调控玉米氮吸收利用和干旱胁迫基因OS1及应用

摘要

调控玉米氮吸收利用和干旱胁迫基因OS1及应用本发明公开了参与玉米氮素感应、吸收等生物学途径，同时调节玉米的抗旱性基因OS1及其应用，该发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。通过调控该基因的表达水平能够提高玉米和其它农作物氮素吸收效率和抗旱性能。该基因的氨基酸残基和编码框如SEQ ID NO：1、3所示。

权利要求

1.OS1基因在调控玉米氮吸收利用和干旱胁迫中的应用，其特征在于，所述的OS1基因编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基。

说明书

调控玉米氮吸收利用和干旱胁迫基因OS1及应用

技术领域：

[0001] 本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。本专利涉及的基因参与了玉米氮素感应、吸收等生物学途径，同时调节玉米的抗旱性，通过对该基因的深入研究能够提高玉米和其它农作物氮素吸收效率和抗旱性能。背景技术：

[0002] 氮是植物生长发育过程中重要的营养元素，氮占植物总干物质重量的1.5-2％，氮元素是植物不同组织大分子物质的重要组成元件，如蛋白质、核酸、叶绿体等，因此，植物必须从土壤中吸收足够的氮营养来满足自身的生长发育(Marschner，1995)。植物吸收氮的形式包括有机氮(oganic nitrogen)和无机氮(inoganic nitrogen)两种类型，其中豆科(legume)作物可以通过固氮菌(Rhizobium)利用多种形式的氮(Vance，1992；Burris，1993；Schauser，1999)。硝态氮(nitrate)和铵态氮(ammonium)等无机氮源是植物吸收和利用主要形式(Hageman，et al.，1988；Lawlor，et al.，1989)，对农作物的生长发育包括叶绿体形成、根的生长以及作物的产量形成有着至关重要的作用(lam，1996；Lawler，et al.，2001)。植物缺氮的情况下会表现为光合能力和光合效率减低，结果造成植物生长受阻以及作物产量下降，这主要归因于叶绿体、二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose bisphosphate carboxylase)等光合元件受阻(Delgado，et al.，1994)。在农业生产当中，为了保证农作物的产量，氮肥的用量不断加大(Frink，et al.，1999)，但是利用效率并没有得到提高，造成50-70％氮肥不能够被农作物吸收(Peoples，et al.，1995)，这在一等程度上造成资源的白白浪费，同时给环境带来了一定的压力，并引起严重的环境氮源污染(zhu，2000；Good，et al.，2004)，在农作物玉米中已经证实通过提高植物的耐低氮特性并减少氮肥的使用量来保持或增加作物产量(Tollenaar，1999)，近年来，通过对早期的玉米杂交种和当前的杂交种的产量研究证明，与早期的玉米杂交种相比(Castleberry et al.，1984；McCullough et al.，1994)，新培育出的杂交种在低氮环境条件下能够更好的生长(Duvick，1984，1997；
Ding et al.，2005)。因此，随着植物基因组学研究的不断深入，寻找并克隆氮吸收调控相关基因，开展植物氮元素吸收和转运过程的调节机制、信号传导途径等研究是提高氮营养高效的很好途径。

[0003] 氮在植物的生长发育过程中不但是重要的营养来源，同时还是重要的信号物质，该物质调节植物生长发育过程中的叶形态发育、主根和侧根结构、开花期和茎分支生成等重要生理过程(Crawford，et al.，2002)，同时还调节氮和碳代谢过程相关基因的表达(Crawford，1995；Stitt，1999)。植物生长的土壤环境往往会受到雨水冲蚀、微生物消耗等原因使得氮素含量水平浮动很大，因此，植物必须通过多种自身调节机制来适应这种氮素水平变化(Good，et al.，2004)。当环境中的氮水平降低到一定程度的时候，植物就会通过某种机制来调控自身的生长来适应氮素的胁迫(Meiet al.，1984；Khamis et al.，1990)，如：延缓生长(Bongue-Bartelsman et al.，1995；Ono et al.，1996)、降低光合效率(Geiger et al.，1998)、自身成熟组织的氮素重新利用(Chalker-Scott，1999)、积累大量花青素等(Ding et al.，2005；Diaz et al.，2006)。

[0004] Daniel等2005年研究发现，高亲和硝酸转运蛋白(high-affinity nitrate transporter)基因NRT2.1突变以后，植物对氮的吸收以及植株中的氮含量明显降低，同时突变体中的侧根补野生型要多，即使在不含氮的培养基中也会有同样的特点，这表明突变体的表型与硝态氮的有无、含量高低没有关系，最终结果表明，野生型中，NRT2.1表现为抑制侧根的发生，同时这种结果并不依赖硝态氮吸收和利用，推测该基因可能的功能是一个氮感知因子，或者是一个协调根系统发育的信号传递因子(Little，2005)；Remans等2006年通过研究发现，NRT1.1基因突变后，拟南芥的根结构发生变化，不能够感应到土壤中的硝态氮，从而抑制拟南芥的侧根生长发育，这种表型的出现不是因为根的硝态氮吸收水平降低，同时也不是氮形式(铵态氮)不同，而是因为氮信号传导途径中的重要基因ANR1的表达量显著降低所致，进一步研究发现，NRT1.1基因是通过调控硝态氮信号传导过程相关基因来影响根的结构，根结构的变化最终影响土壤环境中的氮营养的吸收(Remas，
2006)；Peng等2007年，对200个拟南芥T-DNA插入突变体进行筛选得到nla(nitrogen limitation adaptation)突变体，该突变体在氮胁迫的情况下(氮含量小于3mM)与野生型相比表现为极度早衰，在磷胁迫和高温胁迫下突变体和野生型没有表型差异，说明该基因是仅仅受氮的调控，进一步的研究表明发现该基因编码一个环型泛素连接酶(Ring-type ubiquitin ligase)，在野生型中，NLA蛋白与泛素结合酶8相互作用点状分布在细胞核中，突变体中nla蛋白由于该结合功能丧失不能够与泛素结合酶8结合最终造成在低氮情况下出现早衰等氮胁迫表现型(Peng，et al.，2007)；

[0005] Castaings等2009年，通过T-DNA插入进行大规模的突变体筛选，在拟南芥中的到了NLP7基因(NIN-Like protein7)，当该基因突变失活后，突变体中的硝态氮的含量比野生型明显偏高，但是总氨基酸含量、硝酸还原酶活性和谷氨酸合成酶活性在突变体中有所降低，与野生型相比表现为缺氮，同时突变体的抗旱性得到明显提高。通过进一步研究表明，该基因失活后，氮的传递信号被中断，不能够感应外界环境中的氮水平，最终造成突变体表现为氮胁迫的表型，亚细胞定位研究表明该基因定位在细胞核中，可能参与到氮吸收利用的下游基因的调控等。

[0006] 近年来，在模式植物拟南芥中对氮的感知、信号传递、以及不同氮水平的响应等机制的基因表达调控网络取得了很大进展，在高氮水平条件下通过NRT1.1来感应细胞外界环境的硝酸根离子(NO3-)，并负责把氮转移到细胞内部，在细胞内部，氮进一步调节氮相关调节、感应基因NIA，NIR和NRT2.1等来调节自身的生长发育状态，如主根和侧根的发育、蛋白质合成、籽粒休眠、氨基酸合成等一些列生理生化过程；在低氮情况下，NRT2.1首先感应并转运细胞外界氮(NO3-)，在细胞内部，低水平的氮通过调控miR169来增加植物的抗旱性；同时还通过调节氮胁迫响应基因NLP7和NLA的表达来调控下游基因进而来适应氮胁迫环境，氮作为信号调节物质来调控上百种基因的表达，从而来调节自身的生理过程、代谢过程、生长过程和发育过程，尽管很多感知氮的水平基因已经被克隆，然而我们对植物感知、传递氮信号分子机制的了解还很少。

[0007] 含有RWP-RK保守结构域的蛋白在C端有大约40-60个氨基酸保守区段，该保守区域最早在百脉根中发现，同时在拟南芥和水稻中也很保守(Schauser，1999，2005)，百脉根是重要的豆科植物，同时也是很好遗传研究的模式材料(Handberg，1992)，豆科作物的根可以和土壤中的固氮菌形成一种共生关系，通过特殊的信号传递过程，固氮菌就在跟中生长形成根瘤，同时吸收土壤和环境中的氮，同时把这些氮提供给植物，然后植物把光合产物C提供给固氮菌，相互提供营养。在这共生过程中NIN基因(nodule inception)起着很重要的信号感应和传导功能，百脉根(L.japonicus)中的基因NIN和莱茵衣藻(Chlamysomonas)中的Mid基因都有RWP-RK保守区域(Ferris，et al.，1996；Ferris，et al.，1997)，在莱茵衣藻中Mid基因在莱茵衣藻的配子体发育过程中决定负(-，minus gametes)的发育，mid基因启动负配子发育相关基因的表达，同时抑制正配子相关基因的表达，该基因在l莱茵衣藻配子体发育的整个过程中起着重要的调控作用，莱茵衣藻生殖细胞的交配型是在氮胁迫条件下产生(Schauser，1999，2005；Borisov，2003)，最终决定莱茵衣藻细胞的交配型(Ferris，et al.，1996)。

[0008] 然而，植物中含有RWP-RK保守结构域的基因很多，仅仅通过基因序列的保守结构域并无法知道具体哪一个或一些基因参与了氮素营养和抗旱性。本专利阐述了os1基因在玉米的氮素代谢以及抗旱胁迫中的功能。

发明内容

[0009] 玉米是我国的重要粮食作物，当前玉米对氮的利用很低，不但造成肥料份额巨大浪费，而且，化肥的大量滥用给环境造成重要的压力，由此对我国玉米生产和土壤环境造成巨大损失，同时，干旱也是影响玉米生产的重要因素。

[0010] 通过对控制突变体os1的基因克隆和功能研究，发现该基因参与了玉米的氮代谢调控途径，同时该基因突变以后os1具有很强的抗旱能力，因此，该基因参与了干旱胁迫调控途径以及玉米的干旱环境应答过程，这为培育氮高效和抗旱性玉米提供了条件。

[0011] 序列表中的SEQ ID NO：1为OS1基因的编码框所编码的蛋白质能够调控下游重要干旱胁迫响应基因以及氮素吸收代谢基因的表达；

[0012] 序列表中的SEQ ID NO：2为OS1基因的启动子可能是干旱和氮信号传递重要部位；

[0013] 序列表中的SEQ ID NO：3为编码框，编码蛋白质的序列是SEQ ID NO：1[0014] 序列表中的SEQ ID NO：4为该基因的终止子终止OS1基因的编码终止；

[0015] 序列表中的SEQ ID NO：5为该基因的全长(DNA水平)。

[0016] 利用本发明的基因编码的蛋白质序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核苷酸序列。氨基酸序列同源性较高的蛋白质一般具有相同的功能，因此在SEQ IDNo：2所示氨基酸序列具有80％及以上同源性的基因都可能拥有抗旱性及参与植物的氮利用。氨基酸的同源性可以通过http://www.ncbi.nhn.nih.gov/中blastP获得。通过上述方法获得的基因属于本发明的保护范围。
附图说明：

[0017] 图1、突变体和野生型的表型：A为Mo17籽粒胚面，B为Mo17籽粒胚乳透明度；C为突变体os1籽粒胚面，D为突变体os1籽粒胚乳透明度

[0018] 图2、os1基因的精细定位图

[0019] 图3、os1基因中的第二个外显子插入转座子结构图

[0020] 图4、两个等位基因突变位点图

[0021] 图5、os1突变体和野生型B73干旱处理10天的抗旱性表现(左图：os1，右图B73)。

[0022] 图6、B73背景下分离群体中的突变体和野生型干旱处理10天的抗旱性表现(左图：突变型，右图：野生型)。

[0023] 图7、郑58背景下分离群体中的突变体和野生型干旱处理10天的抗旱性表现(左图：突变型，右图：野生型)。

[0024] 图8、昌7-2背景下分离群体中的突变体和野生型干旱处理10天的抗旱性表现(左图：突变型，右图：野生型)。

[0025] 图9、H99背景下分离群体中的突变体和野生型干旱处理10天的抗旱性表现(左图：突变型，右图：野生型)。

[0026] 图10 OS1基因的亚细胞定位：A-F OS1基因的GFP融合蛋白在洋葱表皮的定位情况。A-C35S:GFP在GFP光通道(A)、光镜通道(B)和GFP与光镜叠加通道(C)；D-F35S:GFP:OS1在GFP光通道(D)、光镜通道(E)和GFP与光镜叠加通道(F)。

具体实施方式

[0027] 1、os1突变体表型分析：os1突变体表现为胚面变小，只有野生型的1/2-1/3大小，同时胚乳顶部发白并表现为不透明(图1)。突变体籽粒的含油量明显降低，但是籽粒中的营养成分：氨基酸的含量、部分金属、非金属离子、非蛋白氮等均没有差异。通过与野生型Mo17组配的6个世代进行的遗传规律分析表明，该突变体受单基因隐性控制。

[0028] 2、OS1基因的初定位和精细定位：以玉米籽粒胚面的大小和胚乳的透明与否为表型鉴定标准，用亲本os1和Mo17组配的回交分离群体(BC)对目标基因进行了精细定位，最终用3345个单株把该基因定位在了玉米第二号染色体短臂上2.03区大约250kb的区间(图2)。

[0029] 3、目标区域的候选基因分析：对目标基因所在的250kb区间进行基因注释以及候选基因的生物信息学分析，结果表明，该区域有3个候选基因，它们分别是：Cyclin-B2，HMG-1/2like protein，RWP-RK transcriptional factor。 测 序 结 果 表 明：RWP-RK transcriptional factor基因的第二个外显子上面有一个3.5kb的hAT家族的转座子插入(图3)。最终把该基因作为候选基因。

[0030] 4、新等位基因os1-Mu1的筛选：通过对3507个突变体家系的田间筛选，发现一个新的等位突变体，籽粒表型和os1表现一样，该家系的名称为L17627，并命名该突变体为os1-Mu1。

[0031] 5、os1和os1-Mu1基因的功能互补：对os1-Mu1和os1进行等位性测验发现，os1-Mu1和os1是受同一个基因控制，两个转座子的插入位点不同(图4)。最终通过新等位基因的发掘实现了该基因的功能互补。

[0032] 6、OS1基因的亚细胞定位：亚细胞定位表明，OS1基因编码的蛋白质定位在细胞核中，通过该种方法证明了该基因是一个转录因子(图10)。

[0033] 7、os1突变体受氮的调控：玉米的根部是感应培养基中的氮素营养最直接的部位，培养基中的营养元素发生变化以后势必影响根的生长和发育，通过对不用氮到4mM氮素两个氮素水平下的突变体和野生型根上部和下部生长变化进行了观察。根上部突变体和野生型在无氮和有氮的水平下表现差别很大，主要的差异表现在叶片上，无氮表现为褪绿；和野生型相比，突变体在有氮和无氮情况下都表现为长势较弱。根部中，突变体和野生型在无氮和有氮的水平下表现不明显；和野生型相比，突变体在有氮和无氮情况下都表现为根生长较弱。

[0034] 8、os1突变体和野生型的抗旱性分析：对突变体os1和野生型B73(图5)以及B73(图6)、郑58(图7)、昌7-2(图8)、H99(图9)等4个不同的遗传背景组配的回交分离群体BC1中的突变型和野生型的干旱处理，在10天不浇水的情况下，发现突变型的抗旱性比野生型有明显的提高。

[0035] 实施例1、OS1基因的精细定位

[0036] 根据B73的物理图谱，把标记umc2193和umc1845定位在B73的物理图谱上，界定两个标记的序列，并获得umc1845和umc2193两个标记之间已经测序的BAC序列，用这些公布的序列来开发新的标记，然后选择了12个BAC来开发SSR标记，根据重复序列两端的保守序列来设计引物，用这些新合成的标记对os1、Mo17以及它们组配的F1等3个样品进行多态性标记的筛选，最终开发了13对有多态性的分子标记，它们分别为AC2066221、AC2066222、AC2066225、AC2102034、AC199521MSPI、AC1940411、AC1940412、AC1910252、AC1975212、AC2021625、umc2215、IDP668、IDP3802。

[0037] 用离目标基因较远的标记umc213和umc1845继续从BC1分离群体中的大胚和小胚筛选重组单株，共计筛选了3345株，umc2193和umc1845两侧标记分别筛选了交换单株个数为54株、19株，共计73株，然后用以上13个新开发的标记对这73个重组单株进行进一步的基因型分析。

[0038] 最后，用新开发的标记对远离目标基因两侧的交换单株进行基因型分析，同时结合交换单株的表型，结果发现，IDP3802(P3)、AC2066221(P4)、AC2066222(P1)、AC2102034(P7)使左侧(umc2193)和目标基因之间的交换单株分别减少到38株、11株、11株和2株；AC1975212(P6)、umc2195(P2)、AC1910252(P8)、IDP668(P5)、AC1940411(P9)使右侧(umc1845)和目标基因之间的交换单株分别减少到15株、14株、14株、12株、10株；两侧的交换单株到标记AC199521MSPI(P10)(图2)的时候，所有的交换单株的都减少为零，这说明该标记在3345个回交分离群体中表现为和目标基因共分离。根据交换单株递减规律和三点测验等方法最终把目标基因锁定在ACC2102034(P7)和AC1940411(P9)之间，分别有2个和10个交换单株。对这个区域进一步分析发现该区域有两个重叠的BACs：AC210203和AC199521，两给BACs的长度分别是155kp和198kb，两个BACs有大约103kb重叠区域，除去重叠区域，两个标记的实际物理距离约为250kb(图2)。

[0039] 实施例2、目标区域的候选基因分析

[0040] 对目标基因所在的250kb区间进行基因注释以及候选基因的生物信息学分析，结果表明，该区域有3个候选基因，它们分别是：Cyclin-B2，HMG-1/2 like protein，RWP-RK transcriptional factor，在玉米中这些基因的功能均没有过报道。对候选基因进行了亲本间的测序分析，结果表明：候选基因Cyclin-B2，HMG-1/2 like protein在基因组水平上两个亲本间没有差异，RWP-RK transcriptional factor基因的第二个外显子上面有一个hAT家族的转座子插入，该转座子长度为3.5kb(图3)。通过候选基因的生物信息学分析，最终把RWP-RK transcriptional factor作为候选基因。

[0041] 实施例3、新等位基因os1-Mu1的筛选

[0042] 通过对3507个突变体家系的田间筛选，发现一个有花药增多的突变体，该家系的名称为L17627，并命名为os1-Mu1，然后用该突变分别与综31和B73进行杂交，杂交后再进行自交，在自交后代的籽粒中发现果籽粒性状有分离，经分析发现，这些分离的突变籽粒表型和os1的籽粒表型表现一样，遗传规律分析表明新等位基因os1-Mu1和os1一样，也是单基因隐性遗传。

[0043] 实施例4、os1和os1-Mu1基因的功能互补

[0044] 2009年冬在海南进行新等位基因os1-Mu1和os1的等位性测验，首先是把os1-Mu1和os1的突变籽粒进行单行种植，然后对两个突变体进行正反杂交和分别自交，结果发现os1-Mu1自交后代中的籽粒全部纯合，都表现为os1籽粒的突变类型，在杂交果穗F1的籽粒的也表现出胚面变小、胚乳不透明的突变表型。测序发现，2个突变体(os1和os1-Mu1)的扩增结果分别比野生型多出大约4.5kb和1.5kb左右，发现os1-Mu1突变体中的插入片段为Mu1转座子，实际大小为1.3kb，而该基因的其它位点均和野生型没有碱基差异。因此可以得出os1-Mu1和os1突变发生在同一个基因，两个转座子插入到OS1基因第二个外显子的不同位点(图4)。

[0045] 实施例5、OS1基因组全长cDNA的获得：

[0046] 根据基因注释结果(http://www.softberry.com)，注释软件为FGENESH-M。通过提取玉米自交系B73的叶片总RNA，然后进行反转录，然后对扩增产物进行测序。该基因全长为6278bp(Tss-PolA)，该基因有5个外显子，长度分别为：60bp，291bp，190bp，224bp，228bp；有4个内含子，长度分别为：117bp，161bp，3632bp，114bp，5’UTR(非翻译区)长度为
1289bp，3’UTR长度为30bp编码cDNA全长为993bp，编码331个氨基酸。

[0047] 实施例6、OS1基因的亚细胞定位

[0048] 金粉洗涤：称量15mg金粉并放入灭菌后的1.5ml的eppendorf离心管当中，这样结果是10X的量；在超净台下，向每个离心管中加入500ul冰冻(-20℃)无水乙醇，震荡15sec，在超净台上收集金粉到离心管管底部，静止30分钟，直到金粉全部沉淀；然后转速3000rpm离心60sec，彻底去除乙醇。再向离心管中加入冰浴的无菌ddH2O，用手指轻弹混匀，然后转速3000rpm离心60sec。重复上述步骤2-3次，最后一次用转速5000rpm离心15sec，然后移去上清，再用500ulddH2O悬浮。震荡15sec，然后快速悬浮混匀，边混边分装；
具体的分装方法是：先把10个离心管放好，用25ul的量分装，重复分装两次，第一遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50ul水，1.5mg金粉。然后盖上盖子于-20℃保存备用。

[0049] DNA包裹步骤：首先把要打枪的愈伤分成小块，堆积在渗透培养基(N6OSM)的中央区域，根据计划做准备；目的DNA的包裹先把分装好的金粉(-20℃)(每管1.5mg并保存在50微升超纯水当中)放在冰上，同时把CaCL2浓度为2.5M(4℃)和亚精胺浓度为0.1M(-70℃)也放在冰上融化，其中CaCL2和亚精胺分装成一次性使用的包装；用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入目的DNA(60-200ng)，迅速用手指轻弹使之混匀然后加入50微升CaCL2并用枪头轻轻吸吐使之混匀，然后加入20微升亚精胺，静置30秒把离心管放在漩涡振荡器上面震荡10分钟(注意使旋涡液体不要上升太高，同时使液体全部悬浮起来)；离心管放到冰上静置5分钟(如果震荡以后有金粉在液体表面漂浮，静置前再用手指轻弹使金粉沉淀下来)，然后2000rpm离心15秒，然后用吸头吸掉上清加入预冷(-20℃)的无水乙醇250微升，并用枪头轻轻(使20微升的枪调到10-13微升)吸吐混匀重复以上步骤3-4次，然后加入无水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因枪轰击。

[0050] 受体材料的轰击：用镊子撕取幼嫩洋葱表皮，切成2cm2左右的小片，将幼嫩的洋葱表皮摆放在含有相应载体抗生素的MS培养基中央区域紧密摆放，28℃预培养4h。选用650psi的破裂膜，用移液器将包裹后的15μl金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS-1000/He(Gene Gun System)型基因枪(Bio-Rad)进行轰击，轰击距离6cm，真空度为28In·Hg。轰击后的洋葱表皮细胞28℃暗培养24h后在共聚焦显微镜(Confocal:NIKON D-Eclipse C1，TE2000-E)下后观察GFP荧光。

[0051] GFP荧光的观察：小心的把基因枪轰击后的洋葱表皮从MS培养基中取下，背面朝上平铺在加有水的载玻片上，盖上盖玻片，用激光扫瞄共聚焦显微镜(Confocal:NIKON D-Eclipse C1，TE2000-E)观察GFP荧光。参数：激发光波长488nm，GFP荧光通过505-530nm的滤光片接收。通过构建OS1蛋白与GFP的融合表达载体，利用洋葱表皮细胞来观察OS1蛋白的亚细胞定位。结果表明：对照35S:sGFP分布在细胞质中(图10A-C)；35S:sGFP:OS1融合表达的绿色荧光蛋白定位在细胞核中(图10D-F)。

[0052] 实施例7、突变体os1和野生型的氮胁迫处理

[0053] 玉米水培生长：培养液为霍格兰缺氮营养液配方进行玉米上述材料的苗期培养，营养液以Ca(NO3)2·4H2O为氮源。玉米植株培养过程：选取大小均匀、籽粒饱满的玉米种子，先经10％的H2O2消毒20min。再用去离子水冲洗，于25℃催芽，露白后，在洗净的湿润沙床上发芽，一叶一心时，挑选长势一致的苗去除胚乳后移栽到有营养液的水培槽中培养。开始用1/2浓度营养液，3天后换成完全营养液，以后每隔两天更换一次，用电动气泵连续通气。培养25天。设0、4两个梯度，每个样品设二次重复。

[0054] 玉米的根部是感应培养基中的氮素营养最直接的部位，培养基中的营养元素发生变化以后势必影响根的生长和发育，通过对不用氮到4mM氮素两个氮素水平下的突变体和野生型根上部和下部生长变化进行了观察。

[0055] 根上部突变体和野生型在无氮和有氮的水平下表现差别很大，主要的差异表现在叶片上，无氮表现为褪绿；和野生型相比，突变体在有氮和无氮情况下都表现为长势较弱。根部中，突变体和野生型在无氮和有氮的水平下表现不明显；和野生型相比，突变体在有氮和无氮情况下都表现为根生长较弱。

[0056] 实施例8、突变体os1和野生型的干旱处理

[0057] 在温室环境条件下，用花盆(30X60mm)盛放同样重量的营养土和蛭石(1∶1混合)，然后在每个花盆中种植同样数量突变体和野生型籽粒，先按照正常的管理方式管理，等到幼苗长到3片叶的时候开始停止浇水，进行干旱处理，10天以后观察突变体和野生型的幼苗干旱反应情况。结果发现，突变体os1比野生型B73有较强的抗旱性能(图5)；在不同的遗传背景组配的回交分离群体BC1中，突变型比野生型也表现出明显的抗旱性：
B73(图6)、郑58(图7)、昌7-2(图8)、H99(图9)。

[0058] 序列表

[0059] <210>1

[0060] <211>331

[0061] <212>PRT

[0062] <213>玉米(Zea mays)

[0063] <400>1

[0064] MDAAVSTLTALAIFASTVEHAAYRSVQGYRVVGRKGGGWVRWERWVERQFVLSPSFPRCVEVALPAAAPRILPAGWRSRP

[0065] VFREGQTVDTWRCIVAFDSVAAVAPSSPPPPVLSPFVNPQLQYLSNLYNDLLMVFRFREEKTVPQLVNSKQPIRCGEQGK

[0066] TSDLGDASESDSDGDCQSGKELAPPVQKHTRANRKHIDSITLVDIAQYFHLPIRDASKTLKIGVSILKRKC

[0067] RQYGIPRWPHRKIKSLDSLIHDLEFVLAREDEDEEEEKQLQKDRLAAAINALTKRKSMLESEKETIQQKPA

[0068] MDLMAETKLFREDVFKRRYRAKSSVMDMD*

[0069] <210>2

[0070] <211>2397

[0071] <212>DNA

[0072] <213>玉米(Zea mays)

[0073] <400>2

[0074] CCCACGCCCCTCGGTTCCCGTCGACCCACCTATCCCTTTCCCGCATCAAGCCCCCCGGTGTACCACCCGACCGCCATCCA

[0075] TTGCGACCTCGGCCACATCCACCCCATGGCGACTCGTCGCGCCACCACCGTACTTCGCCCCGTCGACCGGTTGATACTGA

[0076] CGGTCGACGCTCCTCCGGACGCCTCCCCGGTTCCCTCCTCCATTCGCACCGCCCTCGCCAATCCCCAGTAGCGTCGAGCC

[0077] ATGGTGTAGGAGTACGCAATATGCGGCCCTGATGGCCAACCACACTTAGGACCTGGTGCCACGCTCACCATGCACCAACG

[0078] TGGTTACCGACAAGTGGATTTTCTGCCACAAGCAGACCTCAGATGTCTCACTCACTTGCTACAAGGTCTGTTGGGTCCTT

[0079] CGGGGCTTCACCTAGCGTCCCAGAGTGGACTACGACGAGACCTTCAGCCTTGTCGTCAAGTTCGCCATCGTTTGGACCGT

[0080] TTTCTCCCTCACCTTCTCCTAGGACTGGGTGGTCCATCAGCTCGATGTCAAGAATTCCTTCCTCCATGGCACTCTGATAG

[0081] AGACGGTCTACTATAGCTAGCCCACCGGCTTCGTCAACTCAGTTCGTTCGCTTACAGTACGACCTTAAGCAGGCGCCGCA

[0082] TGCCTGGTACAGTCGCTTCGCCTCCTACCTAGCCTCCCTCGACTTTGTCGAGGCCAAGTCGGACACGTCCCTATTCATCT

[0083] ACCGTCGCGGTGATGACACTTTCTACCTCCTGCTCTACGTCGATGACATTGTGCTCACGACATCCACCGCCGACCTTCTA

[0084] CAACACACGATTGACATCCTTCAGCGGGAGTTCACGATGAAGGACCTGTGACCTCTTCACCACTTCCTCGACATCAACAC

[0085] AGAGTGTCGGCCTCAGGGTCTCTTCCTCCACCAGCTCCAGTAGGGGTGGGCGTTCGGGTTACCCGAAAATTTCGGGTCGG

[0086] GTAATTCGGGTTTTTAAAATTTCGGGTTTTGAGAATCGATACCCGAAATTACAATGGGTTTTGCAATACCCGAAAATTCA

[0087] GGTACCCGGAATTTCGGGTTCGGGTTCGGGTATTCCCGAACTACCCGAATTATTGTGTCGGCTTCATAAAAACACATACA

[0088] CCCTATTAAATTAGTATAAAATATAGTTTGAATAATGATATACATGGACATATAAAACACAAGCAATCTACAATCACAAG

[0089] TTATGCACACTTACACATAATTGTAGATGTACAAATTAATAATTAAGCATGACATGAGTACATGACACATGAAAGTTCGG

[0090] GTAATTCGGTTACCCGATTGTGATACCCGAAATAAATTCGGGTTTTGCAAGTTGCTACCCGAAATTCCCGAACAAAATTC

[0091] GGGTTTCGGGTATTTCAGGTTCGGGTTCGGGTATTTCGGGTTCGGGTTTCGGGTTACGGGTTTTTTGCCCAGCCCTAAGC

[0092] GCCAATATGCTCTCGATATACTAGAGTGGGCTGACATGTCCGACTACAAGCCATGCTCTATGTCTGTATGTTGACTGGCA

[0093] GATCGGATTGATCACGGGGACGGTGGGGGAGCTTCCGGCAGGTGGTTCGGGGGTACGCCCGGGGCGATCAGGTGAGGGGG

[0094] AGGGATCGCCGAGACCATGGTGTTATCCATCCAACATAGCTTATTCTCTTTGAGCTTTTGAATATCAATTCTTGATGTTA

[0095] TTAATTTTAGAGACATCTTGCTATATCATGTAATTTCTTGGATGTCTCTTATTATGGTTAGAAAATCTATAGGCTCTTGG

[0096] TTGTACATGACTTAAATTTGCTTCTCCCTATTTCTGTGGATTTGGGCTCTGCGTTTGATGTGCGGCAAGCGTGTGAACGC

[0097] TGCGTGAATCGTGAATTCGTGATACACCGAAAAAAGCTGCTGGGTGCCGCTGCCGCGGGAATCTTGCGCAACTCTGAGCT

[0098] GGATTTGTTCTGTCGTGCGCGGGACCGCTCGGCGGTGTGAACTGCACTGCAGGATACACGTACGCATCACAAGAACCCAA

[0099] AACTTCAGGCCGCTGATCCGGTAATCCCACTGGCTGCTTCTGATGCACTTCTGTCGAAGGGACATCACACCACACACACC

[0100] AGTAATAACCAGGTCACTGCACAGCAGAATTCGCAAGCTTCCAAATGACAACTAGTGTGCTAGGATTACATGCTCCTCCA

[0101] CGTCAGAAGCCCGCCGTCCTCTTTGTCCTCTCCGGCTCTCCCCACCGCCAGAAAGGAAACGGACCCAACGCGATCGAAGT

[0102] CCACTGCCGTCTTCACTGCTGCCAGGCGCCAGCCACGGCCCACGGCCAATGCAATTGCAGTTGCAGTTGCAATTGCACGG

[0103] CACCCATTTCCAGAGCCGTCCTCAATTAGCTAGTCAAATCTCGCTATCCTTTCCCCACCATCCAGATCTTCCCTTTC

[0104] <210>3

[0105] <211>996

[0106] <212>DNA

[0107] <213>玉米(Zea mays)

[0108] <400>3

[0109] ATGGACGCCGCCGTCTCCACCCTCACCGCTCTCGCCATCTTCGCGAGCACCGTCGAGCACGCCGCCTACAGGAGCGTGCA

[0110] GGGGTATAGGGTGGTCGGGAGGAAAGGCGGCGGGTGGGTCCGTTGGGAGAGGTGGGTGGAGCGGCAGTTCGTCCTCTCCC

[0111] CCTCCTTCCCACGGTGCGTCGAGGTTGCCCTGCCCGCCGCCGCGCCGCGGATACTGCCAGCGGGGTGGCGCAGCCGGCCG

[0112] GTGTTCCGCGAGGGACAGACCGTCGACACTTGGCGTTGCATTGTGGCATTCGACTCCGTCGCCGCCGTCGCTCCGTCCTC

[0113] CCCGCCGCCGCCCGTGCTCTCCCCCTTCGTGAACCCACAGCTGCAGTATCTGTCTAATCTGTACAATGACCTGCTGATGG

[0114] TGTTTCGGTTTCGAGAAGAGAAAACGGTCCCACAACTCGTTAATTCAAAGCAACCCATCCGTTGTGGTGAACAGGGGAAA

[0115] ACTTCTGATTTGGGTGATGCATCGGAGTCCGATTCGGATGGGGATTGTCAATCTGGCAAAGAACTTGCACCACCAGTTCA

[0116] GAAGCATACAAGAGCCAACCGGAAGCATATAGATAGCATTACTTTAGTTGATATAGCTCAGTACTTCCATCTTCCAATCC

[0117] GAGATGCATCAAAGACACTCAAGATTGGGGTCAGCATATTGAAGAGGAAATGCCGACAGTATGGGATACCTCGTTGGCCT

[0118] CACCGGAAGATCAAGTCACTTGACTCTCTCATTCATGACCTTGAGTTCGTGCTAGCAAGAGAGGATGAGGATGAGGAGGA

[0119] GGAGAAGCAGCTGCAGAAGGACAGGCTGGCTGCTGCGATAAACGCCCTCACAAAACGGAAGAGCATGCTGGAGAGCGAGA

[0120] AGGAAACCATACAGCAGAAACCGGCCATGGACCTGATGGCTGAAACCAAGCTATTCAGGGAAGATGTTTTCAAGAGGAGA

[0121] TATAGGGCCAAAAGTTCAGTCATGGATATGGATTAG

[0122] <210>4

[0123] <211>546

[0124] <212>DNA

[0125] <213>玉米(Zea mays)

[0126] <400>4

[0127] CATTTCTCTTTAGCTGATAATACCTGGTGTAAAAAGATATGGCTGATCGAACCTGTTTGTAAAGAGATAATCGATCCATGTGTACCGCCAG

[0128] TTATATGGTAGCTGGTAGCTGCTCTCGTCATAACCTTCATTTTGTTCTGATGGTGTCTGTTAATTGTACTCTTCTTGGGTGAACTGAACTG

[0129] CTGGAGAACTGAACATAGCCATGGTTGGATGGTGCTACCATGCCTGATGCTGACGGTGAAACACCTGTAGTCCCTGAAACCACGGAAGTTG

[0130] GGCAGTTTATCACGTCATTTTGACAGACACCAAGCTGCAGGAAATTTGGCAGAAAGTTCACGCGGCGACGCAACGCCGTTCCACGACGTGT

[0131] GTTTAAATTGAAAAGGTTAATTTGCGCTTTTGGCCGGACAAGCATTATGTACGAACCAGACTTTGCTAAAAGCTCTCATGTCACTTTCAGG

[0132] AATTAGAACAATTGCCAGGGCCTTAAGGCGAGTGGACTATATGTACGAGAAAAAAAGTGGACGAATTTTTTTGCCCCCTGGACTAAATATT

[0133] <210>5

[0134] <211>7963

[0135] <212>DNA

[0136] <213>玉米(Zea mays)

[0137] <400>5

[0138] CCCACGCCCCTCGGTTCCCGTCGACCCACCTATCCCTTTCCCGCATCAAGCCCCCCGGTGTACCACCCGACCGCCATCCATTGCGACCTCG

[0139] GCCACATCCACCCCATGGCGACTCGTCGCGCCACCACCGTACTTCGCCCCGTCGACCGGTTGATACTGACGGTCGACGCTCCTCCGGACGC

[0140] CTCCCCGGTTCCCTCCTCCATTCGCACCGCCCTCGCCAATCCCCAGTAGCGTCGAGCCATGGTGTAGGAGTACGCAATATGCGGCCCTGAT

[0141] GGCCAACCACACTTAGGACCTGGTGCCACGCTCACCATGCACCAACGTGGTTACCGACAAGTGGATTTTCTGCCACAAGCAGACCTCAGAT

[0142] GTCTCACTCACTTGCTACAAGGTCTGTTGGGTCCTTCGGGGCTTCACCTAGCGTCCCAGAGTGGACTACGACGAGACCTTCAGCCTTGTCG

[0143] TCAAGTTCGCCATCGTTTGGACCGTTTTCTCCCTCACCTTCTCCTAGGACTGGGTGGTCCATCAGCTCGATGTCAAGAATTCCTTCCTCCA

[0144] TGGCACTCTGATAGAGACGGTCTACTATAGCTAGCCCACCGGCTTCGTCAACTCAGTTCGTTCGCTTACAGTACGACCTTAAGCAGGCGCC

[0145] GCATGCCTGGTACAGTCGCTTCGCCTCCTACCTAGCCTCCCTCGACTTTGTCGAGGCCAAGTCGGACACGTCCCTATTCATCTACCGTCGC

[0146] GGTGATGACACTTTCTACCTCCTGCTCTACGTCGATGACATTGTGCTCACGACATCCACCGCCGACCTTCTACAACACACGATTGACATCC

[0147] TTCAGCGGGAGTTCACGATGAAGGACCTGTGACCTCTTCACCACTTCCTCGACATCAACACAGAGTGTCGGCCTCAGGGTCTCTTCCTCCA

[0148] CCAGCTCCAGTAGGGGTGGGCGTTCGGGTTACCCGAAAATTTCGGGTCGGGTAATTCGGGTTTTTAAAATTTCGGGTTTTGAGAATCGATA

[0149] CCCGAAATTACAATGGGTTTTGCAATACCCGAAAATTCAGGTACCCGGAATTTCGGGTTCGGGTTCGGGTATTCCCGAACTACCCGAATTA

[0150] TTGTGTCGGCTTCATAAAAACACATACACCCTATTAAATTAGTATAAAATATAGTTTGAATAATGATATACATGGACATATAAAACACAAG

[0151] CAATCTACAATCACAAGTTATGCACACTTACACATAATTGTAGATGTACAAATTAATAATTAAGCATGACATGAGTACATGACACATGAAA

[0152] GTTCGGGTAATTCGGTTACCCGATTGTGATACCCGAAATAAATTCGGGTTTTGCAAGTTGCTACCCGAAATTCCCGAACAAAATTCGGGTT

[0153] TCGGGTATTTCAGGTTCGGGTTCGGGTATTTCGGGTTCGGGTTTCGGGTTACGGGTTTTTTGCCCAGCCCTAAGCGCCAATATGCTCTCGA

[0154] TATACTAGAGTGGGCTGACATGTCCGACTACAAGCCATGCTCTATGTCTGTATGTTGACTGGCAGATCGGATTGATCACGGGGACGGTGGG

[0155] GGAGCTTCCGGCAGGTGGTTCGGGGGTACGCCCGGGGCGATCAGGTGAGGGGGAGGGATCGCCGAGACCATGGTGTTATCCATCCAACATA

[0156] GCTTATTCTCTTTGAGCTTTTGAATATCAATTCTTGATGTTATTAATTTTAGAGACATCTTGCTATATCATGTAATTTCTTGGATGTCTCT

[0157] TATTATGGTTAGAAAATCTATAGGCTCTTGGTTGTACATGACTTAAATTTGCTTCTCCCTATTTCTGTGGATTTGGGCTCTGCGTTTGATG

[0158] TGCGGCAAGCGTGTGAACGCTGCGTGAATCGTGAATTCGTGATACACCGAAAAAAGCTGCTGGGTGCCGCTGCCGCGGGAATCTTGCGCAA

[0159] CTCTGAGCTGGATTTGTTCTGTCGTGCGCGGGACCGCTCGGCGGTGTGAACTGCACTGCAGGATACACGTACGCATCACAAGAACCCAAAA

[0160] CTTCAGGCCGCTGATCCGGTAATCCCACTGGCTGCTTCTGATGCACTTCTGTCGAAGGGACATCACACCACACACACCAGTAATAACCAGG

[0161] TCACTGCACAGCAGAATTCGCAAGCTTCCAAATGACAACTAGTGTGCTAGGATTACATGCTCCTCCACGTCAGAAGCCCGCCGTCCTCTTT

[0162] GTCCTCTCCGGCTCTCCCCACCGCCAGAAAGGAAACGGACCCAACGCGATCGAAGTCCACTGCCGTCTTCACTGCTGCCAGGCGCCAGCCA

[0163] CGGCCCACGGCCAATGCAATTGCAGTTGCAGTTGCAATTGCACGGCACCCATTTCCAGAGCCGTCCTCAATTAGCTAGTCAAATCTCGCTA

[0164] TCCTTTCCCCACCATCCAGATCTTCCCTTTCATGGACGCCGCCGTCTCCACCCTCACCGCTCTCGCCATCTTCGCGAGCACCGTCGAGCAC

[0165] GGTCGGTGCAGGCCTCCGCCACGCTTTCTAAATTGCTTCCCTCCCGGTCCCGGGGCACCGCACGACATGTGAGTTGTGTCTCTGACGCAGG

[0166] GTGTTTTTCTTTTTCTTTTCCGTGCAGCCGCCTACAGGAGCGTGCAGGGGTATAGGGTGGTCGGGAGGAAAGGCGGCGGGTGGGTCCGTTG

[0167] GGAGAGGTGGGTGGAGCGGCAGTTCGTCCTCTCCCTCTCCTTCCCACGGTGCGTCGAGGTTGCCCTGCCCGCCGCCGCGCCGCGGATACTG

[0168] CCAGCGGGGTGGCGCAGCCGGCCGGTGTTCCGCGAGGGACAGACCGTCGACACTTGGCGTTGCATTGTGGCATTCGACTCCGTCGCCGCCG

[0169] TCGCTCCGTCCTCCCCGCCGCCGCCCGTGCTCTCCCCCTTCGTGTATGGACAATCAGATCACATAAGCTCGACACGGATGCTACGTTGCCT

[0170] TCTTAAAATGCTTTGATGGCCAAAAGATTTGCCTTCTAGGTTTCCAAATTATTTCTGTTTTCAGGAAGTAGAACTGGTGATTGATTCTGAA

[0171] ACCTTCGATCTCGTCTTTGCAGGAACCCACAGCTGCAGTATCTGTCTAATCTGTACAATGACCTGCTGATGGTGTTTCGGTTTCGAGAAGA

[0172] GAAAACGGTCCCACAACTCGTTAATTCAAAGCAACCCATCCGTTGTGGTGAACAGGGGAAAACTTCTGATTTGGGTGATGCATCGGAGTCC

[0173] GATTCGGATGGGGATTGTCAATCTGGCAAAGGTGATTGTTTTCTCTTCCTTAGTCTGGAAATCTACTTGTAACCAGTGTTACCTGTATATA

[0174] CAAGTTCCAATTTTTGTTTGCTGGCTTAAACAACCGCACCTCAGATTATTGTGCATGGGAGAATTTAAGTGGATAACTGACATCAAATTCG

[0175] CGGGCCTTTAAGATTTGGCACTCATATCACAATGCCATGTGGGGTCAATGAGTCATTGACATGTGGGTTAGGATCTTGAAAGGCTCATGAA

[0176] TTGGATGCCATTTTTTTAGAAAAATCTCTCATGCTAGATTATGACACTTTTTTTCAGGTTCAAAATCTTATTTGGCATATGCCAATTCTGA

[0177] AACTTGTCTAATTCCAAGCCACATTTGAGGTGTGTTTCTGAGGGCATGTACAGCGGAAGGATGCTTAAGAGCCTGTTTATTTCAACTTATA

[0178] ATCTGCCCAAATTATATAATCCAACTCAAATAATCTAGATACAAAACAAACAGGCAGATTATTAGGCCATATTATATAATCTCAAAAGGTC

[0179] AGATTATCGTAATCCTATAAACTGCTCAACAGATGCTTATTTCATACTATTTAGTAAAAAGACCCACTACATATGGCAACTTCAGGAGAAA

[0180] TTATCCACCACTGTCACTCCTTACACACAAAAAATATTTATCTATTTTTTCTTTCTCCCGCCATATAACACATGACTAAAATCAATAATCA

[0181] AAGTTCTAATAAACTAGGTTGCCAAACAACTACGTCTAGATTATTTAATCCAGATTATATAATTCAGATTATTTAATCTCATATAATTTAG

[0182] ATTATATAATCTAGAAGCTGAAACAAACATGCCCTAAAGCCTTAAATGAAGTGAATAATAGAACTATAGCGCCAAAGTTTGCCCCCTTATT

[0183] TTCCTATTTAAGCTCCGCCTGCATGGCCTAAGCCTCTCTCAACTCACTGCTGTTGCTGTCACCAATATGATTGGCCTGAGAGATTGCAGAT

[0184] TTCTGTTTATGTTGCCACTTATTTATAACGGGAGGATTACAATAAAGGCTGGCCAAAGTGACCTTAGATTCTAGCTCACAACTCCTCTTGG

[0185] GACAGCTCTAACAATGACTTATCAGCTAGCTCAAAGCATTTTATTCCATATTTTAATAGAAGAGAGAGAAAAGCTAGCTCTTGATCAAGGG

[0186] CTAGTCTTATACAGTATATACACATTTTAAGATCATGTGAGGTGGGCCTAATCATATTATGAGCTATTGCTAAAATTAACACTTTTAGAGA

[0187] GATTGTCTTAGGGCTAGTAACTAGCTCTTATTATTGCGGGTGCCCTAAGCAACTGGCTCACTAACTCCTTAGAGACCAGGCAACTACTAAC

[0188] AAACCTGAACTGAAAACTCAAAGAGTGACTCTTAACAGGCTCGACACTAGACTACTGAATGTGCAGGTAATACTTCCATCAGTGTTAGATT

[0189] CCATGTTATATTTGACTTATCCAGATGCCAAGTTGGGTACCCACACCTGAATCAGTTTGTGCCGGTGCTTTTATTTTCCTTTTAAATGCCA

[0190] CCAATCAGTTGACACATGCCTTTCGACTGTAAAATTAACAAAGATGGAGCTTCTTGCATGTACTGATCTAGGATGAGTTGGAGTCTGGGAC

[0191] ATTGGTCAAACATCACTAGCTGTGCCAAATAACATGAGCAATCAAGGTATTTTTGTTGGTAACCCAGCAGTTAGAATTATTGCAACAAAAA

[0192] AAACGCCCTATATTGTTTAACTCAAAAGTTGGGGGATGGGCGGATGGTTGATACTGACAACAATTGGAGACTTGGGAAGTTAGAAGTGCCT

[0193] TAGGAGGAATTTAGCATTATCATTAGACTGAAAGTGGTGTTTGATCATGGGTTTAGGTCTGCAGCATGGAAAACATGGAGCTAGACTGGTA

[0194] GAGGGTGTCAGCAATATAAGTTTATGAGTCCAAATACATCATTGTCCTCCTAAAAAAACTCTACCCCTAGGGAAATGACCTCCCCCAAGGC

[0195] ATTGCATTAAGAAGGAGACTCAACCTCCCAAGGCATTGTATTAAGAAGGAGACTCAATCTTCCACAGGGCCAAGAAGATGCTCCAAAGGCC

[0196] GACTTGTATGAGGACCCATAACCAGCCGACAGCATGGCCATATTGTTGTTTTCCTAATATTGGTAAACTATATTCATGGCATGTTGAAGTA

[0197] TCATGGCAAAGGATTCACAATTATTTCTGTTTTTGATAGGCCATCAACACTACAGTTAATTAAAGGAAAGATTAGATTAATAAAAATGTAA

[0198] GGATGAACCTAATTGGTAACCCGTTCTCTAAAGAGGTATAGGGAATTGGCAAATGAATAATGGATGCATTTGCAATACTTGAATATTCAAA

[0199] CTCCACAGTTTCTCTAGGCATAGGATGGACAACAATTCAGATCGCCACATATACTAGGCGGAACATATGTAAAGAACTTAACCATCAAGAT

[0200] TTTTTATCGACAAGTGTGCACTGGTCTTTGATGTTATGAATATATTTTGATGTAAAGCTCCTAACCTGCTGGTTAGGCCATCAGGAGCTCT

[0201] GAATCTCTGGTGTACAACTCTTTCCTTGTAGTTAGTAGGCAGTGTCCATGCCATGTTGCTCAAAAACAAGAATTAACATAGAAACAGTTAT

[0202] TTGATAATCCAGCAAAACATCACTTTATTGTAGTTACGTGTGGATAAATAGGAACAGAAATCTTGATAGTCAGCTTTGGCTGGTTAACATA

[0203] GTGTTGTACTGGATTTCAGTTTTTTCCTTGTTTCTCTTTACCTTTTGGTTTTCTATGTCTCATCATGACAACCTGTAAATATTCTTACACA

[0204] GCTTGAATGAGAAGGCAGTCCCTCCTGTAAGTTTTCCTAAAAAATACTGTGTTCTGACCATCCCTGCTCGTATGAGGGACTAAGTTGGCAC

[0205] AAATGGAATAAAGGATAGATCTGGTGCTGGTGGCTCCCACATGAGTGGGGTTCGGGGAAGTAATAGCCAGGGCAAGCCTTACCCCTGCATT

[0206] TTGCAGAGAGGCTACGATCGAACATATGACCTTTTGGCGCAGCTGGTATATGATTCATAATTGGCACAGCCAGTCAGCCACACATCTTGCT

[0207] TGGAGCCTTTTCTTCATTTAGACTAAGAAAGAGTGCAAAGAGAACTCAGTAGATGGATATCATACAACTGTATCTTCTTGGCAATTTACTT

[0208] TAAGATTTCCTTGTGTTAACTGTTAACAAAATAAAAGGTTAACATGAAGATAAGCTAAAATTCAGCAAATATTTTTTGGTTTTCAATCTCT

[0209] GAAATTGGTTAGTTGGGGCACTTTGTTAGTATTACACACTTTTGTGGGCTTATGAGATCTATACAATAGTAATTTAATATGTAGCGGTTTG

[0210] TTGTTATTCATAGAACATTCCTGTTTACTCTTGTTTCGTGAAAAAGTTGTTTTACCCCCAGCTTATATTCAAAGGCCATTGTTACAGATAT

[0211] TTTTTCTCGAAACATTCTTATAGATATTACTGGTGGGGTTTCTACAATTTGCTTCTTTCATCCTCCGCTGGTCAATAAAAGTATAGAACTT

[0212] CAAGAACAAATTAATAATATAAAAAGTATACTGCCCTCGGAAGTTTGGAGTATTATTTACTCATGTCTCCTCTTTTGCTACTCAAATGTTT

[0213] AATAATATGTGTGGTATATGCAGAACTTGCACCACCAGTTCAGAAGCATACAAGAGCCAACCGGAAGCATATAGATAGCATTACTTTAGTT

[0214] GATATAGCTCAGTACTTCCATCTTCCAATCCGAGATGCATCAAAGACACTCAAGATTGGGGTCAGCATATTGAAGAGGAAATGCCGACAGT

[0215] ATGGGATACCTCGTTGGCCTCACCGGAAGATCAAGTCACTTGACTCTCTCATTCATGACCTTGAGGTAAATCTGATGGTATTTCTGTTTCA

[0216] CTTCACTTTGTGAATTTCCAGGGAACGACCGTCACAATTTGATGCAGTTGTAACTTGATGCCAACACAACTCATATTTTGTTGGACAGTTC

[0217] GTGCTAGCAAGAGAGGATGAGGATGAGGAGGAGGAGAAGCAGCTGCAGAAGGACAGGCTGGCTGCTGCGATAAACGCCCTCACAAAACGGA

[0218] AGAGCATGCTGGAGAGCGAGAAGGAAACCATACAGCAGAAACCGGCCATGGACCTGATGGCTGAAACCAAGCTATTCAGGGAAGATGTTTT

[0219] CAAGAGGAGATATAGGGCCAAAAGTTCAGTCATGGATATGGATTAGCATTTCTCTTTAGCTGATAATACCTGGTGTAAAAAGATATGGCTG

[0220] ATCGAACCTGTTTGTAAAGAGATAATCGATCCATGTGTACCGCCAGTTATATGGTAGCTGGTAGCTGCTCTCGTCATAACCTTCATTTTGT

[0221] TCTGATGGTGTCTGTTAATTGTACTCTTCTTGGGTGAACTGAACTGCTGGAGAACTGAACATAGCCATGGTTGGATGGTGCTACCATGCCT

[0222] GATGCTGACGGTGAAACACCTGTAGTCCCTGAAACCACGGAAGTTGGGCAGTTTATCACGTCATTTTGACAGACACCAAGCTGCAGGAAAT

[0223] TTGGCAGAAAGTTCACGCGGCGACGCAACGCCGTTCCACGACGTGTGTTTAAATTGAAAAGGTTAATTTGCGCTTTTGGCCGGACAAGCAT

[0224] TATGTACGAACCAGACTTTGCTAAAAGCTCTCATGTCACTTTCAGGAATTAGAACAATTGCCAGGGCCTTAAGGCGAGTGGACTATATGTA

[0225] CGAGAAAAAAAGTGGACGAATTTTTTTGCCCCCTGGACTAAATATT