突变体青霉素G酰基转移酶

摘要

本发明涉及源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于所述突变体在选自下组的一个或多个氨基酸位置上具有氨基酸取代，所述组由根据具有SEQ ID No：1中所示氨基酸序列的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号的氨基酸位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460和B488组成。

权利要求

1.源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体: a.在氨基酸位置[B24+B148+ B460]上具有氨基酸取代，所述氨基酸位置基于具有SEQID No:1中所示氨基酸序列的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号；并且 b.其中B24、B148和B460上的突变分别为F24A、V148L和F460L ;并且 c.其中所述野生型青霉素G酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1中所示。

2.编码权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶的核酸序列。

3.包含如权利要求2所述的核酸序列的表达载体。

4.包含如权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。

5.用于生产半合成的β_内酰胺抗生素的方法，所述方法包括经活化的侧链与β_内酰胺核心的酶促偶联，其特征在于使用如权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述半合成的β-内酰胺抗生素选自由半合成的青霉素和半合成的头孢菌素组成的组。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述半合成的青霉素是阿莫西林或氨苄西林。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述半合成的头孢菌素是头孢氨苄、头孢羟氨苄或头孢拉定。

9.用于在存在权利要求1定义的突变体原核青霉素G酰基转移酶时生产阿莫西林的方法,所述酶催化活化形式的HPG与6-ΑΡΑ的偶联，其中经活化的HPG与6-ΑΡΑ的摩尔比(3.0，并且以6-ΑΡΑ为基础并且在所述酶促偶联反应后测量的阿莫西林产率> 90%，其中所述酶具有下述特性:从500毫摩尔/升HPGM和530毫摩尔/升6-ΑΡΑ生产阿莫西林，并且在测试A中所述条件下进行的转化结束时产生少于5毫摩尔/升的6-ΑΡΑ，所述测试A为: 将用于催化HPGM偶联至6-ΑΡΑ的被固定的酶装入装有筛底和搅动器的2升不锈钢反应器，所述筛底具有140 μ m的孔； 通过添加水将体积调节至IOOOml ； 将内容物冷却至10°C，并借助于蠕动泵使反应器内容物在筛底上流通； 添加 162.2g6-APA，之后添加 144g HPGM ； 通过添加水将体积调节至1500ml ； 搅动混合物并使其在筛上流通； 将温度维持在10°C ； 监测PH，最初pH为6.3，一段时间后提高至7，随后降低； 在pH小于pH = 6.3的时间点，反应几乎完全； 在所述时间点从回流线中采样，过滤并通过HPLC分析残余的6-APA含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG是选自甲基酯和乙基酯组成的组的酯。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比< 2.5。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比< 2.0。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比< 1.5。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率> 91%。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率> 92%。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率> 93%。

17.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率> 94%。

18.根据权利要求9 所述的方法，其中所述阿莫西林产率> 95%。

说明书

突变体青霉素G酰基转移酶

发明领域

[0001] 本发明涉及经突变的青霉素酰基转移酶和用于制备β -内酰胺抗生素的方法，其中在存在经突变的青霉素酰基转移酶时借助于活化的侧链将β-内酰胺核心酰化。_2] 发明背景

[0003] β_内酰胺家族的抗生素是临床应用中最重要的一类抗菌化合物。天然存在的β -内酰胺抗生素的较窄杀菌谱、它们较低的酸稳定性和越来越多的抗性问题引起了对于半合成抗生素(SSA’s)(例如半合成青霉素(SSP’s)和半合成头孢菌素(SSC’s))的开发。通常，半合成β_内酰胺抗生素的化学合成在低温下使用反应性中间产物和有机溶剂在严苛条件下进行，这导致较高的下游加工成本和环境不友好的过程。因此人们持续努力，以通过酶促转化代替传统化学方法，以便获得更加可持续的半合成β_内酰胺抗生素生产。

[0004] 天然β -内酰胺典型地由β -内酰胺核心(例如6-氨基-青霉烷酸(6-ΑΡΑ)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)及其他)和所谓的侧链组成，所述侧链通过酰胺键与核心连接。青霉素G酰基转移酶(EC 3.5.1.11)是一种水解酶，其被广泛用于去除青霉素G(PenG)、头孢菌素G(CefG)和相关抗生素的侧链，从而生产相应的脱酰的核心6-ΑΡΑ和7-ADCA以及各自被释放的侧链(在PenG和CefG的情况下为苯乙酸(PAA))。这些脱酰的内酰胺中间产物是SSA(例如氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯、头孢噻肟等等)的构造块(building blocks)。关于 PenG 酸基转移酶的最近综述见 Rajendhran J, and GunasekaranP., J Biosc1.Bioeng.(2004),97,1-13, Arroyo M et al., Appl Microbiol Biotechnol.(2003)迎，507-14，Sio CF ·and Quax WJ.Curr Opin Biotechnol.(2004),15,349-55,Chandel, A.K.et al.Enzyme and Microbial Technology(2008) ,42, pp.199-207。

[0005] 除了对β -内酰胺化合物脱酰基之外，已发现PenG酰基转移酶和氨基酯水解酶也可以被用于合成β_内酰胺抗生素。在该过程中，PenG酰基转移酶催化被活化的侧链与脱酰的内酰胺中间产物(例如6-APA、7-ADCA、7-ACA及其他)的缩合。酶催化的β-内酰胺抗生素合成可以在平衡受控的转化过程中发生，或在动力学受控的转化过程中发生。在平衡受控的转化条件下，可以达到的产物累积水平受到反应热动力学平衡的控制，这在半合成抗生素的合成中是不想要的，特别是当反应在水性介质中进行时。在动力学受控的转化中，酶催化酰基从活化的侧链(即酰基供体)转移到β-内酰胺核心(即亲核受体)。为了制备半合成的青霉素，被活化的侧链可以是酰胺衍生物或是芳香族羧酸的甲基酯。在这种情况下，产物累积水平受酶的催化特性控制，并且可瞬时获得酰基转移产物的高的非平衡浓度。SSA’ s的合成中使用的侧链的例子是经活化的苯基甘氨酸、经活化的羟苯基甘氨酸、经活化的二氢苯基甘氨酸等等。

[0006] PenG酰基转移酶通过酰基-酶中间产物催化酰胺和酯的水解，所述中间产物中β -亚基的N-端丝氨酸被酯化至酰基。在水解的情况下，水攻击酰基-酶并且驱动水解完成。存在添加的外界亲核试剂(例如6-APA、7-ADCA)的氨基时，亲核试剂和水均攻击酰基酶，分别产生想要的酰基-转移产物(抗生素)和不想要的经水解的酰基供体。[0007] PenG酰基转移酶发挥酰基转移酶(即合成SSA’ s)的能力已经在多种半合成的β -内酰胺抗生素的酶促生产中以工业规模利用。然而，在SSA’s的生产中，由于经活化的前体侧链的损失，水导致的水解反应降低了转移反应的效率。合成速率(S)和水解速率(H)之间的比例是评价PenG酰基转移酶合成性能的重要参数。S/Η比例等于酶促酰基转移反应期间确定的条件下合成的产物(SSA)与水解产物相比的摩尔比。合成的产物在本文中被定义为从经活化的侧链和内酰胺核心形成的内酰胺抗生素。水解产物在本文中被定义为经活化的侧链的相应酸。对经济上有吸引力的方法而言，期望S/Η比较较高，同时酶活性优选地也足够高。

[0008] 转化中观察到的S/Η比例依赖于反应物、反应条件和转化的进行。Youshko etal.显示S/Η比例的初始值既依赖于酶的动力学特性，又依赖于亲核受体(例如6-APA)的浓度一见 Youshko,M.1.and Svedas, V.K., Biochemistry (Moscow) (2000) , 65,1367-1375和Youshko,M.1.et al.Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics(2002),1599,134-140。在固定的条件和亲核试剂浓度下，初始S/Η比例可被用于比较不同PenG酰基转移酶和/或不同PenG酰基转移酶突变体的性能。另外，可以通过测量作为时间函数的转化期间的合成和水解，来比较不同PenG酰基转移酶的性能，所述测量允许计算转化不同阶段的S/Η比例。酰化反应中PenG酰基转移酶的合成活性(=形成合成产物的速率=合成速率=生产速率)指:定义的条件下每单位时间在酰化反应中形成的内酰胺抗生素的量。优选地测定初始活性。初始酶活性可如下测定:进行酰化反应，然后构建合成的产物量与反应时间相比的图表，即所谓的发展曲线。通常在转化开始时，产物形成速率相对恒定，并且可以从发展曲线的斜率直接推导活性。在转化开始时合成活性已经开始降低的情况下，可通过发展曲线的外推和t = O时斜率的计算获得初始速率。为了比较不同PenG酰化酶的活性，合成活性应当被标准化至相同量的蛋白质。通过与合成初始速率相同的方式，可以从经活化的经水解侧链量比反应时间的图表来测定水解的初始速率。

[0009] PenG酰基转移酶已成为涉及PenG酰基转移酶突变体的若干研究的对象。在上文Raiendhran and Gunasekara·(2004)中给出了对公开的突变的详尽列表。近期更多研究由Gabor,E.M.and Janssen,D.B., Protein Engineering,Design and Selection(2004),17,571-579 ；Jager,S.A.ff.et al.Journal of Biotechnology(2008), 133,18-26 ；ffang,J.,etal.Applied Microbiology and Biotechnology (2007), 74,1023-1030 公开。

[0010] Gist-brocades的国际专利申请W096/05318教导了如何通过突变一个或多个氨基酸位置上的底物结合位点来修饰PenG酰基转移酶的特异性。显示也可以通过这种方式调整PenG酰基转移酶的S/Η比例。

[0011]另夕卜，国际专利申请 W098/20120 (Bristol-Meyers Squibb)、W003/055998 (Gist-brocades)和中国专利申请 CNlOl 177688 (Shanghai Institute forBiological Sciences的)描述了由β_内酰胺核心和经活化的侧链，借助于PenG酰基转移酶突变体酶促制备β -内酰胺抗生素的方法。W098/20120公开了 Escherichia coliPenG酰基转移酶α-亚基中氨基酸位置142和146上和β -亚基中氨基酸位置24、56或177上的突变。特别地，在β 24上具有突变(其中苯丙氨酸被丙氨酸代替，F β 24Α)的PenG酰基转移酶变体似乎在青霉素和头孢菌素合成中生产显著更高的产率。然而在W003/055998中显示，在使用酰胺前体代替酯前体与所述突变体F β 24Α组合的方法中，S/Η比例仍然教导，但是酶促活性如此之低，使得该突变体在经济上吸引力小得多。相反，W003/055998中显示，其中α-亚基中第145位精氨酸被亮氨酸(Ra 145L)、半胱氨酸(Ra 145C)或赖氨酸(Ra 145Κ)代替的PenG酰基转移酶突变体也显示经改进的S/Η比例，但是除此之外还保持了更高水平的合成活性，特别是使用酰胺前体时。然而，所有这些突变体的合成活性都比野生型PenG酰基转移酶的合成活性小。

[0012] CN101177688 公开了对 Bacillus megaterium PenG 酸基转移酶的突变体而言，S/H比例的改进也伴随着合成活性的降低。

[0013] TUHH-Technologie GmbH 的 EP-1418230 公开了 Alcaligenes faecalis PenG酸基转移酶，其中α -亚基的翻译后成熟是不完全的，导致对青霉素G和6-硝基-3-苯乙酰胺苯甲酸(也称作ΝΙΡΑΒ)更高的水解活性。所述α-亚基的不完全加工由α和β亚基之间所谓的连接子区域中的氨基酸取代引起。没有描述此类突变是否也能提高合成活性。

[0014] 上文讨论的现有技术显示，尽管可能提高PenG酰基转移酶的多种突变体的S/Η比例，但是与野生型PenG酰基转移酶相比，S/Η比例的此类改进伴随着合成活性的降低。因此，这些突变体的缺点是在此类转化中需要长的转化时间或非常高浓度的突变体PenG酰基转移酶，这使得此类突变体的工业应用在经济上没有吸引力，如果不是不可能的话。

[0015] 本发明的一个目的是提供下述突变体PenG酰基转移酶，所述酶与野生型酶相比具有提高的S/Η比例，同时维持或更优选地提高合成活性，从而适用于工业方法。

[0016] 发明详沭

[0017] 在第一方面中，本发明提供了源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体具有位于选自下组的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，所述组由氨基酸位置A3、Α77、Α90、Α144、Α192、Β24、Β109、Β148、Β313、Β460和Β488组成，所述氨基酸位置根据·具有SEQ ID No:1所示氨基酸序列的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号，如下文所示:

[0018] MKNRNRMIVNCVTASLMYYffSLPALAEOSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTmFYGYGYWAODRLFOMEMARRS

[0019] TQGTVAEVLGKDFVKFDKDIRRNYWPDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWIDKVNTNPETLLPKQFNTFGF

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[0025] IANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQDLNLRLFLPTLQAATSGLT

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[0027] LNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEWLAALEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFG

[0028] VPQAAAEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSDRPVLAWDWAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSL

[0029] WLTKQDVEAHKESQEVLHVQR

[0030] 所述基因编码的完整多肽链由信号肽(26个氨基酸一单下划线部分)、α -亚基(209个氨基酸)、连接肽(54个氨基酸一双下划线部分)和β -亚基(557个氨基酸)组成。信号肽以及连接肽均在翻译后成熟(post-translational maturation)期间被去除，籍此得到由α-亚基和β-亚基组成的有酶活性的青霉素G酰基转移酶。在α-亚基中氨基酸被编号为A1-A209，在β-亚基中氨基酸被编号为BI到Β557。

[0031] 野生型青霉素G酰基转移酶在本文中被定义为天然存在的青霉素G酰基转移酶。野生型青霉素G酰基转移酶可以是任何合适的野生型青霉素G酰基转移酶，并且优选地选自由以下组成的组:具有SEQ ID No:1所示氨基酸序列的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶，和与SEQ ID No:1至少30%同源的青霉素G酰基转移酶。优选地，野生型青霉素G酰基转移酶选自由以下组成的组:表I中概括的、与Escherichia coli青霉素G享有30%或更多同源性的19种青霉素G酰基转移酶。

[0032]表 1.[0033]

[0034] Universal Protein Resource(http://www.uniprot.0rg/)

[0035] 更优选的是与SEQ ID No:1有40%-100%同源的青霉素G酰基转移酶(例如属于1-1II组的青霉素G酰基转移酶)，进一步更优选的是与SEQ ID No:1有50%-100%同源的青霉素G酰基转移酶(例如属于1-1I组的青霉素G酰基转移酶)，进一步更优选的是与SEQ ID No:1有80%-100%同源的青霉素G酰基转移酶(例如属于I组的青霉素G酰基转移酶)。最优选的是具有SEQ ID No:1的氨基酸序列的、来自Escherichia coli的野生型青霉素G酰基转移酶。

[0036] 一种优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶至少具有位置B24上的氨基酸取代，和选自下组的一个或多个位置上的氨基酸取代，所述组由A3、A77、A90、A144、A192、B109、B148、B313、B460和B488组成。位置B24上的突变是本领域已知的。W096/05318公开了用带正电荷的氨基酸赖氨酸或精氨酸代替Alcaligenes feacalis的青霉素G酰基转移酶中B24中天然存在的Phe。B:F24K突变体尤其显示经改进的下述能力:切割底物苯乙酰基-亮氨酸，从而释放亮氨酸，并允许用编码Alcaligenes feacalis的突变体青霉素G酰基转移酶的基因转化的亮氨酸缺陷型E.coli菌株生长。W098/20120显示了 Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶位置B24上所有可能的突变。特别地，用Ala代替B24上天然存在的Phe给予头孢羟氨苄合成期间S/Η比例的大幅改进。

[0037] 目前惊讶地发现，B24上的突变与选自由A3、A77、A90、A144、A192、B148、B109、B313、B460和B488组成的组的位置上的一个或多个突变的组合可导致产生下述青霉素酰基转移酶突变体，所述突变体与单独在位置B24上具有突变的青霉素酰基转移酶突变体相t匕，在多种半合成的头孢菌素以及半合成的青霉素的合成反应期间具有提高的合成活性，以及任选地，进一步改进的S/Η比例。优选的组合体(组合体在本文中被定义为与野生型酶相比包含至少两个突变的突变体酶)包含位置[B24+A144]或位置[B24+B109]或位置[B24+B460]或位置[B24+A144+B109]或位置[B24+B109+B460]或位置[B24+B144+B460]或位置[B24+B109+B144+B460]上的突变。其他优选的组合体包括位置[B24+B460+A3+A192]或位置[B24+B460+A90]或位置[B24+B148+B460]或位置[B24+B148+B460+A3+A192]或位置[B24+B148+B460+A90]上的突·变。

[0038] 另一优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶至少具有位置B460上的氨基酸取代，和任选地具有选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代，所述组由A3、A77、A90、A144、A192、B24、B148、B109、B313和B488组成。位置B460与至少位置B24的优选的组合在上文列出。其他优选的组合体包括位置[B460+A90]或位置[B460+B109]或位置[B460+A144]或位置[B460+A90+B109]或位置[B460+A90+A144]或位置[B460+B109+A144]或位置[B460+A90+B109+A144]上的突变。其他优选的组合体包括位置[B460+A192]或位置[B460+A3]或位置[B460+A192+A3]上的突变。

[0039] —种高度优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶是来自Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶，所述酶具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列，并且具有位置[B24+A144]或位置[B24+B109]或位置[B24+B460]或位置[B24+A144+B109]或位置[B24+B109+B460]或位置[B24+B144+B460]或位置[B24+B109+B144+B460]上的氨基酸取代，任选地与选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代组合，所述组由A3、A77、A90、A192、B148、B313和B488组成。[0040] 另一种高度优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶是来自Kluyveromycescryocrescens的青霉素G酰基转移酶，其具有氨基酸位置[B24+A144]或位置[B24+B109]或位置[B24+B460]或位置[B24+A144+B109]或位置[B24+B109+B460]或位置[B24+B144+B460]或位置[B24+B109+B144+B460]上的氨基酸取代，任选地与选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代组合，所述组由A3、A77、A90、A192、B148、B313和B488组成。

[0041] 野生型青霉素酰基转移酶中的位置A3可具有不同类型的氨基酸。Escherichiacoli野生型酶具有丝氨酸。野生型青霉素酰基转移酶中的一种优选的突变包括用亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或苏氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括A: S3A或A: S3L。

[0042] 野生型青霉素酰基转移酶中位置A77可具有不同类型的氨基酸，例如带正电(R，K)和带负电(D，E)的残基以及极性残基(S，N, Q)。Escherichia coli野生型酶具有丙氨酸。野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用苏氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括A: A77T。

[0043] 表2.野生型青霉素G酰基转移酶中位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460和B488上氨基酸的存在。

[0044]

[0045] 野生型青霉素酰基转移酶中的位置A90可具有不同类型的氨基酸，但是主要是带正电荷的氨基酸(R，K) oEscherichia coli野生型酶具有甲硫氨酸。不具有赖氨酸的野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用赖氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichiacoli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括A:M90K。

[0046] 野生型青霉素酰基转移酶中的位置A144显示主要是天冬酰胺。野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用苏氨酸代替天然存在的氨基酸。另外，芳香族氨基酸酪氨酸或苯丙氨酸或色氨酸是对应于Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中A144的位置上优选的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括A:N144S。

[0047] 野生型青霉素酰基转移酶中的位置A192可具有不同类型的氨基酸。Escherichiacoli野生型酶具有缬氨酸。野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用更具极性的氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)、优选地甚至用带电荷的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸)代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括A:V192E。

[0048] 在野生型青霉素G酰基转移酶之间位置B24是高度保守的。在E.coli青霉素G酰基转移酶和许多其他野生型酶中，存在苯丙氨酸。剩余的野生型酶也具有疏水性残基(M，V)或极性残基(Q)。野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用丙氨酸或亮氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括B:F24A 或 B:F24L。

[0049] 位置B109显示主要是带正电荷的氨基酸赖氨酸或精氨酸。在E.coli青霉素G酰基转移酶中存在赖氨酸。不具有赖氨酸的野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用精氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括B:K109R。

[0050] 野生型青霉素酰基转移酶中位置B148可具有不同类型但是主要是小疏水残基(V，L，I，A)。在E.coli青霉素G酰基转移酶中存在缬氨酸。不具有亮氨酸的野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用亮氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括B:V148L。

[0051] 野生型青霉素酰基转·移酶中位置B313可具有不同类型但是主要是极性或带负电荷的残基(S，N，D，Q，H，T，E)。在E.coli青霉素G酰基转移酶中存在丝氨酸。不带有天冬酰胺或天冬氨酸的野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用天冬酰胺或天冬氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种优选的突变包括B:S313N。

[0052] 在20种野生型青霉素G酰基转移酶间位置B460较不保守。大部分野生型酶具有疏水残基(F，L，A，V，I)。在E.coli青霉素G酰基转移酶中存在苯丙氨酸。不具有天然存在的亮氨酸的野生型青霉素G酰基转移酶中一种优选的突变是用亮氨酸代替天然存在的氨基酸，或包括用苏氨酸、缬氨酸或异亮氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括B:F460L。在对应于Escherichia coli青霉素G酰基转移酶B: F460的位置上具有亮氨酸的青霉素酰基转移酶中，亮氨酸可以被丙氨酸、苏氨酸、纟颜氨酸或异亮氨酸代替。特别是与对应于Escherichia coli青霉素G酰基转移酶B:F24的位置上的突变组合时。

[0053] 在野生型青霉素G酰基转移酶间位置B488是高度保守的。在E.coli青霉素G酰基转移酶中存在苯丙氨酸。不具有亮氨酸或甲硫氨酸的野生型青霉素酰基转移酶中一种优选的突变包括用亮氨酸或甲硫氨酸代替天然存在的氨基酸。Escherichia coli青霉素G酰基转移酶中一种高度优选的突变包括B: F488L。[0054] 在第二方面中，本发明提供了编码本发明第一方面的突变体青霉素G酰基转移酶的核酸序列。

[0055] 在第三方面中，本发明提供了包含本发明第二方面的核酸序列的表达载体。

[0056] 在第四方面中，本发明提供了包含本发明第三方面的表达载体的宿主细胞。

[0057] 在第五方面中，本发明提供了用于生产本发明第一方面的突变体青霉素G酰基转移酶的方法。

[0058] 在第六方面中，本发明提供了用于生产半合成的内酰胺抗生素的方法，所述方法包括经活化的侧链与β_内酰胺核心的酶促偶联，其特征在于使用本发明第一方面的突变体原核青霉素G酰基转移酶。优选的半合成的β_内酰胺抗生素选自由半合成的青霉素和半合成的头孢菌素组成的组。优选的半合成的青霉素的例子是阿莫西林和氨苄西林。阿莫西林可以通过经活化的HPG (例如作为酰胺或酯，优选地甲基酯或乙基酯)与6-ΑΡΑ的酶促偶联来生产，而氨苄西林可以通过经活化的PG(例如作为酰胺或酯，优选地甲基酯或乙基酯)与6-ΑΡΑ的酶促偶联来生产。优选的半合成的头孢菌素的例子是头孢羟氨苄、头孢氨苄和头孢拉定。头孢羟氨苄可以通过经活化的HPG(例如作为酰胺或酯，优选地甲基酯或乙基酯)与7-ADCA的酶促偶联来生产，而头孢氨苄可以通过经活化的PG(例如作为酰胺或酯，优选地甲基酯或乙基酯)与7-ADCA的酶促偶联来生产，且头孢拉定可以通过经活化的DHPG(例如作为酰胺或酯，优选地甲基酯或乙基酯)与7-ADCA的酶促偶联来生产。

[0059] 在一个优选的实施方案中，用于生产半合成的内酰胺抗生素的本发明方法包括使用突变体原核青霉素G酰基转移酶，所述酶包含氨基酸位置Β24上的突变，与选自下组的位置上的一个或多个突变组合，所述组由A3、Α77、Α90、Α144、Α192、Β148、Β109、Β313、Β460和Β488组成。优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶包括位置[Β24+Α144]或位置[Β24+Β109]或位置[Β24+Β460]或位置[Β24+Α144+Β109]或位置[Β24+Β109+Β460]或位置[Β24+Β144+Β460]或位置[Β24+Β109+Β144+Β460]上的突变。其他优选的组合体包括位置[Β24+Β460+Α3+Α192]·或位置[Β24+Β460+Α90]或位置[Β24+Β148+Β460]或位置[Β24+Β148+Β460+Α3+Α192]或位置[Β24+Β148+Β460+Α90]上的突变。在另一个优选的实施方案中，用于生产半合成的β_内酰胺抗生素的本发明方法包括使用突变体原核青霉素G酰基转移酶，所述酶包含氨基酸位置Β460上的突变，和任选地选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代，所述组由 A3、Α77、Α90、Α144、Α192、Β24、Β148、Β109、Β313 和 Β488 组成。位置Β460与至少位置Β24的优选的组合体已在上文列出。其他优选的组合体包括位置[Β460+Α90]或位置[Β460+Β109]或位置[Β460+Α144]或位置[Β460+Α90+Β109]或位置[Β460+Α90+Α144]或位置[Β460+Β109+Α144]或位置[Β460+Α90+Β109+Α144]上的突变。其他优选的组合体包括位置[Β460+Α192]或位置[Β460+Α3]或位置[Β460+Α192+Α3]上的突变。高度优选的实施方案包括使用来自Escherichia coli的突变体原核青霉素G酰基转移酶，所述酶具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列，并且具有位置[B24+A144]或位置[B24+B109]或位置[B24+B460]或位置[B24+A144+B109]或位置[B24+B109+B460]或位置[B24+B144+B460]或位置[B24+B109+B144+B460]上的氨基酸取代，任选地与选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代组合，所述组由A3、A77、A90、A192、B148、B313和B488组成；或者使用来自Kluyveromyces cryocrescens的突变体原核青霉素G酰基转移酶,所述酶具有位置[B24+A144]或位置[B24+B 109]或位置[B24+B460]或位置[B24+A144+B109]或位置[B24+B109+B460]或位置[B24+B144+B460]或位置[B24+B109+B144+B460]上的氨基酸取代，任选地与选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代组合，所述组由A3、A77、A90、A192、B148、B313 和 B488 组成。

[0060] 通过使用本发明的突变体原核青霉素G酰基转移酶的本发明方法的优点在于，由于与野生型酶相比突变体原核青霉素G酰基转移酶被保留或更优选地被提高的合成活性和更高的S/Η比例，用于生产半合成的β-内酰胺抗生素的生产方法是非常高效的。半合成的β -内酰胺抗生素以较高产率(例如[摩尔产物]/[添加的摩尔β -内酰胺核心])被生产，同时被活化的侧链的水解较低。另一优点在于所述方法可以用比现有技术中报道的更低的[经活化的侧链]/[ β -内酰胺核心]比例进行。

[0061] 本发明还提供了在存在催化HPG与6-ΑΡΑ偶联的酶时生产阿莫西林的方法，其中经活化的HPG (优选地选自由甲基酯和乙基酯组成的组的酯)与6-ΑΡΑ的摩尔比彡3.0，更优选地< 2.5，更优选地< 2.0,更优选地< 1.5，更优选地< 1.4，更优选地< 1.3，更优选地< 1.2，更优选地< 1.1，更优选地< 1.09，更优选地< 1.08，更优选地< 1.07，更优选地(1.06,更优选地< 1.05,更优选地< 1.04,更优选地< 1.03和最优选地< 1.02,并且以6-ΑΡΑ(摩尔/摩尔)为基础并且在所述酶促偶联反应后测量的阿莫西林产率> 90%，优选地> 91%，优选地> 92%，优选地> 93%，优选地> 94%，优选地> 95%，优选地> 96%,优选地> 97%，优选地> 98%和更优选地> 99%。

[0062] 优选地，用于生产阿莫西林的方法中的酶是酰基转移酶，优选地是青霉素-G酰基转移酶，所述酶具有下述特性:能从500mmole/升HPGM和530mmole/升6-APA生产阿莫西林(即转化)，并且在本文公开的测试A中所述条件下进行的转化结束时产生少于5mmole/升的6-ΑΡΑ。表2中天然存在的野生型青霉素G酰基转移酶均不具有该特性。可以通过筛选，或更优选地通过取代一个或多个氨基酸，获得合适的野生型青霉素G酰基转移酶。

[0063] 在本发明方法的一个优选的实施方案中，可以通过使用本发明的突变体原核青霉素G酰基转移酶生产阿莫西林·。可以使用的一种高度优选的突变体原核青霉素G酰基转移酶是来自Escherichia coli并具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列的青霉素G酰基转移酶，或来自 Kluyveromyces cryocrescens 并在位置[B24+B109]或[B24+B460]或[B109+B460]或[B24+B109+B460]或[B24+B148+B460]上具有氨基酸取代、任选地与选自下组的位置上的一个或多个氨基酸取代组合的青霉素G酰基转移酶，所述组由A3、A77、A90、A144、A192、B148、B313和B488组成。最优选的是来自Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶，所述酶具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列并且具有位置[B24+B109]或[B24+B460]或[B109+B460]或[B24+B109+B460]上的氨基酸取代。

[0064] 材料和方法

[0065] 酰基转移酶突变体的制备

[0066] 可如W096/05318和W003/055998中所述进行野生型和突变体青霉素G酰基转移酶的生产、分离和纯化。或者，可以通过基因合成获得编码突变体青霉素G酰基转移酶的基因。

[0067] 可以如下获得突变体青霉素G酰基转移酶的生产:将编码突变体青霉素G酰基转移酶的基因克隆进适当的表达载体中，用所述载体转化合适的宿主如E.coli，并在适合生产突变体青霉素G酰基转移酶的条件下培养经转化的宿主。如W09605318中所述进行突变体的回收和纯化。另外，使用装有Superdex200凝胶过滤柱的Akta Purifier 10系统以及装有TSKgel3000SWxl柱的HPLC系统纯化酰基转移酶。这两种系统均在0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0中以lml/min的流速运行。

[0068] 酰基转移酶浓度的测定

[0069]如 Svedas et al.1977, Bioorg.Khimya[Russ.] 3, 546-553和 Alkema et al.1999，Anal.Biochem 275，47-53所述，通过用苯甲基磺酰氟化物(PMSF)进行活性位点滴定来测定酰基转移酶浓度。使用NIPAB作为底物，测量初始活性和活性位点滴定后的残余活性。在37°C下0.1M MOPS缓冲液pH = 7.4中，通过测量5-氨基-2-硝基苯甲酸的释放造成的405nm处吸光度的提高，来跟踪NIPAB的水解。或者，可以使用头孢氨苄的合成来测量活性位点滴定后的残余活性(见下文)。

[0070] 酰基转移酶的固定化

[0071] 根据W097/04086和EP0222462中公开的方法，固定化多种酰基转移酶。

[0072] 头孢菌素的检测

[0073]根据 Fujii 方法(Fujii et al., 1976, Process Biochemistry, 21-24)进行对头孢菌素(例如头孢氨苄和头孢拉定)的检测。所述方法可以被容易地转换成高通量格式筛选(high throughput format screening)。

[0074] 头孢氨苄的检测

[0075] 用以下方式进行从D-苯基甘氨酸甲基酯(PGM)和7-ADCA到头孢氨苄形成的标准测定法:向50g/l PGM和50g/l 7-ADCA组成的130 μ I底物混合物(该溶液的制备见下文)中添加10 μ I青霉素G酰基转移酶溶液。随后将反应区室密封以防蒸发。室温下2小时的孵育后，添加140 μ I的IM Na·OH来终止反应，并起始显色。彻底混合防止沉淀。在密封区室中于室温下孵育2小时后，测量490nm处的吸光度。对空白实验而言，添加水来代替酶。在测定初始周转率的情况下，酶浓度使得最终转化率在I %和10%之间。除了改变酶浓度从而控制转化率之外，还可以替代性地调节反应时间以获得想要的转化率。将490nm处的OD针对头孢氨苄浓度(用含有已知量头孢氨苄的样品测定)绘图时，可以从获得的校准线测定形成的头孢氨苄的绝对量。

[0076] 为了制备PGM/7-ADCA底物混合物，将50g PGM.MSA (PGM.MSA是PGM的甲磺酸(MSA)盐)和50g 7-ADCA添加至900ml 0.1M MOPS缓冲液pH = 6.9。在持续搅拌下使用4MNaOH溶液再调节pH。用缓冲液调节体积至I升，并再次调节pH。应当对每个实验制备新鲜溶液，因为PGM在水中自发地降解。为了制备MOPS缓冲液，将20.9g MOPS (Sigma M-1254)溶于约900ml MilliQ水中。使用4M NaOH溶液将pH调节至6.9，并用MilliQ水将体积调节至1L。

[0077] 头孢拉定的检测

[0078] 如上文针对头孢氨苄所述，用以下方式进行从D-2，5- 二氢苯基甘氨酸甲基酯(DHPGM)和7-ADCA到头孢拉定形成的标准测定法。区别仅在于用D-2，5-二氢苯基甘氨酸甲基酯的甲磺酸盐(DHPGM.MSA)代替PGM.MSA。

[0079] S/Η比例的测定

[0080] 为了测定β -内酰胺抗生素合成中PenG酰基转移酶的S/Η比例，作为时间的函数测量转化率。在不同时间点采样，以测定转化混合物的组成。通过将pH降低至2.7来终止反应。通过UPLC (超高效液相色谱)分析样品，从而测定形成的酰化抗生素、抗生素核心、被水解的侧链前体和侧链前体的浓度。

[0081] 由下述曲线的斜率测定合成活性，所述曲线通过优选地在0%和10%转化之间将产物量相对于反应时间绘制曲线而获得，所述区域中反应产物的形成在时间方面通常或多或少地是线性的。反应期间合成活性快速降低的情况下，可以通过发展曲线的外推和t =O时斜率的计算获得初始速率。

[0082] 由下述曲线的斜率测定水解活性，所述曲线通过优选地在0%和10%水解之间将经水解的侧链前体量相对于反应时间绘制曲线而获得，所述区域中经水解的侧链前体的形成在时间方面通常或多或少地是线性的。通过用合成活性的斜率除以水解活性的斜率计算S/Η比例。

[0083] 头孢氨苄S/Η比例的测量在含有10g/l PGM.MSA和10g/l 7-ADCA的反应混合物中进行，头孢拉定S/Η比例的测量在含有10g/l DHPGM.MSA和10g/l 7-ADCA的反应混合物中进行。添加青霉素G酰基转移酶，从而在4小时后获得70-90%的转化。在多个时间点采取20 μ I样品，并立即用800 μ I 50mM磷酸(pH = 2.7)稀释，以终止反应。

[0084]在 UPLC 色谱期间，于 210nm 下检测 DHPGM、DHPG、PMSF、PGM 和 PG 的量，于 260nm 下检测7-ADCA、头孢氨苄和头孢拉定的量，所述UPLC根据以下方案进行:

[0085] ACQUITY-泵:二兀溶剂管理站(binary solvent manager)

[0086] ACQUITY-自动米样器:样品管理站和样品组织器(sample manager and sample

[0087] organizer)

[0088] ACQUITY-UV 检测器:PDA 检测器(8Ohertz)·[0089]柱:UPLC BEH 苯基 1.7 μ m 2.1x50mm,(产品目录号

[0090] 186002884)

[0091]流速:0.9ml/min

[0092]注射体积:2 μ I (局部循环(partial loop))

[0093] 流动相A:50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)

[0094] 流动相B: 100 %乙腈

[0095]柱温度:60°C

[0096]支架(Tray)温度:10°C

[0097]波长:210 和 260nm

[0098] 运行时间:I分钟

[0099] 梯度谱:日寸间(min)
~ 0.00 0.60 0.80 0.85
_0] 流动相 A(%) 100 50 ' 50 100 —
流动相 B (%) O I 50 I 50 I O

[0101] 测试A-由6-APA和HPG甲基酯生产阿莫西林

[0102] 将用于催化HPGM偶联至6-APA的被固定的酶装入装有筛底和搅动器的2升不锈钢反应器，所述筛底具有140 μ m的孔。通过添加水将体积调节至1000ml。将内容物冷却至10°C,并借助于蠕动泵使反应器内容物在筛底上流通。[0103] 添加162.2g 6-氨基青霉烷酸，之后添加144g HPGM。通过添加水将体积调节至1500ml。搅动混合物并使其在筛上流通。将温度维持在10°C。监测pH。最初pH约为6.3，一段时间后提高至约7，随后降低。在pH小于pH = 6.3的时间点，反应几乎完全。在(添加HPGM后约2小时)所述时间点从回流线(recirculation line)中采样,过滤并通过HPLC分析残余的6-APA含量。

[0104] 缩写列表

[0105] 6-APA: 6-氨基青霉烷酸

[0106] 7-ADCA: 7_氨基去乙氧基头孢烷酸

[0107] AMP1:氨苄西林

[0108] CEX:头孢氨节

[0109] DHPG:D-2, 5_ 二氢苯基甘氨酸

[0110] DHPGM.MSA:D_2，5_ 二氢苯基甘氨酸甲基酯甲磺酸盐

[0111] EDTA:乙二胺四乙酸

[0112] HPGM:D-p-羟苯基甘氨酸甲基酯

[0113] PG:D_苯基甘氨酸

[0114] PGA:D-苯基甘氨酸酰胺

[0115] PGM:D_苯基甘氨酸甲基酯

[0116] PGM.HCL:D_苯基甘氨酸甲基酯HCl盐

[0117] PGM.MSA:D_苯基甘氨酸甲基酯甲磺酸盐

[0118] 氨基酸命名法

[0119]

[0120] 同源件&同一件

[0121] 术语“同源性”或“同一性百分比”在本文可互换使用。就本发明的目的而言，其在本文被定义来测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的同源性百分比，所述序列就最适比较的目的被排列。为了优化两条序列之间的比对，可以向被比较的两条序列中的任一条中引入缺口。此类比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可以在更短长度上，例如在约20、约50、约100或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。同一性是所述被比对的区域上两条序列之间相同匹配的百分比。

[0122] 对两条序列之间序列的比较和同一性百分比的测定可以使用数学算法完成。技术人员应当明白下述事实:可获得若干种不同的计算机程序以比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal, J.B.(1983)An overview of sequence comparison In D.Sankoffand J.B.Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules:the theoryand practice of sequence comparison, pp.1-44 Addison Wesley)。可以使用用于比对两条序列的Needleman and Wunsch算法来测定两条氨基酸序列之间的同一'丨生百分比(Needleman, S.B.and Wunsch, C.D.(1970) J.Mol.Biol.48,443-453)。算法可以比对氛基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已经被整合进计算机程序NEEDLE中。就本发明的目的而言，使用来自EMBOSS包(2.8.0或更高版本，EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (2000)Rice, P.Longden, 1.and Bleasby, A.Trends inGenetics 16, (6) pp276~277, http: //emboss, bioinformatics, nl/)的 NEEDLE 程序。对蛋白质序列而言，对取代矩阵使用EBL0SUM62。对核苷酸序列而言，使用EDNAFULL。其他可以被详细说明。使用的任选参数是10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分。技术人员应当明白，所有这些不同的参数会产生轻微不同的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体同一性百分比不会显著改变。

[0123] 全局同源性定义[0124] 同源性或同一性是两条序列在总体比对区域(包括任何缺口)上相同匹配的百分比。两条被比对的序列之间的同源性或同一性如下计算:用在两条序列中显示相同氨基酸的比对中的相应位置数量除以比对的总长度(包括缺口)。本文定义的同一性可以从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“IDENTITY”。

[0125] 最长同一性定义

[0126] 两条被比对的序列之间的同源性或同一性如下计算:用在两条序列中显示相同氨基酸的比对中的相应位置数量除以减去比对中的缺口总数量后的比对总长度。本文定义的同一性可以通过使用N0BRIEF选项从NEEDLE获得，并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。实施例

[0127] 实施例1

[0128] 选择具有经改进的头孢氨苄合成活性的青霉素G酰基转移酶突变体

[0129] 为了寻找改进具有经改进的S/Η比例的PenG酰基转移酶突变体活性的氨基酸位置和突变，通过对编码Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶的基因进行易错诱变(error prone mutagenesis),来产生突变体文库,所述酶已含有以下两个蛋白质水平的突变:B:F24A和B:V148L(随后被命名为对照)。对由此获得的突变体文库进行高通量筛选，得到与对照相比显示经改进的头孢氨苄生产力的突变体。所述实验和通过fujii方法形成的头孢氨苄的检测方法已描述于材料和方法部分中。对高通量而言，术语生产力是指一定时间中固定量的无细胞提取物(CVE)所合成的头孢氨苄的量。测试了总计约7000个克隆。

[0130] 接着，按照所述的，培养表达感兴趣的突变体和对照青霉素酰基转移酶的重组Escherichia coli细胞。采用具有相似OD6tltlnm值的摇瓶，将培养物离心并冷冻于_20°C下。为了制备无细胞提取物，将沉·淀物重悬于含有0.lmg/ml DNase和2mg/ml Lysozyme的提取缓冲液(0.05M MOPS, pH = 6.9)中，并进行孵育。30分钟后离心提取物，并使用含有酰基转移酶活性的上清液进行头孢氨苄合成测试。2小时后终止转化，如材料和方法中所述测定形成的头孢氨节的量，并将其表不为490nm下的0D。

[0131] 通过针对与对照相比较经改进的头孢氨苄生产进行筛选而选自突变体文库的突变体概括于表3中。S/Η突变体1-4具有更高的活性。

[0132] 表3.基因编号代表了 cDNA序列编码的保守氨基酸位置，并且包括信号肽(26个氨基酸)、α -亚基(209个氨基酸)、连接肽(54个氨基酸)和β -亚基(557个氨基酸)。蛋白质编号分别代表多肽序列的信号肽、α-亚基、连接肽和β-亚基中的氨基酸位置。AA-野生型代表Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶中各位置上的氨基酸。AA-对照代表在Escherichia coli的青霉素G酰基转移酶中带有突变B:F24A和B: V148L的突变体的氨基酸。右侧两列显示在文库筛选中观察到的突变体I到突变体4的头孢氨苄生产力。给出了绝对生产力以及与对照相比的相对生产力。

[0133]

[0134] 实施例2

[0135] 选择在氨苄西林合成中具有经改进的氨苄西林/6-APA的青霉素G酰基转移酶

[0136] 从上述突变体文库中，针对氨节西林合成测试约6000个克隆。培养Escherichiacoli克隆后，如前文所述制备无细胞提取物。随后将20微升无细胞提取物转移至80微升含有12mM PGM、4mM 6-APA和IOmM氨苄西林的0.05M MOPS缓冲液pH = 6.9中。制备作为游离碱的PGM。所有溶液每天新鲜制备。反应在室温下进行并且用PMSF终止。随后通过UPLC色谱分析样品。

[0137]柱:Waters Acquity UPLC BEH Phenyl, 50x2.1mm,粒径 1.7 μ m。

[0138]溶剂 A:50mM 乙酸铵 pH= 5.8

[0139]溶剂 B:60% 乙腈+40% Mill1-Q 水

[0140]弱洗液:5% 乙臆+95% Mill1-Q 水

[0141]强洗液:95% 乙腈+5% Mill1-Q 水

[0142] 梯度表:

[0143]

[0144]使用 Waters Micromass ZQ 2000 LC 质谱仪通过质谱法,和使用 Waters ACQUITYUPLC Photodiode Array (PDA)检测器通过190_400nm范围内的UV测量，对洗脱的化合物进行鉴定和定量。使用适当的标准进行校准。

[0145] 根据比例氨苄西林/6-APA对克隆分级。将与对照相比显示更高比例的克隆再测试若干次。最后对相对于对照而言显示氨苄西林/6-APA比例的一致改进的两个克隆进行测序。两种突变体的典型结果展示于表4中。克隆的序列展示于表3中。

[0146] 表4:作为时间函数的6-APA到氨苄西林的酶促转化。

[0147]

[0148] 突变体5-6和8-12通过组合在筛选易错文库时被鉴定的突变来获得。测试这些突变体的结果将在以下实施例中描述。

[0149] 实施例3

[0150] 基于经改进的头孢氨苄生产力选择的青霉素G酰基转移酶突变体的头孢氨苄和头孢拉丁合成活性

[0151] 实施例1所选择的突变体I到突变体4(表3)的活性基于下述假设:在生产宿主的相似生长下获得或多或少相似的青霉素G酰基转移酶表达(相似的OD49tlnm〜细胞密度)。为了校正突变体表达水平中的任何差异，如材料和方法中所述，使用PMSF滴定测定无细胞提取物中的青霉素酰基转移酶的浓度。基于PMSF滴定，可以不用进一步纯化即测定活性青霉素G酰基转移酶含量，从而可以更精确地测定比活性(以每mg酰基转移酶的单位计)。为了测定头孢氨苄和头孢拉定合成中的初始合成活性，如材料和方法中所述通过UPLC监测转化。结果展示于表5中。

[0152] 表5.实施例1选择的青霉素酰基转移酶突变体用于合成头孢氨苄、头孢拉定和水解NIPAB的比活性(实验条件见材料和方法)以每mg酰基转移酶的任意单位(ArbitraryUnits)表示，以及作为IF =改进因数来表示,对照的ID被定义为I。

[0153]

[0154] 实施例4

[0155] 基于经改进的头孢氨苄生产力选择的青霉素G酰基转移酶的S/Η比例

[0156] 如材料和方法中所述，测量所选择的突变体1-4的S/Η比例。在头孢氨苄的合成期间，记录发展曲线。从这些发展曲线中测定头孢氨苄合成和PGM水解的S/Η比例。对相同的突变体而言，记录头孢拉定合成期间的发展曲线。测定头孢拉定合成和二氢苯基甘氨酸甲基酯水解的S/Η比例。结果展示于表6中。

[0157] 表6.与对照相比，在头孢氨苄和头孢拉定合成期间，选择的青霉素G酰基转移酶的S/Η比例。

[0159] 实施例5

[0160] 位置B460的修饰对于增强青霉素G酰基转移酶的合成生产力是至关重要的。

[0161] 基于突变体I设计突变体5和12。突变体5在对照基础上额外具有位置B460上的亮氨酸对苯丙氨酸的代替。与突变体5类似，突变体12中位置B460上的苯丙氨酸也被亮氨酸代替，但是目前位置B24上的丙氨酸又被额外转回为苯丙氨酸，就像在许多野生型青霉素G酰基转移酶中在该位置上所观察的那样。编码突变体5和12的基因通过基因合成获得，并且如前文所述被转化至Escherichia coli并在其中表达。发酵后用超声处理Escherichia coli,从而将青霉素G酰基转移酶从细胞释放。通过离心去除细胞碎片后,通过PMSF滴定测定上清液中活性蛋白质的浓度。

[0162] 突变体5和12应用于头孢氨苄的合成中，而野生型酰基转移酶(SEQl)、对照酰基转移酶和突变体I被作为对照包括在内。结果在下文中展示。

[0163]表 7

[0164]

[0165] 突变体1、5和12共同之处在于位置B460上的苯丙氨酸被亮氨酸代替。对所有三种突变体而言，所述修饰提高了合成活性，而不显著降低S/Η比例。在大部分情况下，S/Η甚至被改进。

[0166] 实施例6

[0167] 头孢氨苄和头孢拉定合成中多种组合体的表现

[0168] 突变体I和7选自为了经改进的氨苄西林/6-APA进行的筛选，期间将突变体酰基转移酶用于PGM、6-APA和氨苄西林的混合物。突变体I也选自为了头孢氨苄合成中经改进的生产力而进行的筛选。在突变体I和突变体7中观察到的突变可以通过不同的方式组合。突变体6和8-11是此类组合的例子。可以如前文所述通过基因合成、转化和在Escherichiacoli中的表达获得突变体。这些突变体中一些的测试结果展示于表8中。

[0169] 表8.与其亲本突变体I和7相比，重组体突变体6和突变体8在头孢氨苄和头孢拉定合成中的表现。

[0170]

[0171] 通过组合突变体I和突变体7的突变得到的组合体显示，在某些方面此类杂交体能够超越其亲本的表现。

[0172] 实施例7

[0173] 由6-APA和HPG甲基酯生产阿莫西林

[0174] 将表中所示，被固定的酶装入装有筛底和搅动器的2升不锈钢反应器，所述筛底具有140 μ m的孔。通过添加水将体积调节至1000ml。将内容物冷却至10°C，并借助于蠕动泵使反应器内容物在筛底上流通。

[0175] 添加162.2g 6-氨基青霉烷酸，之后添加HPGM (见表)。通过添加水将体积调节至1500ml。搅动混合物并使其在筛上流通。将温度维持在10°C。监测pH。最初pH约为6.3，一段时间后提高至约7，随后降低。在pH小于pH = 6.3的时间点，反应几乎完全。在(添加HPGM后约2小时)所述时间点从回流线中采样，过滤并通过HPLC分析。多个实验的结果展不于表9中。

[0176] 对具有突变体I和1.06当量HPGM的反应混合物(表中转化10)进行进一步加工。从筛下采取反应混合物，直至被固定的酶几乎阻塞筛。随后向不锈钢反应器中的混合物添加水，同时从筛下采取混合物，直至收集的总悬浮液具有3000ml的体积。

[0177] 通过添加相同量的6-APA和HPGM同时使用反应器中已经存在的相同的酶，将转化10再重复3次。将这4次连续的转化10的悬浮液合并，并进行再结晶。将悬浮液加热至25°C，并将混合物引入一系列5个经搅动的管中，每管30ml。通过重力溢流将混合物从一个经搅动的管转移至下一个管。悬浮液的流速是3000ml/h。同时以下述速率向第一个管添加35% HC1，所述速率使得悬浮液中的沉淀物恰好溶于一系列5个经搅动的管中。在10 μ m滤器上流水线式过滤酸性溶液，并引入结晶器中。在所述结晶器中，通过添加25%NaOH将pH维持在pH = 3.7，温度被维持在20°C。通过重力溢流至第二个结晶器，将体积维持在2250ml。在所述结晶器中，在20°C下通过添加25% NaOH将pH维持在pH = 5.0。通过重力溢流至经搅动的管中，将第二结晶器中的体积维持在750ml。所述管中的内容物被冷却至:TC。所述管中的停留时间是4小时。过滤结晶悬浮液，用水洗涤(1.51/kg产物)并在通风炉中于35°C下干燥至恒定重量。阿莫西林三水合物的产率(基于添加的6-APA计算)为91% (摩尔/摩尔)。

[0180] *HPGM相对于6-APA的摩尔当量

[0181] 实施例8

[0182] D-苯基甘氨酸-甲基酯(PGM)溶液的合成

[0183] D-苯基甘氨酸-甲基酯(PGM)溶液的合成基本如W02008/110527中所述进行。

[0184] 将90g PG悬浮于170ml甲醇中，并添加73.2g浓硫酸。将混合物在约73°C下保持回流2小时，并在减压下浓缩(p = 20mm Hg，T = 75-80°C )。添加170ml甲醇，并将混合物再次于回流下保持2小时，并在减压下浓缩。再添加170ml甲醇，并将混合物在回流下保持2小时，并在减压下浓缩。最后添加125ml甲醇。在I小时中于20°C下将溶液按量倒入第二反应器中，所述第二反应器已被预先装入了 20ml甲醇。用氨水将pH保持于3.5。形成固体，通过过滤去除所述固体。用25ml水稀释得到的母液并在减压下浓缩(p = 20mm Hg，T = 40-45°C )。最后获得 207.5g PGM 溶液。

[0185] 实施例9

[0186] 头孢氨苄的酶促合成

[0187] 将指出的量不同的经固定的酰基转移酶装入具有175 U m筛底的反应器，其中对测试的所有酰基转移酶而言固定颗粒的蛋白质负荷是相同的。随后在25°C下添加21.4g7-ADCA和95g水，并用25%氨水将pH调节至7.0。在120分钟内以恒定速率将实施例8中获得的38g PGM溶液按量加入反应器中。用氨水将pH維持在7.0。温度被保持在25°C。30分钟后，添加0.25g固体头孢氨节(晶种)。45分钟时头孢氨节开始结晶。从120到150分钟，用25%硫酸将pH保持在7.0下。随后用25%硫酸将pH降低至5.7。

[0188] 使用向上搅拌，经由底部筛排空反应器。将得到的头孢氨苄悬浮液滤过玻璃滤器。将得到的母液转移回反应器中。将该步骤顺序重复五次。随后用2x10ml水洗涤酶。藉此，将> 98%的头孢氨苄与固体生物催化剂分离。

[0189] 合并头孢氨苄湿滤饼、母液和洗涤用水，并将温度保持于2V。用浓硫酸将合并的湿滤饼和母液的PH降低至1.5。并将得到的溶液滤过0.45 y m滤器。[0190] 将20g水和1.0g头孢氨苄(晶种)装入结晶反应器。在80分钟内于30°C下将上述酸性头孢氨苄溶液按量加入结晶反应器中。用氨水将pH保持在5.0。随后在20°C下将悬浮液再搅拌30分钟。将悬浮液滤过玻璃滤器，并用2x15ml水和2x15ml丙酮洗涤湿滤饼。

[0191]表 10.[0192]

[0193] n.d.=未測定；n.a.=不适用

[0194] 实施例10

[0195] 由7-ADCA和HPG甲基酯生产头孢羟氨苄

[0196] 将指出的量的不同的被固定的酰基转移酶装入具有175 iim筛底的反应器中。随后在 10°C下添加 17.7g 7-ADCA、15.6g HPGM、0.02g H)TA 和 123g 水，并用 25%氨水将 pH调节至7.2。酶促反应在10°C下进行，并用甲酸将pH保持在7.2。

[0197]表 11.[0198]

[0199] 实施例11

[0200] 头孢拉定的酶促合成

[0201] 将指出的量的不同的被固定的酰基转移酶装入具有175 iim筛底的反应器中。随后在20°C下添加14.82g 7-ADCA和50g水，并用25%氨水将pH调节至6.9。

[0202] 将18.5g DHPGM.MSA溶于20ml水中，并在150分钟内以恒定速率将溶液按量加入反应器中。用氨水将PH维持在7.0。将温度保持在20°C。30分钟后，添加0.25g固体头孢拉定(晶种)。在460分钟时用25%硫酸将pH降低至5.7。由于DHPG测量的不准确性，S/H不能以足够的准确性被測定。

[0203]表 12.[0204]