第4脐带血成分制备装置的特征在于，其具备：

[0133] 存积脐带血的第1和第2存积部、

[0134] 容纳红细胞的红细胞容纳部、

[0135] 容纳造血干细胞的造血干细胞容纳部、

[0136] 容纳血浆的第1和第2血浆容纳部、及

[0137] 容纳血清的第1、第2和第3血清容纳部，

[0138] 所述第1存积部与所述红细胞容纳部、所述造血干细胞容纳部、第1和第2血浆容纳部分别连接，

[0139] 所述第1血浆容纳部与所述第1血清容纳部连接，

[0140] 所述第2血浆容纳部与所述第2血清容纳部连接，

[0141] 所述第1存积部能够导入抗凝血剂和红细胞沉降剂，

[0142] 所述红细胞容纳部能够导入在所述存积部中由脐带血沉降得到的红细胞，[0143] 所述造血干细胞容纳部能够导入在所述存积部中由所述红细胞沉降后的上清沉降得到的造血干细胞，

[0144] 所述第1血浆容纳部和第2血浆容纳部分别能够导入所述存积部中的所述红细胞和造血干细胞沉降后的上清，

[0145] 所述第1血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行超声波处理和纤维蛋白形成处理，

[0146] 所述第1血清容纳部能够导入经超声波处理的血清，所述经超声波处理的血清为在所述第1血浆容纳部中由所述超声波处理和纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0147] 所述第2血浆容纳部能够对所导入的所述上清进行纤维蛋白形成处理，[0148] 所述第2血清容纳部能够导入未经超声波处理的血清，所述未经超声波处理的血清为在所述第2血浆容纳部中由所述纤维蛋白形成处理后的所述上清得到的沉降组分和上清组分中的所述上清组分，

[0149] 所述第2存积部与所述第3血清容纳部连接，

[0150] 所述第2存积部能够导入促进血液凝固的血液凝固促进个体，

[0151] 所述第3血清容纳部能够导入在所述第2存积部中在血液凝固后得到的上清组分。

[0152] 本发明中，所述存积部和各种容纳部优选分别以气密状态连接。由此，例如，能够将本发明的装置的内部维持为无菌状态，例如，在导入脐带血以后，可以通过不接触外部大气的方式进行一系列的操作。另外，通过以气密状态连接，例如还能够维持液体密封状态。

[0153] 所述存积部和各种容纳部例如优选由挠性材料形成。作为所述挠性材料，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚烯烃；软质聚氯乙烯等聚氯乙烯；聚乙烯醇；乙烯-乙酸乙烯酯共聚树脂；硅酮；聚氨酯；尼龙等树脂。另外，例如从卫生方面出发，本发明的脐带血成分制备装置优选能够进行灭菌处理，而且如后所述，所述各血浆容纳部例如有时要实施加热处理作为所述纤维蛋白形成处理。因此，作为所述挠性材料，优选兼具耐热性。

[0154] 作为第1血浆容纳部和第2血浆容纳部中的所述纤维蛋白形成处理，没有特别限定，例如可以举出对所述血浆容纳部进行的加热处理、对所述血浆容纳部进行的血液凝固用试剂的导入处理。在前者的情况下，各血浆容纳部例如能够对所导入的所述上清进行加热处理，在后者的情况下，例如能够导入所述血液凝固用试剂即可。所述血液凝固用试剂例如可以预先容纳在各血浆容纳部中，也可以在使用时由外部导入。需要说明的是，本发明的第1和第2血浆容纳部中的所述纤维蛋白形成处理例如优选为加热处理。

[0155] 所述存积部和各种容纳部的形态没有特别限定，从操作性优异的方面出发，例如优选为袋。所述袋例如可以通过将2个挠性树脂制的片材重叠并将其周围的边缘部(密封部)粘接而形成。粘接的形态没有特别限定，例如，可以是热熔接、高频熔接等熔接，也可以举出利用粘接剂等的粘接等。

[0156] 所述存积部和各种容纳部的大小没有特别限定。所述存积部的容量例如优选为50～400mL，向所述存积部内导入的脐带血的量例如优选为所述存积部的容量的40～80体积％。所述各种容纳部的容量例如可以根据所述存积部中能够导入的脐带血量而适当决定，优选为25～200mL，另外，优选为所述存积部的容量的30～70体积％。所述存积部和各种容纳部例如可以在内部含有空气，但优选其含量尽可能少。所述第4脐带血成分制备装置中，第1存积部的容量例如与上述相同，第2存积部例如优选为10～80体积％，所导入的脐带血的量例如优选为第2存积部的容量的40～80体积％。

[0157] 所述存积部和各种容纳部例如优选用管进行连接。所述管例如优选由挠性材料形成。另外，如后所述，优选在关闭管的流路的状态下从脐带血成分制备装置拆卸造血干细胞容纳部12、第1血清容纳部13b和第2血清容纳部14b。因此，所述管例如优选由能够通过加热熔融等熔断的材质形成。作为这样的材料，例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯等聚烯烃；软质聚氯乙烯等聚氯乙烯；聚乙烯醇；乙烯-乙酸乙烯酯共聚树脂；硅酮；聚氨酯；尼龙等。另外，本发明的脐带血成分制备装置例如优选适当具有能够关闭和开通管的流路的构件。作为所述构件，例如可以举出夹具(clamp)、夹钳(Klemme)等夹持构件。通过用所述夹持构件适当地夹住各管，能够切换所述存积部与各种容纳部之间、或各种容纳部间的流路。另外，作为进行所述流路的开闭的所述构件，除此之外例如还可以使用阀等。所述阀例如可以配置于管的途中，也可以设置于后述那样的管间的分支部。另外，后述那样的分支连接器也可以兼具阀。

[0158] 在所述第1和第3脐带血成分制备装置中，例如从患者直接导入脐带血时，所述存积部可以进一步含有抗凝血剂，也可以能够导入所述抗凝血剂。在后者的情况下，例如，优选在将脐带血导入所述存积部之前将所述抗凝血剂导入所述存积部内。作为所述抗凝血剂，没有特别限定，例如可以举出CPD溶液(柠檬酸磷酸葡萄糖溶液)、ACD-A溶液(酸性柠檬酸葡萄糖A溶液)等。所述抗凝血剂的量没有特别限定，例如，可以根据所述存积部的体积、导入所述存积部的脐带血的体积等决定。所述抗凝血剂的添加量例如相对于所导入的脐带血优选为30～100体积％。另外，在第4脐带血成分制备装置中，所述第1存积部如上所述能够导入抗凝血剂，第2存积部不需要导入抗凝血剂。

[0159] 在第1～第3脐带血成分制备装置中，所述存积部例如可以预先容纳红细胞沉降剂，也可以从外部导入红细胞沉降剂。另外，例如在导入含有红细胞沉降剂的脐带血时，所述存积部可以不容纳或导入红细胞沉降剂。

[0160] 本发明的脐带血成分制备装置例如不仅可以用于由人的脐带血进行成分制备，还可以用于由啮齿类、家畜类、灵长类等哺乳类的脐带血进行成分制备。

[0161] (第1实施方式)

[0162] 接着，利用图1对本发明的第1脐带血成分制备装置的一个例子进行说明。需要说明的是，本发明不限于此。

[0163] 图1为示出本实施方式中的脐带血成分制备装置的概况的平面图。脐带血成分制备装置1具备存积脐带血的存积部10、容纳红细胞的红细胞容纳部11、容纳造血干细胞的造血干细胞容纳部12、容纳血浆的第1血浆容纳部13a和第2血浆容纳部14a、以及容纳血清的第1血清容纳部13b和第2血清容纳部14b。在该图的存积部10和各容纳部11～14b中，虚线的内部为能够容纳各种成分的空间，虚线与外框实线之间为密封部。存积部10具备2个导入口15a、15b和2个导出口16c、16f。存积部10的左侧的导入口15a为脐带血的导入口，且与管18a的一端连接，管18a的另一端为与脐带血袋连接的连接部9，例如能够连接穿刺针等，在使用前用帽(cap)等罩住。存积部10的右侧的导入口15b为红细胞沉降剂的导入口，且与管18b的一端连接，管18b的另一端为与红细胞沉降剂的容纳器连接的连接部9，在使用前用帽等罩住。另外，存积部10的下方的导出口16c为由脐带血沉降得到的红细胞和造血干细胞的导出口，且与管18c的一端连接，上方的导出口16f为除去了红细胞和造血干细胞后的血浆的导出口，且与管18f的一端连接。红细胞容纳部11具备由脐带血沉降得到的红细胞的导入口15d，导入口15d与管18d的一端连接，造血干细胞容纳部12具备由脐带血沉降的造血干细胞的导入口15e，导入口15e与管18e的一端连接。与存积部10连接的管18c、与红细胞容纳部11连接的管18d、和与造血干细胞容纳部12连接的管18e的各自的另一端通过分支连接器19而连通。第1血浆容纳部13a具备除去了红细胞和造血干细胞后的血浆的导入口15g、以及血清的导出口16i，导入口15g与管18g的一端连接，导出口16i与管18i的一端连接。另一方面，第2血浆容纳部14a也同样地具备除去了红细胞和造血干细胞后的血浆的导入口15h、以及血清的导出口16k，导入口15h与管
18h的一端连接，导出口16k与管18k的一端连接。与存积部10连接的管18f、与第1血浆容纳部13a连接的管18g、和与第2血浆容纳部14a连接的管18h的各自的另一端通过分支连接器19而连通。此外，第1血清容纳部13b具备血清的导入口15i，导入口15i连接着与第1血浆容纳部13a连接的管18i的另一端。另外，第2血清容纳部14b具备血清的导入口15k，导入口15k连接着与第2血浆容纳部14a连接的管18k的另一端。

[0164] 脐带血成分制备装置1例如优选具备用于夹住管的夹具等夹持构件(未图示)。所述夹持构件例如优选设置于连接存积部10和各种容纳部11、12、13a、14a的管、以及连接血浆容纳部13a、14a和血清容纳部13b、14b的管上。由此，能够切换成所期望的流路。

[0165] 在第1血浆容纳部13a与第1血清容纳部13b之间(例如管18i)、第2血浆容纳部14a与第2血清容纳部14b之间(例如管18k)例如可以存在用于除去残存的红细胞等的滤器。另外，与第2血浆容纳部14a连接的管18h中也可以存在滤器。

[0166] 各容纳部例如可以具备能够开口的导出口17。如该图所示，例如在分离脐带血的各种成分时，导出口17的开口优选被闭塞。并且，在将各容纳部中容纳的各种成分导出至外部时，通过拆卸所述闭塞部，能够从开口的导出部17中导出内部的成分。另外，例如也可以在闭塞的导出部17插入采集针，通过所述采集针导出内部的成分。

[0167] 举出一个例子，对使用本实施方式的脐带血成分制备装置1由脐带血制备造血干细胞、经超声波处理的血清(已处理的血清)和未经超声波处理的血清(非处理的血清)的方法进行说明。需要说明的是，只要没有特别说明，则具体的处理条件可以与上述同样设定。

[0168] 首先，准备脐带血。在人脐带血的情况下，例如，可以以容纳在血液袋中的状态获得。所述容纳在血液袋中的人脐带血通常含有抗凝血剂。将该血液袋连接到与存积部10连接的管18a的一端，将脐带血导入存积部10。通过在管18a前端的连接部9安装例如采血针，并将所述采血针插入所述血液袋中，则可以将脐带血导入存积部10。此处，优选通过夹具在存积部10附近关闭管18c的流路，使得存积部10内的脐带血不从下部的导出口16c流入管18c、18d、18e、红细胞容纳部11和造血干细胞容纳部12中。另外，在将脐带血导入存积部10后，脐带血导入用的管18a例如可以在前端覆住帽，也可以使用密封器等在所期望的部位熔断。此外，也可以通过安装在管18a前端的采血针直接从患者回收脐带血并直接回收至存积部10。这样，在直接从患者回收脐带血至存积部10的情况下，存积部10例如可以在内部预先容纳抗凝血剂。另外，例如，可以在导入脐带血之前，通过与存积部10连接的管18b向存积部10导入抗凝血剂。

[0169] 接着，通过与存积部10连接的管18b，向存积部10内导入红细胞沉降剂，将脐带血和所述红细胞沉降剂混合后，使存积部10静置。然后，在存积部10内，所述脐带血分离为红细胞组分和上清组分后，通过存积部10下部的管18c和18d将沉降的红细胞组分导入红细胞容纳部11中。此时，为了防止将红细胞组分导入造血干细胞容纳部12，优选利用夹具在分支连接器19附近关闭与造血干细胞容纳部12连接的管18e的流路，然后解除夹具对管18c的流路的关闭。由此，从存积部10向红细胞容纳部11的流路被连通，能够将红细胞组分导入红细胞容纳部11中。需要说明的是，在将红细胞组分导入红细胞容纳部11中后，优选再次利用夹具在存积部10附近关闭管18c的流路。

[0170] 这样，在导出红细胞组分后，将存积部10置于离心分离机，分离为含有造血干细胞的沉降组分和含有血浆的上清组分。此时，离心分离的条件如上所述。

[0171] 然后，通过存积部10的下部的管18c和18e，将沉降的造血干细胞组分导入造血干细胞容纳部12中。此时，为了防止将造血干细胞组分导入红细胞容纳部11中，优选利用夹具在分支连接器19附近关闭与红细胞容纳部11连接的管18d的流路，然后解除夹具对管18c的流路的关闭。需要说明的是，在将造血干细胞组分导入造血干细胞容纳部12中后，优选再次利用夹具在存积部10附近关闭管18c的流路。另外，也可以使用密封器等在所期望的部位熔断管18c或导入口15e。由此，可以从脐带血成分制备装置1获得容纳了造血干细胞组分的密闭状态的造血干细胞容纳袋。例如通过切断导出口17的闭塞部，或者在闭塞的导出口17扎入采集针，能够从内部取出所述袋内的造血干细胞。

[0172] 另一方面，通过管18f、18g、18h，将存积部10中残存的血浆组分分注到第1血浆容纳部13a和第2血浆容纳部14a中。在向第1血浆容纳部13a和第2血浆容纳部14a中依次导入血浆组分时，例如优选在分支连接器19附近关闭与第2血浆容纳部14a连接的管18h的流路，将血浆组分导入第1血浆容纳部13a中，接着，在分支连接器19附近关闭与第
1血浆容纳部13a连接的管18g的流路，然后解除夹具对管18h的流路的关闭，将血浆组分导入第2血浆容纳部14a中。

[0173] 接着，对第1血浆容纳部13a实施超声波处理。超声波处理例如可以如下进行：将所述血浆容纳部和振子浸渍于浴槽内的液体中，由所述振子输出超声波，从而进行处理。接着，对第1血浆容纳部13a实施加热处理。通过加热处理，在所述血浆组分中由纤维蛋白原形成纤维蛋白。所述加热处理例如可以通过将第1血浆容纳部13a浸渍到浴槽内的加热液体中而进行。然后，将加热处理后的第1血浆容纳部13a置于离心分离机，分离为含有所形成的纤维蛋白、血小板等的沉降组分以及含有血清的上清组分。通过连接第1血浆容纳部13a和第1血清容纳部13b的管18i将该上清组分导入第1血清容纳部13b中。这样，能够回收经超声波处理的血清。优选在将第1血浆容纳部13a内的上清组分导入第1血清容纳部13b时，防止混入沉降组分。此时，例如可以举出以下方法：利用夹具等从第1血浆容纳部13a的外部夹住上清组分和沉降组分的边界，从而进行分离。

[0174] 另一方面，不对第2血浆容纳部14a实施超声波处理，但除去血小板，除此之外同样地实施加热处理。第2血浆容纳部14a的加热处理例如可以与第1血浆容纳部13a的加热处理同时进行。接着，将加热处理后的所述第2血浆容纳部14a置于离心分离机，分离为含有所形成的纤维蛋白原、血小板等的沉降组分以及含有血清的上清组分。通过连接第2血浆容纳部14a和第2血清容纳部14b的管18k将该上清组分导入第2血清容纳部14b中。这样，能够回收未经超声波处理的血清。

[0175] 对于第1血清容纳部13b和第2血清容纳部14b，例如可以使用密封器等将管18i或导入口15i、和管18k或导入口15k在所期望的部位熔断。由此，可以从脐带血成分制备装置1中得到容纳了已处理的血清的密闭状态的血清容纳袋和容纳了非处理的血清的密闭状态的血清容纳袋。例如通过切断导出口17的闭塞部，或者在闭塞的导出口17扎入采集针，能够从内部取出所述袋内的血清。

[0176] 如此获得的容纳了造血干细胞的造血干细胞袋、容纳了已处理的血清的血清袋和容纳了非处理的血清的血清袋例如可以通过冷冻保存等方式保存至使用前。另外，在冷冻保存时，可以将目标成分分别容纳于造血干细胞容纳部12、第1血清容纳部13b和第2血清容纳部14b中后，例如通过所连接的任意的管将冷冻保护剂导入内部，然后熔断所述管。

[0177] 另外，在本发明的实施方式中，如上所述，在从血浆中除去纤维蛋白原而回收血清时，还可以利用血液凝固系统的活化机制来代替所述加热处理。此时，如上所述，优选在对第1血浆容纳部13a实施超声波处理后，在第1血浆容纳部13a中进一步添加血液凝固用试剂。所述血液凝固用试剂例如可以举出上述那样的凝血酶等凝固因子等，在所述脐带血含有抗凝血剂的情况下，所述血液凝固用试剂优选例如进一步含有氯化钙等中和剂。通过这样添加血液凝固用试剂，在血浆中由纤维蛋白原形成纤维蛋白，因此之后只要与上述同样地进行离心分离即可。需要说明的是，对于所述血液凝固用试剂，例如可以将凝血酶等凝固因子和中和剂同时添加到所述血浆中，也可以在添加所述中和剂后添加所述凝固因子。为这样的形态时，第1血浆容纳部13a优选具备所述血液凝固用试剂的导入口。所述导入口例如与管的一端连接，所述管的另一端为与所述血液凝固用试剂的容纳部连接的连接部，优选在使用前用帽等罩住。另外，第2血浆容纳部14a也同样地优选添加所述血液凝固用试剂来代替加热处理。另外，第2血浆容纳部14a也同样地优选具备所述血液凝固用试剂的导入口。所述导入口例如与管的一端连接，所述管的另一端为与所述血液凝固用试剂的容纳部连接的连接部，优选在使用前用帽等罩住。

[0178] (第2实施方式)

[0179] 接着，利用图2对本发明的第2脐带血成分制备装置的一个例子进行说明。该图中，在与图1同样的部位附加了同样的符号。另外，只要没有特别说明，则与所述第1脐带血制备装置相同。需要说明的是，只要没有特别说明，则本发明不限于此。

[0180] 图2为示出本实施方式中的脐带血成分制备装置的概况的平面图。脐带血成分制备装置2具备存积脐带血的存积部10、容纳除去红细胞后的含有造血干细胞的血浆的含细胞血浆容纳部20、容纳造血干细胞的造血干细胞容纳部12、容纳血浆的第1血浆容纳部13a和第2血浆容纳部14a以及容纳血清的第1血清容纳部13b和第2血清容纳部14b。存积部10具备2个导入口15a、15b和导出口16f。存积部10的左侧的导入口15a为脐带血的导入口，且与管18a的一端连接，管18a的另一端为与脐带血袋连接的连接部9。存积部10的右侧的导入口15b为红细胞沉降剂的导入口，且与管18b的一端连接，管18b的另一端为与红细胞沉降剂的容纳器连接的连接部9。另外，存积部10的上方的导出口16f为除去红细胞后的含有造血干细胞的血浆的导出口，且与管21a的一端连接。含细胞血浆容纳部20具备导入口25b和导出口26c。上部的导入口25b为含有造血干细胞的血浆的导入口，且与管21b的一端连接。与含细胞血浆容纳部20连接的管21b的另一端通过分支连接器19连接着与存积部10连接的管21a的另一端以及管21d的一端。管21d的另一端通过分支连接器19连接着与第1和第2血浆容纳部13a、14a连接的管18g、18h的一端。

[0181] 脐带血成分制备装置2例如优选具备用于夹住管的夹具等夹持构件(未图示)。所述夹持构件例如优选设置于连接存积部10和含细胞血浆容纳部20的管21a、管21d；连接含细胞血浆容纳部20和造血干细胞容纳部12的管21c；从分支连接器19与血浆容纳部
13a、14a连接的管18g、18h；连接血浆容纳部13a、14a和血清容纳部13b、14b的管18i、18k等。

[0182] 举出一个例子，对使用本实施方式的脐带血成分制备装置2由脐带血制备造血干细胞、已处理的血清和非处理的血清的方法进行说明。需要说明的是，只要没有特别说明，则具体的处理条件可以与上述同样设定。

[0183] 与上述同样地将存积部10内的脐带血分离为红细胞组分和上清组分后，通过存积部10上部的管21a和21b将所述上清组分导入含细胞血浆容纳部20中。所述上清组分为含有造血干细胞的血浆组分。此时，为了防止将所述上清组分导入至各血浆容纳部13a、14a中，优选利用夹具在与管21b连接的分支连接器19附近关闭管21d的流路。另外，为了防止向含细胞血浆容纳部20中导入的所述上清组分被导入至造血干细胞容纳部12中，优选利用夹具在导出口26c附近关闭管21c的流路。

[0184] 接着，将含细胞血浆容纳部20置于离心分离机，分离为含有造血干细胞的沉降组分和含有血浆的上清组分。此时，如上所述，离心分离的条件优选设为使上清组分中含有血小板的条件。

[0185] 然后，通过含细胞血浆容纳部20的下部的管21c将含有造血干细胞的沉降组分导入造血干细胞容纳部12中。优选导入造血干细胞后，利用夹具关闭连接含细胞血浆容纳部20和造血干细胞容纳部12的管21c的流路。

[0186] 另一方面，通过管21b、21d、18g、18h将含细胞血浆容纳部20中残存的血浆组分分注于第1血浆容纳部13a和第2血浆容纳部14a中。此时，为了防止将血浆组分导入至存积部10中，优选利用夹具在分支连接器19附近关闭与存积部10连接的管21a的流路。然后，对于所分注的血浆，与上述同样地进行处理，制备血清。

[0187] (第3实施方式)

[0188] 接着，利用图3对本发明的第3脐带血成分制备装置的一个例子进行说明。该图中，在与图1和图2同样的部位附加了同样的符号。另外，只要没有特别说明，则与所述第1和第2脐带血成分制备装置相同。需要说明的是，只要没有特别说明，则本发明不限于此。

[0189] 图3为示出本实施方式中的脐带血成分制备装置的概况的平面图。脐带血成分制备装置3除了具备能够隔离的含细胞血浆容纳部30来代替图2中的含细胞血浆容纳部20和造血干细胞容纳部12之外，与上述第2脐带血成分制备装置相同。含细胞血浆容纳部30能够导入所述含有造血干细胞的血浆组分，所述含有造血干细胞的血浆组分是在存积部10中由脐带血沉降得到的含有红细胞的沉降组分和上清组分中的所述上清组分。并且，含细胞血浆容纳部30在将所导入的所述血浆组分分离为含有造血干细胞的沉降组分和上清组分后，还能够隔离具有所述沉降组分的下部区域30b和具有所述上清组分的上部区域30a。

[0190] 在向含细胞血浆容纳部30中导入除去红细胞后的含有造血干细胞的血浆后，将含细胞血浆容纳部30置于离心分离机，使其分离为含有造血干细胞的沉降组分和含有血浆的上清组分。分离后，利用夹持构件从含细胞血浆容纳部30的外部夹住具有沉降组分的下部区域30b与含有上清组分的上部区域30a的边界，从而隔离所述两个区域。具体地说，例如，如图4所示，利用夹具40夹住含细胞血浆容纳部30的上部区域30a与下部区域30b的边界X。

[0191] 然后，将上部区域30a中容纳的上清组分导出至血浆容纳部13a、14a中，与上述同样地制备血清。另一方面，导出上清组分后的含细胞血浆容纳部30(下部区域30b)成为造血干细胞的容纳部。

[0192] 在第3脐带血成分制备装置3中，作为含细胞血浆容纳部，例如，可以是图5所示的含细胞血浆容纳部50。如该图所示，为了使沉降的红细胞容易向下部区域50b移动，含细胞血浆容纳部50的上部区域50a的下部为锥形。

[0193] (第4实施方式)

[0194] 接着，对本发明的第4脐带血成分制备装置进行说明。本发明的第4脐带血成分制备装置例如为在导入不含血液凝固剂的未凝固的脐带血从而制备各种成分时使用的装置。所述不含血液凝固剂的未凝固的脐带血通常是指直接从患者导入的脐带血。利用本实施方式的脐带血成分制备装置，除了上述的脐带血干细胞、已处理的血清和非处理的血清之外，还可以通过促进血液凝固的血液凝固促进个体得到血小板被活化的血清。

[0195] 利用图6对本发明的第4脐带血成分制备装置的一个例子进行说明。该图中，在与图1～图5同样的部位附加了同样的符号。另外，只要没有特别说明，则与所述第1～第3脐带血成分制备装置相同。需要说明的是，只要没有特别说明，则本发明不限于此。

[0196] 图6为示出本实施方式中的脐带血成分制备装置的概况的平面图。脐带血成分制备装置6为在例示出所述第1实施方式的图1的脐带血成分制备装置中进一步具备存积脐带血的第2存积部60和第3血清容纳部61b。需要说明的是，在本实施方式中，图1中的存积部10相当于第1存积部。只要没有特别说明，则第1存积部10与所述第1实施方式中的存积部相同，只要没有特别说明，则通过管等与第1存积部10连接的各种容纳部也与图1例示的所述第1实施方式相同。第1存积部10能够导入血液凝固用试剂以及红细胞沉降剂，其具备脐带血的导入口15a，导入口15a与管68a的一端连接。第2存积部60能够容纳促进血液凝固的血液凝固促进个体(血液凝固促进剂)，其具备导入口65a和导出口66a。第2存积部60的左侧的导入口65a为脐带血的导入口，与管68b的一端连接。并且，与第1存积部10连接的管68a和与第2存积部60连接的管68b通过分支连接器19分别与管68c连接。管68c的另一端为能够连接用于采集脐带血的穿刺针等的连接部9。第2存积部60的右侧的导出口66a为导出血液凝固后的血清的导出口，与管68d连接。另外，第3血清容纳部61b具备导入口65b，导入口65b连接着与第2存积部60连接的管68d的另一端。

[0197] 关于本实施方式的脐带血成分制备装置，如后所述，在第2存积部中，通过所述血液凝固促进个体与脐带血接触，从而血液凝固的级联系统发挥作用，通过血液的凝固以及血小板活化而放出生长因子。因此，在所述第2存积部60中，与不使血小板活化的情况相比，血液凝固的上清中含有更多的生长因子。

[0198] 作为所述血液凝固促进个体，没有特别限定，例如可以使用日本专利第3788479等中记载的血液凝固促进个体。所述血液凝固促进个体的形状例如优选为粒状、颗粒状、块状，另外优选为近似球状。所述血液凝固促进个体的大小没有特别限定，例如直径优选为1～10mm，更优选为3～5mm。所述血液凝固促进个体例如可以为多孔结构。这样能够将每单位体积的多孔结构的血液凝固促进个体的表面积设计为更大的表面积，能够高效地进行血小板等的活化。

[0199] 作为所述血液凝固促进个体的材质，没有特别限定，例如，优选其表面由含有二氧化硅的层形成。作为所述二氧化硅，例如可以举出玻璃、硅石、硅藻土、高岭土等。此外，所述血液凝固促进个体中，例如其芯体可以含有例如磁性物质。这样在血液凝固促进个体含有磁性物质的情况下，例如，通过使磁场作用于容纳了所述血液凝固促进个体的所述第2存积部，能够进行脐带血的搅拌，能够迅速活化血小板等。

[0200] 所述第2存积部中的所述血液凝固促进个体的量没有特别限定，例如，可以根据能够导入所述存积部中的脐带血的量而适当决定。作为具体例子，例如，优选：相对于脐带2
血体积，将所述血液凝固促进个体的总表面积设定为0.1～25mm/mL。

[0201] 举出一个例子，对使用本实施方式的脐带血成分制备装置6制备脐带血成分的方法进行说明。需要说明的是，只要没有特别说明，则具体的处理条件可以与上述同样设定。

[0202] 首先，在管68c的连接部9安装穿刺针，将其前端插入脐带，将脐带血导入管68c内。然后，通过管68a和68b将脐带血分别导入第1存积部10和第2存积部60中。脐带血的导入顺序没有特别限定，可以同时导入各存积部，也可以依次导入。在后者的情况下，例如，首先预先在分支连接器19附近关闭与第1存积部10连接的管68a的流路，使脐带血导入第2存积部60后，在分支连接器19附近关闭与第2存积部60连接的管68b的流路，然后解除所述管68a的关闭，能够将脐带血导入第1存积部10中。在将脐带血分别导入第1存积部10和第2存积部60中后，可以将两存积部间的管68a和68b熔断。

[0203] 第1存积部10中例如如上所述可以预先容纳有抗凝血剂，也可以在导入脐带血之前导入抗凝血剂。通过在将脐带血导入具备抗凝血剂的第1存积部10中后，例如通过与第1实施方式同样地进行处理，能够得到上述的造血干细胞、已处理的血清和非处理的血清。
需要说明的是，例如，代替第1实施方式，与第1存积部10连接的各种容纳部也可以与第2或第3实施方式相同。

[0204] 另一方面，第2存积部60中例如如上所述可以预先容纳有所述血液凝固促进个体，也可以在导入脐带血之前导入所述血液凝固促进个体。若将脐带血导入所述具备血液凝固促进个体的第2存积部60中，则所述脐带血发生血液凝固(形成纤维蛋白)，同时发生血小板的活化。与非活化的情况相比，通过该活化释放出更多的生长因子。并且，在发生血液凝固后，将第2存积部60置于离心分离机，分离为含有纤维蛋白、血小板等的沉降组分和上清组分。通过连接第2存积部60和第3血清容纳部61b的管68d，将该上清组分导入第3血清容纳部61b中。这样，能够回收更多地含有生长因子的血清。另外，根据本实施方式，第2存积部60不含抗凝血剂，因而例如可以得到不含氯化钙等中和剂的血清。

[0205] 接着，对本发明的实施例进行说明。但是，本发明不限于以下实施例。

[0206] 实施例

[0207] [实施例1]

[0208] 由脐带血制备血清，确认对于脐带血造血干细胞的增殖和分化的影响。

[0209] (1)造血干细胞和血清的制备

[0210] 将含有CPD溶液作为抗凝血剂的80mL脐带血装入离心管中，以12mg/mL的浓度添加HES(羟乙基淀粉)作为红细胞沉降剂。使其在室温下静置60分钟，仅采集上清组分，对2
其进行离心分离(3920m/s(400×g)，5分钟)，得到上清组分和沉降组分。所述上清组分为富血小板血浆组分，所述沉降组分为有核细胞组分。

[0211] 将所述富血小板血浆组分中的30mL装入容量为50mL的离心管中，对其进行离心2
分离(22834m/s(2330×g)，4℃，10分钟)，得到上清组分。将所述上清组分在56℃加热30
2
分钟后，离心分离(22834m/s(2330×g)，4℃，10分钟)，除去纤维蛋白，制备非超声波处理的血清。以下将其称为脐带血血清(-)。另一方面，将所述富血小板血浆组分中的30mL装入大小为5×10cm的PVC制袋中，对其进行超声波处理后，在同样的条件下进行加热处理和离心分离处理，制备经超声波处理的血清。以下将其称为脐带血血清(+)。所述超声波处理如下进行：使用通常的超声波产生装置，在当利用声压计测定其对于对象物体的超声波而得到5mV以上的声压的条件下，以45kHz的频率，以自超声波产生装置15cm的距离超声波处理30分钟。

[0212] 对于所述有核细胞组分，进行以下处理，进行造血干细胞的纯化。首先，在0.3mL所述有核细胞组分中以50μL的量添加固定了CD34抗体的磁珠(Miltenyi Biotec公司制造)，在4。℃静置30分钟。然后，将其加样至磁性柱(商品名MS柱，Miltenyi Biotec公司制造)中，由所述有核细胞组分回收造血干细胞。使用以荧光色素标记的CD34抗体(Beckman Coulter，Inc.制造)，通过流式细胞术法确认所回收的造血干细胞的纯度，结果为约70％。

[0213] 需要说明的是，脐带血血清(+)和脐带血血清(-)分别由3个人的脐带血(A、B、C)制备，脐带血造血干细胞由其中的1个人(A)制备。

[0214] (2)造血干细胞的培养

[0215] 作为血清，使用所述A、B和C的所述脐带血血清(-)或所述脐带血血清(+)，制备4
下述组成的培养基。然后，使用各添加血清的培养基，以每孔1×10 细胞的方式接种所回收的所述B的所述造血干细胞，在37℃培养7天。

[0216] [表1]

[0217] (培养基的组成)

[0218]

[0219] (3)细胞数的测定

[0220] 培养后，使用所述标记化CD34抗体，通过流式细胞术法对所回收的细胞进行分析，计算出每孔的总细胞数、造血干细胞数和总细胞中的造血干细胞的比例。

[0221] (比较例1)

[0222] 在所述造血干细胞的培养中，除了使用胎牛血清(FBS)作为血清之外，与所述实施例1同样地进行造血干细胞的培养、细胞数的计算。

[0223] (比较例2)

[0224] 在所述造血干细胞的培养中，除了使用末梢血血清作为血清之外，与所述实施例1同样地进行造血干细胞的培养、细胞数的计算。所述末梢血血清如下制备。首先，将20mL成年男性的末梢血装入含有两个玻璃珠(珠径4mm，ブライト標識工業株式会社制造)的离2
心管中。将所述离心管在室温下振荡20分钟后，进行离心分离(22050m/s，4℃，10分钟)，采集上清。所述上清为血浆组分。将该上清在56℃热处理30分钟后，用孔径为0.22μm的滤器(PVDF膜，Millipore Corporation制造)过滤，制备末梢血血清。

[0225] 图7的图表中示出了实施例1、比较例1和2中的每孔的总细胞数、造血干细胞数4
的测定结果。在该图的图表中，纵轴为培养后的每孔的细胞数(×10 个)，各柱从左起依次为：使用FBS的比较例1、使用末梢血血清的比较例2、使用所述A～C的脐带血血清(-)的实施例1、使用所述A～C的脐带血血清(+)的实施例1的结果。所述柱整体表示总细胞数，其中涂黑的部分表示造血干细胞数。

[0226] 如图7所示，在使用脐带血血清(-)的实施例1中，与使用FBS的比较例1和使用末梢血血清的比较例2同样地确认到造血干细胞的增殖。该结果表明，利用脐带血血清(-)，能够促进脐带血造血干细胞的增殖。另一方面，在使用脐带血血清(+)的实施例1中，与比较例1和比较例2相比，总细胞数显著较低。具体地说，在使用脐带血血清(+)的实施4 4 4
例1中，总细胞数为0.165×10 ～1.0×10 个，相对于比较例1的总细胞数7×10 个，抑
4
制为2.4～21.4％，另外，相对于比较例2的总细胞数8.5×10 个，抑制为1.9～17.6％。
该结果表明，利用脐带血血清(+)，能够抑制脐带血造血干细胞的增殖。此外，在使用脐带血血清(+)的实施例1中，总细胞数中的造血干细胞的比例为85～88％，这表明在总细胞数中未分化细胞所占的比例较高。该结果表明，利用脐带血血清(+)，还能够抑制造血干细胞的分化。另外，由以上结果可知，利用脐带血血清(+)，能够抑制增殖和分化，利用脐带血血清(-)，能够促进增殖，因此通过将它们适当组合，能够根据要求控制造血干细胞的增殖。
特别是，由于能够由同一脐带血制备作为增殖目的的造血干细胞、以及作为控制剂的脐带血血清(+)和脐带血血清(-)，因此适应性、安全性也优异，还能够有效利用一直以来被废弃的脐带血。需要说明的是，在将脐带血血清(+)用于间充质干细胞的培养时，结果相反地促进了增殖。由此可知，脐带血血清(+)能够特异性抑制脐带血干细胞的增殖和分化。

[0227] [实施例2]

[0228] 与所述实施例1同样地由一个人的脐带血制备造血干细胞、脐带血血清(+)和脐3
带血血清(-)。然后，使用添加了所述各血清的下述培养基，以每孔为5×10 细胞的方式接种所述造血干细胞，在37℃培养14天。使所述培养基中的脐带血血清(+)的浓度为5、10v/v％，脐带血血清(-)的浓度为0.125、0.25、0.5、1、2.5v/v％。另外，作为对照，使用不含任何血清的培养基，同样进行培养。然后，与实施例1同样地，通过流式细胞术法分析培养后回收的细胞，计算出每孔的造血干细胞数。

[0229] [表2]

[0230]

[0231]

[0232] *：100-血清浓度(v/v％)

[0233] 下述表中示出了使用添加了脐带血血清(+)或脐带血血清(-)的培养基时的造血干细胞的增加率。将使在不添加血清的条件下培养14天时的造血干细胞数为“100％”时的相对值作为所述增加率。

[0234] [表3]

[0235]

[0236] 如上述表所示，通过用在5～10v/v％的范围含有经超声波处理的脐带血血清(+)的培养基进行培养，能够抑制干细胞的增加率。另一方面，通过用在0.125～2.5v/v％的范围含有未经超声波处理的脐带血血清(-)的培养基进行培养，能够增加干细胞的增加率。

[0237] [实施例3]

[0238] 与所述实施例1同样地由一个人的脐带血制备造血干细胞、脐带血血清(+)和脐带血血清(-)。然后，使用以0.5v/v％的浓度含有脐带血血清(-)的所述实施例2的培养3
基，以每孔为5×10 细胞的方式接种所述造血干细胞，在37℃培养14天。并且，在培养的第
14天，将所述以0.5v/v％的浓度含有脐带血血清(-)的培养基更换为以10v/v％的浓度含有所述脐带血血清(+)的所述实施例2的培养基，进一步进行培养。然后，与实施例1同样地，通过流式细胞术法分析在规定的培养时间(0、7、14、21天)回收的细胞，计算出每孔的造血干细胞数。作为对照，在培养的第14天，不更换为以10v/v％的浓度含有所述脐带血血清(+)的所述培养基，而仅使用培养开始时的血清，在同样的血清浓度的条件下进行培养，计算出造血干细胞数。

[0239] 下述表中示出了造血干细胞的增加率。将使培养开始时(第0天)的造血干细胞数为“1”时的相对值(倍率)作为所述增加率。

[0240] [表4]

[0241]

[0242] 如上述表所示，通过在培养的第14天将用以0.5v/v％的浓度含有脐带血血清(-)的培养基培养的造血干细胞更换到以10v/v％的浓度含有脐带血血清(+)的培养基中，抑制了造血干细胞的增加。

[0243] 产业上的可利用性

[0244] 这样，根据本发明，例如，如上所述不使用安全性存在问题的病毒载体，而使用所述来自脐带血的血清，从而能够控制脐带血造血干细胞的增殖和分化。具体地说，仅使用脐带血血清，能够进行所述抑制。因此，能够以非常优异的安全性、简便的操作进行增殖和分化的调节。特别是，由于是来自脐带血的血清，因此例如能够使用来自同一个体的脐带血的造血干细胞和血清。因此，能够更有效地利用脐带血，而且由于能够并用同一个体的成分，因而也能够提高安全性方面的可靠性。这样，根据本发明能够抑制造血干细胞的增殖和分化，因而例如在将所述造血干细胞输送到目的地时或者到进行增殖的所期望的时期为止对所述造血干细胞进行保存时等非常有用，可以称为再生医疗领域中能够更进一步促进脐带血造血干细胞的有效利用的方法。