具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞漆酶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞(Coprinus comatus)漆酶及其制备方法。本发明所提供的毛头鬼伞漆酶，按照包括以下步骤的方法制备：1)破碎细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)中收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶，得到的漆酶即为毛头鬼伞提取物，所述漆酶的分子量为64KD且N末端序列见序列表序列1。依据本发明的制备方法所获得的毛头鬼伞提取物对癌症细胞增殖和HIV反转录酶活性都有明显的抑制作用，在癌症药物和抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。

权利要求

1.毛头鬼伞（Coprinus comatus）提取物的制备方法，包括以下步骤：

1）破碎细胞；

2）收集蛋白粗提物；

3）从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶，得到的漆酶即为毛头鬼伞提取物，所述漆酶的分子量为64KD且N末端序列见序列表中序列1；

所述从步骤2）收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶包括如下步骤：a）将从步骤2）收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：第一步洗脱用pH6.8-7.5的磷酸缓冲溶液A洗脱；第二步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；第三步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；所述磷酸缓冲溶液A的溶质为

3.5-4.5mM NaH2PO4和5.5-6.5mM Na2HPO4，溶剂为水；

b）将从步骤a）获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是CM，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：第一步洗脱用pH6.1-6.8的磷酸缓冲溶液B洗脱；第二步洗脱用pH6.1-6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；第三步洗脱用pH6.1-6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.15M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；所述磷酸缓冲溶液B的溶质为

5.75-6.75mM NaH2PO4和3.2-4.2mM Na2HPO4，溶剂为水；

c）将从步骤b）获得的洗脱峰进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是Q；所采用的洗脱程序为进行NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为3.5-4.5，溶质为NaCl，溶剂为醋酸缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是200分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在200分钟内由0M线性升至0.15M；所述醋酸缓冲溶液的溶质为7.7-8.7mM醋酸和1.3-2.3mM醋酸钠，溶剂为水；

d）将从步骤c）获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括64KD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为

25:1～50:1。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a）阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b）阳离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤c）阴离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤d）凝胶过滤层析的介质为Superdex75。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤a）中第一步洗脱用pH7.0的所述磷酸缓冲溶液A洗脱；第二步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；第三步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；所述磷酸缓冲溶液A的溶质为

3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水；

所述步骤b）中第一步洗脱用pH6.6的所述磷酸缓冲溶液B洗脱；第二步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；第三步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱：溶质是0.15M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；所述磷酸缓冲溶液B的溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水；

所述步骤c）中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4.0，所述醋酸缓冲溶液的溶质为8.2mM醋酸和1.8mM醋酸钠，溶剂为水；

所述步骤d）中所述得到具有漆酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：pH值为8.5的0.2M的NH4HCO3水溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤d）所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30:1。

5.由权利要求1-4中任一所述的制备方法得到的提取物。

6.根据权利要求5所述的提取物，其特征在于：所述提取物的分子量为64KD且N末端序列见序列表序列1。

7.权利要求5或6所述的提取物在制备下述任一产品中的应用：A）抑制癌症细胞增殖的产品；

B）改善癌症患者健康状况的产品；

C）抑制HIV-1反转录酶活性的产品；

D）改善艾滋病患者健康状况的产品。

8.含有权利要求5或6所述的提取物的产品，所述产品为下述任一产品：A）抑制癌症细胞增殖的产品；

B）改善癌症患者健康状况的产品；

C）抑制HIV-1反转录酶活性的产品；

D）改善艾滋病患者健康状况的产品。

说明书

具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞漆酶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞漆酶及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 毛头鬼伞(Coprinus comatus)，又称鸡腿菇，其分类地位隶属于担子菌门、层菌纲、伞菌目、鬼伞科、鬼伞属。毛头鬼伞是一种质地脆而滑、口感鲜美的食用菌，在我国和欧洲国家都有食用的传统。毛头鬼伞具有高蛋白、低脂肪等优良特性，兼具有食药同源的作用。据分析，每100g干品中含粗蛋白25.4g、脂肪3.3g、总糖58.8g、纤维7.3g、灰分12.5g，含有20种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸全部具备，毛头鬼伞还含有钾、钠、钙、镁、磷等元素和铁、铜、锰、锌、钼、钴等微量元素以及多种维生素、风味物质、生物碱等。毛头鬼伞已被定为符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)要求的，集天然、营养、保健三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一。据报道，毛头鬼伞具有益胃、清神、治痔等中药疗效；从药用功能上分析，毛头鬼伞具有降低血糖、抗线虫、降低血脂、调节免疫力等功效，但是国内外对于其生物活性作用的研究还很不充分，从未见到该菌抑制HIV反转录酶活性的报道，以及该菌蛋白质具有抗肿瘤活性的研究。

[0003] 由于化学抗癌药物的毒副作用较大，食药用菌的抗肿瘤活性受到了广泛的关注，这类活性代谢产物主要以大分子化合物为主，目前研究报道较多的是食用菌多糖类物质，它们主要通过调节宿主的免疫功能、活化巨噬细胞、促进T细胞增殖、诱导产生免疫因子等作用发挥体内抗肿瘤的功效，而对肿瘤细胞直接的杀伤作用较小。2000年李师鹏、苏蕾等人发现毛头鬼伞粗多糖CcP以12.5mg/kg的剂量腹腔注射可明显抑制昆明种小鼠S-180实体瘤的活性，并延长腹水瘤小鼠的存活期。但是对于毛头鬼伞生物活性酶体外直接杀伤癌症细胞的研究未见报道。

[0004] 艾滋病是严重威胁人类健康的病毒性传染病。艾滋病病毒HIV属于反转录病毒科的慢病毒亚科。反转录是HIV病毒最重要的特征之一，过程就是在病毒体内反转录酶的作用下以病毒RNA为模板合成病毒DNA的过程。在反转录过程中，反转录酶起着重要作用，这也是研究抗艾滋病药物的最佳靶点之一，目前正在研制的大部分药物都是以HIV的反转录为靶点的。Mitsuya等首先发现脱氧胸苷类AZT具有显著的抑制艾滋病病毒的作用，随后研究又陆续发现脱氧核苷、无环核苷、核苷类似物能有效的抑制HIV的复制，但这些抑制剂的耐药问题日益突出，并且具有严重的毒副作用。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的毛头鬼伞漆酶及其制备方法。

[0006] 本发明所提供的毛头鬼伞漆酶，按照包括以下步骤的方法制备：1)破碎细胞；2)收集蛋白粗提物；3)从步骤2)中收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶。所述漆酶的分子量为64KD且N末端序列见序列表序列1。

[0007] 所述步骤2)中，采用离心的方式收集蛋白粗提物，所使用的离心力为6010-15151g，如12000g。

[0008] 从步骤2)收集的蛋白粗提物中分离纯化漆酶包括如下a)～d)四步：

[0009] a)将从步骤2)收集的蛋白粗提物进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：

[0010] 第一步洗脱用pH6.8-7.5的磷酸缓冲溶液洗脱A；第二步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；第三步洗脱用pH6.8-7.5的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.5-4.5mM NaH2PO4和5.5-6.5mM Na2HPO4，溶剂为水；

[0011] b)将从步骤a)获得的洗脱峰进行阳离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阳离子交换柱层析中所采用的阳离子交换基团是CM，所采用的洗脱程序包括如下三步洗脱：

[0012] 第一步洗脱用pH6.1-6.8的磷酸缓冲溶液B洗脱；第二步洗脱用pH6.1-6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；第三步洗脱用pH6.1-6.8的如下溶液洗脱：溶质是0.15M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；所述磷酸缓冲溶液B的溶质为5.75-6.75mM NaH2PO4和3.2-4.2mM Na2HPO4，溶剂为水；

[0013] c)将从步骤b)获得的洗脱峰进行阴离子交换柱层析，收集具有漆酶活性的洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是Q；所采用的洗脱程序为进行NaCl线性洗脱，所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为3.5-4.5，溶质为NaCl，溶剂为醋酸缓冲溶液；所述线性洗脱的时间是200分钟，所述线性洗脱中NaCl的浓度在200分钟内由0M线性升至0.15M；所述醋酸缓冲溶液的溶质为7.7-8.7mM醋酸和1.3-2.3mM醋酸钠，溶剂为水；

[0014] d)将从步骤c)获得的洗脱峰进行凝胶过滤层析，得到具有漆酶活性的洗脱峰；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括64KD，所用的层析柱的柱长度和柱内径比为25∶1～50∶1。

[0015] 所述步骤a)阴离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤b)阳离子交换柱层析的载体为Cellulose，所述步骤c)阴离子交换柱层析的载体为Sepharose，所述步骤d)凝胶过滤层析的介质为Superdex 75。

[0016] 所述步骤a)中第一步洗脱用pH7.0的所述磷酸缓冲溶液A洗脱；第二步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；第三步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱：溶质是0.2M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液A；所述磷酸缓冲溶液A的溶质为3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水；

[0017] 所述步骤b)中第一步洗脱用pH6.6的所述磷酸缓冲溶液B洗脱；第二步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱：溶质是0.1M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；第三步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱：溶质是0.15M NaCl，溶剂是所述磷酸缓冲溶液B；所述磷酸缓冲溶液B的溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水；

[0018] 所述步骤c)中所述NaCl线性洗脱中所用的NaCl线性洗脱液的pH值为4.0，所述醋酸缓冲溶液的溶质为8.2mM醋酸和1.8mM醋酸钠，溶剂为水；

[0019] 所述步骤d)中所述得到具有漆酶活性的洗脱峰是用如下溶液洗脱得到的：pH值为8.5的0.2M的NH4HCO3水溶液。

[0020] 所述步骤d)所用的层析柱的柱长度和柱内径比为30∶1。

[0021] 本发明的另一个目的是提供一种毛头鬼伞提取物，该提取物的分子量为64KD且N末端序列见序列表序列1。

[0022] 所述的提取物在制备下述任一产品中的应用也是本发明的保护范围：

[0023] A)抑制癌症细胞增殖的产品；B)改善癌症患者健康状况的产品；C)抑制HIV-1反转录酶活性的产品；D)改善艾滋病患者健康状况的产品。

[0024] 依据本发明的制备方法所获得的毛头鬼伞漆酶对癌症细胞增殖和HIV反转录酶活性都有明显的抑制作用，是一种新型的抗病毒抑制剂，在癌症药物和抗艾滋病新药研究领域中具有重要价值。

附图说明

[0025] 图1为DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析洗脱图谱。

[0026] 图2为CM-Cellulose弱阳离子交换柱层析洗脱图谱。

[0027] 图3为Q-Sepharose强阴离子交换柱层析洗脱图谱。

[0028] 图4为FPLC-Superdex 75凝胶过滤层析洗脱图谱。

[0029] 图5为毛头鬼伞漆酶SDS-PAGE电泳鉴定图谱。标准分子量(购自GE Healthcare公司)从上到下依次为：磷酸化酶b(94KD)，牛血清白蛋白(67KD)，卵清蛋白(43KD)，碳酸酐酶(30KD)，大豆胰岛素抑制剂(20KD)，乳白蛋白(14.4KD)。

具体实施方式

[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0032] 实施例1、毛头鬼伞(Coprinus comatus)漆酶的分离纯化与鉴定

[0033] 本发明的原材料是由从毛头鬼伞(Coprinus comatus)(中国普通微生物保藏管理中心，编号CGMCC 5.615)子实体中分离出来的，利用PD培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，加水至1000ml)，在如下条件下发酵得到菌丝体：将毛头鬼伞菌种接种到综合PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水至1000ml)平板上进行活化，25℃恒温培养，待菌丝长满平板后将其接种到PD培养基中，25℃ 160rpm摇瓶培养7天后，再转接一次液体摇瓶培养7天后收集菌丝体，存于-20℃冰箱内待用。

[0034] 1、提取与粗级分离

[0035] 用0.15M的NaCl溶液悬浮毛头鬼伞菌丝体，利用组织捣碎机进行组织破碎至菌丝体为糊状，并于4℃放置12小时后，8000rpm(12000g)离心15min，收集上清溶液，得到菌丝粗提液；向菌丝粗提液中加入(NH4)2SO4至80％饱和度，于4℃条件下静置4小时，8000rpm(12000g)离心15min，收集沉淀，得到蛋白粗提物，蒸馏水溶解沉淀蛋白粗提物并在蒸馏水中透析12-16小时。

[0036] 2、离子交换柱层析分离纯化

[0037] 层析柱利用相应的缓冲溶液以4ml/min的流速平衡8-10个柱体积后，利用pH计测定层析柱流出液的pH值以确定层析柱是否平衡好，透析后的蛋白粗样品以1.5ml/min的流速匀速上样，待样品上完后，将流速调制2.5ml/min(Q-Sepharose层析为1ml/min)进行洗脱，各洗脱峰利用漆酶活性检测方法确定是否为活性峰。

[0038] DEAE-Cellulose层析柱洗脱时选用添加0、0.1M、0.2M和1M NaCl进行分步洗脱；CM-Cellulose层析柱洗脱时选用添加0、0.1M、0.15M和1M NaCl进行分步洗脱；Q-Sepharose层析柱洗脱时选用添加0-0.15M NaCl进行线性洗脱。

[0039] (1)DEAE-Cellulose弱阴离子交换柱层析

[0040] 透析后的蛋白粗提物经过pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水)平衡后，经DEAE-Cellulose(Sigma公司，D0909)弱阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为100ml。进行四步洗脱，流速2.5ml/min。第一步洗脱用pH7.0的磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水)洗脱2.58个柱体积；
第二步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱3.29个柱体积：溶质是0.1M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水)；第三步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱2.13个柱体积：溶质是0.2MNaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH2PO4和
6.1mM Na2HPO4，溶剂为水)；第四步洗脱用pH7.0的如下溶液洗脱2.87个柱体积：溶质是
1.0M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为3.9mM NaH2PO4和6.1mM Na2HPO4，溶剂为水)。

[0041] 收集得到的洗脱峰进行漆酶活性检测，结果表明第三步洗脱得到的第三洗脱峰D3(图1中洗脱体积为第588-721ml，即第5.88-7.21个柱体积)为目标提取物的活性峰(其漆酶活性为95.1U/mg)，将D3活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。

[0042] (2)CM-Cellulose弱阳离子交换柱层析

[0043] D3组分经过pH6.6的磷酸缓冲溶液(溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水)平衡后，经CM-Cellulose(Sigma公司，C0805)弱阳离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为50ml。进行四步洗脱，流速2.5ml/min。第一步洗脱用pH6.6的磷酸缓冲溶液(溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水)洗脱7.14个柱体积；第二步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱4.2个柱体积：溶质是0.1M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水)；第三步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱2.38个柱体积：溶质是0.15M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水)；第四步洗脱用pH6.6的如下溶液洗脱1.68个柱体积：溶质是
1.0M NaCl，溶剂是磷酸缓冲溶液(溶质为6.25mM NaH2PO4和3.7mM Na2HPO4，溶剂为水)。

[0044] 收集得到的洗脱峰进行漆酶活性检测，结果表明第三步洗脱得到的第三洗脱峰D3C3(图2中洗脱体积为第568-630ml，即第11.34-12.6个柱体积)为目标提取物的活性峰(其漆酶活性为646.8U/mg)，将D3C3活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。

[0045] (3)Q-Sepharose强阴离子交换柱层析

[0046] D3C3组分经过pH4.0的醋酸缓冲溶液(溶质为8.2mM醋酸和1.8mM醋酸钠，溶剂为水)平衡后，经Q-Sepharose(GE Healthcare公司，17-0510-10)强阴离子交换柱层析。该离子交换柱的柱体积为10ml。进行200分钟的NaCl线性洗脱，流速1ml/min。该NaCl线性洗脱溶液pH值为4.0，溶质为NaCl，溶剂为醋酸缓冲溶液(溶质为8.2mM醋酸和1.8mM醋酸钠，溶剂为水，NaCl的浓度在200分钟内由0M线性升至0.15M。

[0047] 收集得到的洗脱峰进行漆酶活性检测，结果表明得到的第二洗脱峰D3C3Q2(图3中洗脱体积为第121-200ml，即第13-20个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的漆酶活性为721.1U/mg)，将D3C3Q2活性峰在蒸馏水中透析10-12小时。

[0048] 3、凝胶过滤层析

[0049] D3C3Q2组分经FPLC-Superdex 75(GE Healthcare公司，17-5174-01)凝胶过滤层析，洗脱液为pH 8.50.2M NH4HCO3溶液，层析柱规格30cm(柱长)×1cm(内径)，上样体积为0.2ml，流速为0.8ml/min。收集得到的洗脱峰进行漆酶活性检测，结果表明得到的第一洗脱峰D3C3Q2SU1(图4中洗脱体积为第8.8-11.2ml，即第0.37-0.47个柱体积)为目标提取物的活性峰(该活性峰的漆酶活性为790.9U/mg)。

[0050] 上述漆酶活性均按照如下方法检测：

[0051] 收集洗脱峰，利用BCA蛋白定量试剂盒(北京博迈德科技公司，PP0103)测定洗脱峰的蛋白含量，利用下述漆酶活性测定方法测定出洗脱峰的活性，通过计算得出每毫克蛋白中存在的酶活力单位数。

[0052] 漆酶活性测定方法：以2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物，将其配置成0.34mg/ml的酸性溶液(pH值为2.8)，10μl样品中加入190μl的上述底物，37℃反应5分钟后，在波长400nm处测定吸光值，以蒸馏水代替酶液进行反应作为对照。酶活力单位定义为：37℃时每分钟每毫升反应体系在400nm处产生1个吸光值所需要的酶量。

[0053] 4、超滤浓缩

[0054] D3C3Q2SU1活性峰在蒸馏水中透析10-12小时，在4℃进行截留分子量为3KD的超滤浓缩后，于-80℃条件下至完全冰冻，将冰冻样品冻干成粉备用，该干粉即为漆酶纯品，也即本发明保护的毛头鬼伞提取物。该漆酶纯品的漆酶活性为790.9U/mg(漆酶活性测定方法同上)。将该漆酶纯品进行SDS-PAGE电泳鉴定，并结合凝胶过滤层析洗脱曲线确定该提取物的大小为64KD(见图5)。

[0055] 5、氨基酸序列测定

[0056] 采用自动化EDMAN降解法对漆酶纯品的N末端氨基酸序列进行测定，用Hewlett Packard 1000A配有HPLC系统的蛋白序列测定仪测定N末端序列，测得序列见序列表序列1。

[0057] 实施例2、毛头鬼伞(Coprinus comatus)漆酶的功能检测

[0058] 1、体外抑制肿瘤细胞增殖的功能检测

[0059] 1)精确称取实施例1得到的漆酶纯品，以无血清培养液配置成不同剂量溶液(见表1)，以检测体外抑制肿瘤细胞增殖的活性；

[0060] 2)选取人肝癌细胞株HepG2(ATCC公司，HB-8065)和人乳腺癌细胞株MCF-7(ATCC公司，HTB-22)为检测对象，培养HepG2和MCF-7至细胞进入对数生长期时，将细胞按照密3
度为8×10 个/孔的比例接种到96孔板内，并以含有血清的培养液培养6小时，以使细胞全部贴壁；

[0061] 3)去掉血清培养液，用PBS(北京鼎国昌盛生物技术有限公司，BF-0013)洗涤细胞，换入无血清培养液，并加入不同剂量的毛头鬼伞漆酶溶液，共培养48小时；

[0062] 4)去除细胞培养液，利用MTT法检测细胞的增殖情况，计算抑制率。

[0063] 抑制率(％)＝A540nm(漆酶处理的样品))/A540nm(未处理的对照)×100％[0064] 表1不同剂量毛头鬼伞漆酶对肿瘤细胞增殖的抑制率

[0065]

[0067] 其中，IC50为抑制率达到50％时漆酶的浓度。

[0068] 2、抑制HIV-1反转录酶活性的功能检测

[0069] 1)精确称取实施例1得到的漆酶纯品，配置成不同剂量溶液(见表2)，以检测抑制HIV-1反转录酶的活性；

[0070] 2)使用Non-radioactive reverse transcriptase ELISA试剂盒(Roche公司，11468120910)对毛头鬼伞漆酶进行抑制HIV-1反转录酶(HIV-1RT)的活性测定。

[0071] 抑制率(％)＝(A405正对照-A405样品)/(A405正对照-A405负对照)×100％[0072] A405正对照：反应体系中不含有毛头鬼伞漆酶，含有HIV-1反转录酶[0073] A405负对照：反应体系中不含有HIV-1反转录酶及毛头鬼伞漆酶

[0074] 表2不同剂量毛头鬼伞漆酶对HIV-1反转录酶的抑制率

[0075]