糖肽类抗耐药菌抗生素及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类糖肽类抗耐药菌化合物Tyrocidine A糖基衍生物和其盐类，及其制备方法和用途。化学结构通式如下：其中，X为乙基及乙氧乙基；Y为各种单糖或二糖。药理实验表明，本发明的化合物对部分耐药菌株显示出很强的抑制活性，与现有临床应用的抗耐药菌药物相比，具有高效、低毒、抗菌谱广等优点，因此可用于制备抗耐药菌药物。

权利要求

1.一类糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其药学上可接受的盐，Tyrocidine A糖基衍生物结构通式如下：其中，X是乙基，Y是木糖。

2.根据权利要求1所述的糖肽类抗耐药菌抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其药学上可接受的盐类，其特征在于药学上可接受的盐类是盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐或甲磺酸盐。

3.如权利要求1所述的糖肽类抗耐药菌抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其药学上可接受的盐类在制备治疗细菌感染药物中的应用，该细菌是金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、肠球菌。

说明书

糖肽类抗耐药菌抗生素及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物和其盐类，以及它们的制备方法和用途。

背景技术

[0002] 众所周知，抗生素的市场销售额每年都超过250亿。但是，耐药菌株的出现限制了当前临床上抗生素的治疗效果，抗生素耐药(AntimicrobialResistance)已经成为一个全球性的问题。越来越多的细菌出现耐药，其耐药水平也越来越高。由于多重耐药的发生，对付耐青霉素金黄色葡萄球菌的抗生素几乎只有万古霉素一种有效，而且对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌也已经在日本和美国出现，引起世界范围内的关注。毫无疑问，解决细菌对抗生素的耐药问题将成为本世纪科研的主要热点课题。目前临床应用的抗生素大多存在毒副作用大、抗菌谱窄、易产生耐药性等缺陷，有效的抗生素尤其是对耐药菌有效的抗生素十分缺乏，远不能满足需要。

[0003] Tyrocidine A是从枯草杆菌里分离出来的环十肽，化学结构如下所示：

[0004]

[0005] Tyrocidine A是当前开发新型抗生素的研究热点之一。该分子由8个L型氨基酸和2个D型氨基酸组成(Battersby，A.R.；Craig，L.C.J.Am.Chem.Soc.1952，74，4019-4023.)。研究表明Tyrocidine A具有很强的抗菌活性，尤其是对多种耐药菌株也有很强的抑制活性，例如对耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(MRSE)和对万古霉素耐药的肠球菌(VRE)的MIC值都为16μg/mL，并且已经应用于临床抗感染治疗。但是，研究发现Tyrocidine A也存在一些缺点限制了它的临床应用，例如水溶性差，溶血作用强及有神经毒性等。近年来，国内外多个研究小组对Tyrocidine A的结构进行了改造，以期发现高效低毒的新型抗耐药菌抗生素。这些研究中最具代表性的当数哈佛大学Walsh研究小组用分离出的细菌的酶结合传统的固相合成方法(Kohli，R.M.；Walsh，C.T.；Burkart，M.D.Biomimetic synthesis and optimizaion of cyclic peptide antibiotics.Nature
2002，418，658-661)。在2003年，郭志宏小组利用磺酰胺树脂作为固相载体能获得较高纯度的直链Tyrocidine A前体并且实现了在水溶液中进行直链十肽环合(Qin，C.；Bu，X.；
Zhong，X.；Ng，N.L. J.；Guo，Z.Optimization ofantibacterial cyclic decapeptides.J.Comb.Chem.2004，6，398-406)固相合成后，直链前体进行脱保护和环合最后得到Tyrocidine A的总收率为25％。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一类高效、低毒、广谱、抗耐药菌的糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物，及其制备方法和用途。

[0007] 鉴于多肽进行糖基化通常能够提高其水溶性和降低毒性，并同时能够提高其本身的生物活性。本发明以固相和液相相结合的技术，首次以化学全合成的方法获得了系列的Tyrocidine A糖基衍生物。经体外抗耐药菌活性测试表明，这些化合物对部分耐药菌的有显著抑制活性，部分化合物药理活性强于Tyrocidine A。

[0008] 本发明提供一类糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其药学上可接受的盐，Tyrocidine A糖基衍生物结构通式如下：

[0009]

[0010] 其中，X为乙基或乙氧乙基；

[0011] Y为单糖或二糖，单糖为葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖、鼠李糖、甘露糖或乙酰氨基葡萄糖；二糖为麦芽糖或乳糖。

[0012] 本发明的化合物为单一构型。Y的1位碳的羟基和X通过糖苷键相连。Y为甘露糖时，糖苷键为α型；Y为葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖、鼠李糖、乙酰氨基葡萄糖、麦芽糖或乳糖时，糖苷键为β型。

[0013] 上述通式的化合物药学上可接受的盐类是盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐或甲磺酸盐。

[0014] 优选化合物是：Tyrocidine G1(表2中化合物1a)，Tyrocidine G2(表2化合物1b)，Tyrocidine G3(表2化合物1c)，Tyrocidine G4(表2化合物1d)，TyrocidineG8(表2化合物1h)，Tyrocidine G9(表2化合物1i)，Tyrocidine G10(表2化合物1j)，Tyrocidine G11(表2化合物1k)，Tyrocidine G13(表2化合物1m)和Tyrocidine G17(表2化合物
1q)。

[0015] 本发明还提供了上述糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其盐的制备方法如下：

[0016] 第一步：制备直链糖肽(4a-r)，以2-氯三苯基氯树脂为起始原料与N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸钠发生取代反应得到树脂(2)，在通过常规的固相直链肽合成反应(反应试剂二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑)合成直链糖肽3a-r，最后通过5％的醋酸-二氯甲烷将直链肽从树脂上切下，得粗品直链糖肽4a-r。

[0017] 第二步：制备环状糖肽(5a-r)，直链肽的环合采用常见的环合条件(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/1-羟基苯并三唑/N，N-二异丙基乙胺)，以二氯甲烷为溶剂进行反应，得全保护环状糖肽5a-r。

[0018] 第三步：制备脱保护后环状糖肽(1a-r)，全保护环状糖肽5a-r通过10％钯碳催化氢化脱去糖上的苄基，再通过三氟乙酸脱去氨基酸上的保护基得目标化合物1a-r。

[0019] 具体反应式如下：

[0020]

[0021] 本发明部分目标化合物X、Y基团搭配和高分辨质谱数据见表1。

[0022] 表1.本发明部分化合物的X、Y基团搭配和质谱数据表

[0023]

[0024] 本发明还提供了上述糖肽类抗生素Tyrocidine A糖基衍生物及其盐在制备抗菌药物中的应用，特别是在制备抗耐药菌药物中应用。

[0025] 本发明化合物通过药理实验，对部分耐药菌表现出较强的抑制活性，与现有临床应用的抗耐药菌药物相比，具有高效、低毒、抗菌谱广等优点，因此可用于制备抗耐药菌药物。

[0026] 本发明制备方法产率高，化合物抗耐药菌效果好，且具有高效、低毒、抗真菌谱广等优点，本发明为制备抗耐药菌药物提供了新的糖肽类化合物。

具体实施方式

[0027] 现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

[0028] 实施例1：制备直链糖肽(4a-r)

[0029] 固相合成直链肽：将100mg 2-氯三苯甲基氯树脂和N-(9-芴甲氧羰基)-D-苯丙氨酸(100mg)置于洗干净的固相反应器中，加入二氯甲烷(5mL)和N，N-二异丙基乙胺(0.2mL)，室温振荡反应3h，抽滤并用甲醇和二氯甲烷分别洗涤树脂两遍，真空干燥。向装有干燥好的树脂的固相管内加入5mL哌啶/N，N-二甲基甲酰胺(v/v，1∶4)溶液，室温振荡反应2h。抽滤，用二氯甲烷洗三遍。真空干燥。再将称量好的(40mg，0.3mmol)、N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸(67mg，0.2mmol)、二环己基碳二亚胺(62mg，0.3mmol)置于25mL茄形瓶内，加2mL N-甲基吡咯烷酮溶解，再加3mL二氯甲烷，室温振荡0.5-1h。过滤，滤液倒入第一步干燥好的装有树脂的固相管内，室温振荡4-5h。抽滤，并用N-甲基吡咯烷酮洗一遍，二氯甲烷洗两遍。真空干燥。脱9-芴甲氧羰基保护同上面所述方法，再以与接N-(9-芴甲氧羰基)-L-脯氨酸相同的方法依次接入N-(9-芴甲氧羰基)-D-苯丙氨酸，N-(9-芴甲氧羰基)-L-亮脯氨酸，N-(9-芴甲氧羰基)-N′-(叔丁氧羰基)-L-鸟氨酸，N-(9-芴甲氧羰基)-L-缬氨酸，N-(9-芴甲氧羰基)-O-叔丁基-L-酪氨酸，N-(9-芴甲氧羰基)-N′-三苯甲基-L-谷氨酰胺，糖氨基酸(a-r，结构如下)，N-(9-芴甲氧羰基)-D-苯丙氨酸后，合成保护了的直链糖肽。在脱9-芴甲氧羰基保护后，向固相管内加入乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷(1∶2∶16，15mL)，室温振荡1h将肽与树脂分离开，抽滤，滤液加入甲苯后真空浓缩得到直链糖肽为白色粉末(收率，90％-95％)。

[0030]

[0031] 实施例2：制备环状糖肽(5a-r)

[0032] 环合是利用常见的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)条件下进行。在圆底烧瓶内将PyBOP(187mg，3当量)，1-羟基苯并三唑(49mg，3当量)，N，N-二异丙基乙胺(0.062mL，6当量)溶于270mL二氯甲烷。将直链完全保护的糖肽溶于270mL二氯甲烷后，以每秒钟一滴缓慢滴入圆底烧瓶。室温磁力搅拌过夜，用质谱监测反应完全后，真空浓缩后凝胶层析得产物5a-r为白色粉末(收率80％-90％)。

[0033] 实施例3：Tyrocidine G1(表中化合物1a)的制备

[0034] 将化合物5a溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1a，为白色固体粉末。

[0035] 实施例4：Tyrocidine G2(表中化合物1b)的制备

[0036] 将化合物5b溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1b，为白色固体粉末。

[0037] 实施例5：Tyrocidine G3(表中化合物1c)的制备

[0038] 将化合物5c溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1c，为白色固体粉末。

[0039] 实施例6：Tyrocidine G4(表中化合物1d)的制备

[0040] 将化合物5d溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1d，为白色固体粉末。

[0041] 实施例7：Tyrocidine G8(表中化合物1h)的制备

[0042] 将化合物5h溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1h，为白色固体粉末。

[0043] 实施例8：Tyrocidine G9(表中化合物1i)的制备

[0044] 将化合物5i溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1i，为白色固体粉末。

[0045] 实施例9：Tyrocidine G10(表中化合物1j)的制备

[0046] 将化合物5j溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1j，为白色固体粉末。

[0047] 实施例10：Tyrocidine G11(表中化合物1k)的制备

[0048] 将化合物5k溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1k，为白色固体粉末。

[0049] 实施例11：Tyrocidine G13(表中化合物1m)的制备

[0050] 将化合物5m溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1m，为白色固体粉末。

[0051] 实施例12：Tyrocidine G17(表中化合物1q)的制备

[0052] 将化合物5q溶于30mL二氯甲烷/甲醇(v/v，1∶1)，加入10％的钯碳(100mg)，通入氢气，室温反应过夜，停止反应，过滤，真空浓缩，再溶于10mL三氟乙酸/二氯甲烷/三乙基硅(v/v/v，0.4∶1.6∶0.2)溶液，室温条件下反应2h，脱去氨基酸上的保护基，反应用质谱监测，反应结束后，加入甲苯然后真空浓缩。脱保护后的粗品产物通过制备液相进行纯化并冻干得到糖肽产物1q，为白色固体粉末。

[0053] 本发明的实施不限于以上实施例，其余目标化合物制备时，采用相应Y基团的糖，相应X连接基团的侧链作为原料，方法同上。

[0054] 实施例中所用试剂均为市售分析纯，制备液相所用溶剂为色谱纯。

[0055] 实施例13：体外抑菌实验：

[0056] 1.实验方法：采用常规的体外抑菌实验方法

[0057] (1)实验菌株

[0058] 本实验选用了以下9种常见的人体致病的细菌菌株作为筛选对象：

[0059] 标准菌株：金黄色葡萄球菌26003，肺炎双球菌31002，肠球菌32220；

[0060] 耐药菌株：肠球菌08083，肠球菌08085，金黄色葡萄球菌11408，金黄色葡萄球菌11542，肺炎双球菌11013，肺炎双球菌11028。

[0061] (2)培养基

[0062] Mueller-Hinton(M.H)琼脂培养基，批号20100304

[0063] Mueller-Hinton Broth(M.H)肉汤培养基，批号20101021

[0064] 无菌绵羊血，批号20110220

[0065] (3)试验方法

[0066] 采用琼脂双倍稀释法(中国药典2010版，药品微生物实验室规范指导原则)测定最低抑菌浓度(MIC50)。含药平皿制备：

[0067] 将取各受试药物样品，先用灭菌水溶解成1000μg/mL，再用灭菌水对倍稀释成500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98、0.49μg/mL浓度。取上述各稀释液