源于BCap37的乳腺癌耐药细胞株及其应用转让专利
申请号 : CN201010502654.6
文献号 : CN102268406B
文献日 : 2013-03-13
发明人 : 范伟民 , 蒋东海 , 隋梅花
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明提供了两株源于同一亲代细胞BCap37的P-gp依赖型和非P-gp依赖型的乳腺癌耐药细胞株及其应用。本发明提供了两种新型乳腺癌耐药细胞株Bats-72和Bads-200，两者均起源于BCap37细胞，Bats-72不表达P-gp蛋白，而Bads-200过表达P-gp。这表明Bats-72是非P-gp依赖耐药细胞株，而Bads-200是P-gp依赖型的耐药细胞株。这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究肿瘤耐药机制和逆转肿瘤多药耐药、提取肿瘤耐药标志物、筛选和评估新型肿瘤药物、单克隆抗体药物的生产等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
权利要求 :
1.一种非P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bast72，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201065。
2.一种P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bads200，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201066。
3.如权利要求1或2所述的乳腺癌耐药细胞株bast72或bads200在构建体内外肿瘤耐药模型中的应用。
4.如权利要求1或2所述的乳腺癌耐药细胞株bast72或bads200在筛选抗肿瘤药物中的应用。
说明书 :
源于BCap37的乳腺癌耐药细胞株及其应用
(一)技术领域
[0001] 本发明涉及两株源于同一亲代细胞BCap37的乳腺癌耐药细胞株及其应用。(二)背景技术
[0002] 恶性肿瘤是目前包括中国在内的世界上许多国家最主要的致死原因之一(CA Cancer J Clin.2005，55：74-108.)。世界卫生组织(WHO)在美国亚特兰大召开的2008年国际肿瘤学年会上提出警告，到2010年癌症将取代心血管病成为世界死亡人数最多的疾病。我国卫生部统计资料显示，我国每年新增肿瘤患者160～170万，现有肿瘤患者总数约450万，居致死疾病的首位。化疗是全世界目前治疗肿瘤的主要手段之一，尽管不断研制出新的化疗药物，也不断应用新的化疗方案，但是恶性肿瘤获得性耐药导致最终治疗失败。肿瘤耐药机制十分复杂，不同的耐药逆转机制之间又存在错综复杂的关系。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是其中的重要机制。多药耐药是肿瘤细胞免受外来有害物质损伤的自身防御机制，是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生抗药性的同时也对其它从未接触过的、结构和作用机制完全不同的抗肿瘤药物产生抗药性。许多天然来源的抗肿瘤药物如紫杉醇类、长春新碱类，蒽环类等会诱导肿癌细胞产生MDR。
[0003] ATP结合盒膜转运蛋白超家族(ATP-binding cassette，ABC)具有ATP依赖性的药物外排泵功能，能将药物泵出细胞膜外而降低胞内药物浓度，是目前MDR的主要机制。其中P-gp蛋白(P-glyeoprotein，P-gp)是目前研究较广泛的耐药机制。1976年，Juliano和Ling在具有MDR表型的中国仓鼠卵巢细胞上发现一种跨膜糖蛋白，是分子量为170KD的跨膜磷酸糖蛋白(Biochim Biophys Acta，1976，455(1)：152-162.)。肿瘤细胞膜上的P-gp过度表达，化疗药物与其结合后，导致ATP结合区活化，ATP水解释放能量，在Mg2+的作用下使P-gp形态发生变化，在药物尚未发生细胞毒作用时，即将其泵出细胞外，降低了细胞内药物的浓度，使得细胞免受化疗药物的毒性作用而产生了MDR(Biochem Pharmacol，2002，64(5-6)：943-948.)。目前研究发现人类几乎所有肿瘤细胞中均可检测到MDR1基因，在结肠癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、胆囊癌、胆管癌等癌肿中，P-gp均有不同程度的表达。耐药细胞依据P-gp表达与否，分为P-gp依赖型和非P-gp依赖型。
[0004] 通过耐药细胞株的建立可以进一步构建体内外肿瘤耐药模型，从而深入研究MDR耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制。2004年Yi Wang等人曾报道了通过转染mdr1基因构建的高度表达P-gp的Bcap37细胞。亲代Bcap37细胞和高表达P-gp的Bcap37耐药株可用于P-gp底物的筛选及作为研究药物生物学分布和药物动力学的模型(World Journal ofGastroenterology 2004，10(9)：1365-1368)，但这是在BCap37细胞中导入外源性的MDR1基因，具有一定的局限性。Masashi Takeda等筛选出耐紫杉醇的DU145和PC-3细胞株，并用表观遗传学和DNA芯片技术分析其潜在的分子耐药机制(The Prostate 2007，67：955-967)，但只得到了P-gp依赖型的耐药细胞株。
(三)发明内容
(三)发明内容
[0005] 本发明目的是提供两株源于同一亲代细胞BCap37的P-gp依赖型和非P-gp依赖型的乳腺癌耐药细胞株及其应用。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 一种非P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bast72，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201065。
[0008] 一种P-gp依赖型乳腺癌耐药细胞株bads200，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期：2010年8月17日，保藏编号：CCTCC No：C201066。
[0009] 本发明细胞株采用改创的“两阶筛选法”获得，其中Bats-72通过依赖于紫杉醇高剂量冲击时间递增的“两阶筛选法”获得，Bads-200通过依赖于紫杉醇剂量递增的“两阶筛选法”获得。“两阶筛选法”分为耐药性适应阶段和巩固阶段。在适应阶段注重于让肿瘤细胞逐渐适应于药物(如紫杉醇)刺激，并不断地扩增药物处理后的存活细胞；而在巩固阶段则是通过加强药物刺激强度，对逐渐适应于药物刺激存活细胞的耐药性状进行巩固。
[0010] 普通药物高剂量冲击诱导肿瘤细胞耐药株，都是短时间固定冲击(通常为1～6小时)，所得细胞株耐药系数不高，相关细胞特性不突出，而依赖于药物高剂量冲击时间递增的“两阶筛选法”可将冲击时间提高至72h，可大幅提高所得细胞株耐药性状，本发明提供的耐药株Bats-72对紫杉醇的耐药性是其亲代BCap37细胞的113.5倍。
[0011] 本发明乳腺癌耐药细胞株Bats-72的具体筛选操作为：1)适应阶段；BCap37细胞用增殖培养液(含10％小牛血清的1640培养液)，5％CO2，37℃条件下，培养至70％～90％贴壁率时，去上清，加入200nM紫杉醇培养液(含200nM紫杉醇的增殖培养液)冲击培养1小时，去200nM紫杉醇培养液，空白1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72-96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70％～90％贴壁率时，再重复用200nM紫杉醇培养液冲击培养1小时2次，即总共完成3次200nM紫杉醇培养液冲击培养1小时，细胞命名为Bats-1。进一步以Bats-1细胞为基础，重复上述操作，将筛选条件依次改为200nM紫杉醇培养液冲击培养2、4、12、24、和48小时，依次获得Bats-2、Bats-4、Bats-12、Bats-24、Bats-48细胞。
2)巩固阶段：以Bats-48细胞为基础，用200nM紫杉醇培养液冲击培养72小时，换殖培养液扩增48h，重复10次，得至Bats-72细胞。
2)巩固阶段：以Bats-48细胞为基础，用200nM紫杉醇培养液冲击培养72小时，换殖培养液扩增48h，重复10次，得至Bats-72细胞。
[0012] 而普通药物剂量递增诱导法筛选肿瘤细胞耐药株至少需要近一年的时间，而依赖于药物剂量递增的“两阶筛选法”可大为缩减筛选时间，本发明提供的耐药株Bads-200仅需约3个月时间，对紫杉醇的耐药性是其亲代BCap37细胞的1137.5倍。
[0013] 本发明乳腺癌耐药细胞株Bads-200的具体筛选操作为：1)适应阶段；BCap37细胞用增殖培养液，5％CO2，37℃条件下，培养至70％-90％贴壁率时，去上清，加入5nM紫杉醇培养液(含5nM紫杉醇的增殖培养液)持续培养72小时，去5nM紫杉醇培养液，空白1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养48-72h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至
70％-90％贴壁率时，再重复用5nM紫杉醇培养液持续培养72小时2次，即总共完成3次
5nM紫杉醇培养液持续培养72小时，细胞命名为Bads-5。进一步以Bads-5细胞为基础，重复上述操作，将筛选条件依次改为10nM，20nM，50nM，100nM紫杉醇培养液持续培养72小时，依次获得Bads-10、Bads-20、Bads-50、Bads-100细胞。2)巩固阶段：以Bads-100细胞为基础，一直用200nM紫杉醇培养液持续培养，得至Bads-200细胞。
70％-90％贴壁率时，再重复用5nM紫杉醇培养液持续培养72小时2次，即总共完成3次
5nM紫杉醇培养液持续培养72小时，细胞命名为Bads-5。进一步以Bads-5细胞为基础，重复上述操作，将筛选条件依次改为10nM，20nM，50nM，100nM紫杉醇培养液持续培养72小时，依次获得Bads-10、Bads-20、Bads-50、Bads-100细胞。2)巩固阶段：以Bads-100细胞为基础，一直用200nM紫杉醇培养液持续培养，得至Bads-200细胞。
[0014] 所述的乳腺癌耐药细胞株bast72或bads200可用于构建体内外肿瘤耐药模型，进一步可用于筛选新的抗肿瘤药物。
[0015] 本发明提供了两种新型乳腺癌耐药细胞株Bats-72和Bads-200，两者均起源于BCap37细胞，Bats-72不表达P-gp蛋白，而Bads-200过表达P-gp。这表明Bats-72是非P-gp依赖耐药细胞株，而Bads-200是P-gp依赖型的耐药细胞株。这一特有的生物学特性使其可以广泛应用于研究肿瘤耐药机制和逆转肿瘤多药耐药、提取肿瘤耐药标志物、筛选和评估新型肿瘤药物、单克隆抗体药物的生产等，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。(四)附图说明
[0016] 图1为BCap37，Bats-72和Bads-200细胞在倒置光镜和Giemsa染色后在正置显微镜下拍摄的照片；
[0017] 图2为BCap37，Bats-72和Bads-200细胞生长曲线检测；
[0018] 图3紫杉醇对BCap37，Bats-72和Bads-200细胞毒性检测；
[0019] 图4为BCap37，Bats-72和Bads-200细胞P-gp表达检测；其中阳性对照为MCF7/ADR；
[0020] 图5为多西紫杉醇，长春瑞滨，阿霉素，依托泊苷，5-氟尿嘧啶，顺铂，甲氨蝶呤，健择对BCap37，Bats-72和Bads-200细胞的细胞毒性检测。(五)具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0022] 实施例1：BCap37，Bats-72和Bads-200细胞形态学检测
[0023] (1)实验材料：
[0024] 细胞株：紫杉醇敏感细胞株BCap37(从中科院上海细胞库定购)。两种新型细胞株Bats-72(CCTCC No：C201065)和Bads-200(CCTCC No：C201066)；
[0025] 试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)，超级新生牛血清(上海依科赛生物制品有限公司)，基本培养液(含10％新生牛血清的1640培养液)，筛选培养液(含200nM紫杉醇的基本培养液)，Giemsa染色试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)，35mm培养皿(Corning)；仪器：倒置显微镜，正置显微镜，细胞培养箱，超净工作台。
[0026] (2)实验方法
[0027] BCap37，Bats-72和Bads-200分别接种于35mm培养皿，BCap37和Bats-72使用基本培养液，Bads-200用筛选培养液，分别培养72小时，更换新鲜基本培养液，倒置显微镜上观察，拍照。
[0028] 去培养液，PBS洗涤2次，Giemsa染色(完全按照试剂盒操作说明)，正置显微镜下观察，拍照。
[0029] (3)实验结果
[0030] 结果见图1，与亲代细胞BCap37比较，Bats-72细胞体积增大，细胞间距增大，克隆生长相对松散；Bads-200形态学与BCap37差异不大，克隆生长相对更紧密，克隆边缘相对更规整。
[0031] (4)结论
[0032] Bats-72和Bads-200细胞形态上较BCap37有所改变。
[0033] 实施例2：BCap37，Bats-72和Bads-200细胞生长曲线检测
[0034] (1)实验材料
[0035] 细胞株：同实施例1；
[0036] 试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛)，基本培养液(含10％新生牛血清的1640培养液)，筛选培养液(含200nM紫杉醇的基本培养液)，100mm培养皿(Corning)，6孔板(Corning)；
[0037] 仪器：倒置显微镜，细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器。
[0038] (2)实验方法
[0039] BCap37，Bats-72和Bads-200接种于100mm培养皿，BCap37和Bats-72使用基本培养液，Bads-200用筛选培养液分别培养72小时，0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种2ml单细胞悬液至5块6孔板，每总细胞数为40000个。依据情况更换新鲜基本培养液，保证充足的营养成分，分别在24、48、72、96、120、144、168、196、240小时，消化3孔细胞计数，取平均值，绘制生长曲线，并计算细胞倍增时间。
[0040] (3)实验结果
[0041] 结果见图2，亲代细胞BCap37增殖最快，以平均每21.6小时倍增速度生长；Bads-200细胞次之，以平均每26.2小时倍增速度生长；Bats-72细胞增殖速度相对最慢，以平均每39.4时倍增速度生长；
[0042] (4)结论
[0043] Bats-72和Bads-200相对于亲代细胞BCap37增殖速度有不同程度的减慢。
[0044] 实施例3：紫杉醇对BCap37，Bats-72和Bads-200细胞毒性检测。
[0045] (1)实验材料
[0046] 细胞株：紫杉醇敏感细胞株BCap37，两种新型细胞株Bats-72和Bads-200试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛)，基本培养液(含10％新生牛血清的1640培养液)，筛选培养液(含200nM紫杉醇的基本培养液)，100mm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO(上海国药)，MTT，紫杉醇。
[0047] 仪器：细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。
[0048] (2)实验方法
[0049] BCap37，Bats-72和Bads-200接种于100mm培养皿，BCap37和Bats-72使用基本培养液，Bads-200用筛选培养液分别培养72小时，0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过液，加入紫杉醇处理，BCap37细胞处理浓度为0、1、2、5、10、20、50、100、200、500nM。Bats-72和Bads200细胞处理浓度为(05、10、20、50、100、200、500、1000、
2000、5000nM紫杉醇处理72h，去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。
2000、5000nM紫杉醇处理72h，去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。
[0050] (3)实验结果
[0051] 结果见图3，紫杉醇对BCap37、Bats-72和Bads-200细胞的IC50分别为4、454和4550nM，Bats-72的耐药系数为113.5，Bads-200的耐药系数为1137.5。
[0052] (4)结论
[0053] 相对于BCap37，Bats-72和Bads-200对紫杉醇产生了不同程度的耐受。实施例4：多西紫杉醇，长春瑞滨，阿霉素，依托泊苷，5-氟尿嘧啶，顺铂，甲氨蝶呤，健择对BCap37，Bats-72和Bads-200细胞的细胞毒性检测。
[0054] (1)实验材料
[0055] 细胞株：紫杉醇敏感细胞株BCap37，两种新型细胞株Bats-72和Bads-200试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛)，基本培养液(含10％新生牛血清的1640培养液)，筛选培养液(含200nM紫杉醇的基本培养液)，100mm培养皿(Corning)，96孔板(Corning)，DMSO(上海国药)，MTT，多西紫杉醇，长春瑞滨，阿霉素，依托泊苷，5-氟尿嘧啶，顺铂，甲氨蝶呤，健择(Gemzer)；仪器：细胞培养箱，超净工作台，血球细胞计数器，酶标仪。
[0056] (2)实验方法
[0057] BCap37，Bats-72和Bads-200接种于100mm培养皿，BCap37和Bats-72使用基本培养液，Bads-200用筛选培养液分别培养72小时，0.25％胰酶消化，收集细胞，细胞计数，配制20000个/ml浓度的单细胞悬液，分别每孔接种0.2ml单细胞悬液至96孔板，每总细胞数为4000个，培养过液，加入药物处理处理，处理终浓度如下：多西紫杉醇为0、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、和5000nM；长春瑞滨为0、10、20、50、100、200、500、1000、
2000、和5000nM；阿霉素为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000和10000nM；依托泊苷为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200uM；5-氟尿嘧啶为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100和
200uM；顺铂为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000和10000nM；甲氨蝶呤为0、1、2、5、
10、20、50、100、200和500nM；健择为5、10、20、50、100、200、500、1000和2000nM。药物处理
72h，去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。
2000、和5000nM；阿霉素为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000和10000nM；依托泊苷为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200uM；5-氟尿嘧啶为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100和
200uM；顺铂为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000和10000nM；甲氨蝶呤为0、1、2、5、
10、20、50、100、200和500nM；健择为5、10、20、50、100、200、500、1000和2000nM。药物处理
72h，去上清，加入0.2ml DMSO，酶标仪570nM波长检测OD值。
[0058] (3)实验结果
[0059] 实验结果如图4和表1所示，Bats-72和Bads-200对多西紫杉醇、长春瑞滨、阿霉素、依托泊苷都耐受，对5-氟尿嘧啶、顺铂都不耐受，但是Bats-72对甲氨蝶呤，健择耐受，Bads-200对甲氨蝶呤、健择却不耐受；
[0060] BCap37Bats-72和Bads-200细胞的IC50分别为4、454和4550nM，Bats-72的耐药系数为113.5，Bads-200的耐药系数为1137.5。
[0061] (4)结论
[0062] Bats-72和Bads-200为选择性多药耐药细胞株，并且两者的耐药性存在差异，可组合用于新的抗肿瘤药物的筛选和抗肿瘤药物耐药机制的研究。
[0063] 实施例5：BCap37，Bats-72和Bads-200P-gp细胞形态学检测
[0064] (1)实验材料
[0065] 细胞株：紫杉醇敏感细胞株BCap37，两种新型细胞株Bats-72和Bads-200，P-gp阳性细胞株MCF7/ADR(从中科院上海细胞库定购)。
[0066] 试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺)，0.25％胰酶(杭州吉诺)，超级新生牛血清(上海依科赛)，基本培养液(含10％新生牛血清的1640培养液)，筛选培养液(含200nM紫杉醇的基本培养液)，PBS，Tween-20，100mm培养皿(Corning)，蛋白裂解液(碧云天生物技术有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，一抗anti-P-gp(Santa Cruz，sc-55510)，二抗(Santa Cruz，sc-2005)，ECL试剂盒，显影暗匣，X-胶片，0.45um PVDF膜。
[0067] 仪器：细胞培养箱，超净工作台，酶标仪。
[0068] (2)实验方法
[0069] 细胞接种于100mm培养皿，培养Cap37和Bats-72使用基本培养液，Bads-200用筛选培养液分别培养72小时，0.25％胰酶消化，收集细胞，分别加入0.15～0.3ml细胞裂解液，冰浴裂解30分钟，12000g离心30分钟，取上清。按BCA蛋白定量试剂盒操作说明进行蛋白浓度测定。配制7.5％浓度分离胶，上样40ug蛋白量，SDS-PAGE操作，100V，150分钟条件下，将蛋白转移至0.45um PVDF膜上。5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃孵化过夜，二抗室温孵化3小时，按ECL试剂盒操作进行显影。
[0070] (3)实验结果
[0071] 结果见图5，Bats-72与亲代细胞BCap37一样，为P-gp阴性，而Bads-200则高表达P-gp。
[0072] (4)结论
[0073] Bats-72是非P-gp依赖耐药细胞株，而Bads-200是P-gp依赖的耐药细胞株。