一种AFP重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

摘要

一种AFP重组腺相关病毒载体(rAAV)及其构建方法与其应用。该rAAV是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为肿瘤抗原基因AFP或其突变型基因得到。本发明的rAAV可将其携带的野生型或突变型的甲胎蛋白基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗肝癌的药物。

权利要求

1.一种AFP重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为甲胎蛋白AFP基因或AFP突变型基因，将p5启动子替换为CMV启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40早期启动子得到的；所述AFP突变型基因为：由引物7：CTTCCACCACTGCCAATAAC和引物9：TGCTTGGCTCTCCTGGATGT引导扩增得到的AFP cDNA片段A，由引物10：CCAAACAAAGGCAGCAAC和引物9引导扩增得到的AFP cDNA片段B，或由引物10和引物8：

TTGTCTTCTCTTCCCCTG引导扩增得到的AFP cDNA片段C；

其构建方法包括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98I和Hpa I将pBR-AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；所述pBR-AAV2质粒为携带AAV2型全基因组DNA的pBR322质粒；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长AFPcDNA和AFPcDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长AFPcDNA或AFPcDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长AFPcDNA的AFP重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/AFP，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和AFP cDNA片段的突变型AFP重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/m AFP。

2.一种构建AFP重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；所述pBR-AAV2质粒为携带AAV2型全基因组DNA的pBR322质粒；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长AFPcDNA和权利要求1中提到的AFPcDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长AFPcDNA或AFPcDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长AFPcDNA的AFP重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/AFP，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和AFP cDNA片段的突变型AFP重组腺相关病毒载体，命名为rAAV/m AFP。

3.与权利要求1所述AFP重组腺相关病毒载体相关的产品，为由权利要求1所述AFP重组腺相关病毒载体制备得到的AFP重组腺相关病毒载体质粒、AFP重组腺相关病毒或被AFP重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

4.权利要求3所述AFP重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，分别为：

重组腺相关病毒载体质粒的制备：在权利要求2所述方法A-D步骤后增加步骤E：将连接后的DNA-rAAV/AFP或rAAV/mAFP分别导入基因工程大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到rAAV/AFP质粒和rAAV/mAFP质粒；

AFP重组腺相关病毒的制备：以所述AFP重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AFP重组rAAV病毒或突变型AFP重组rAAV病毒，分别命名为rAAV/AFP病毒和rAAV/mAFP病毒；

AFP重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述AFP重组腺相关病毒分别或依次感染或转染单核细胞、树突状细胞DC和T淋巴细胞CTL得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系和T淋巴细胞系。

5.权利要求1所述的AFP重组腺相关病毒载体在制备抗肝癌药物中的应用。

6.权利要求3所述的产品或权利要求4所述方法制备得到的rAAV/AFP或rAAV/mAFP质粒、rAAV/AFP或rAAV/mAFP病毒、被AFP重组腺相关病毒分别或依次感染或转染得到的单核细胞或DC或CTL在制备抗肝癌药物中的应用。

说明书

一种AFP重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

[0001] 本发明为分案申请。原申请日为2008年4月23日，申请号200880012949.6，发明名称为“一组重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用”。

技术领域

[0002] 本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种AFP重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0003] 腺相关病毒(AAV)的基因结构已经被鉴定。1983年，Samulski等人描述了AAV的末端重复片段(上游5’端片段，下游3’端片段)(Samulski RJ，Srivastava A，Berns KI，Muzyczka N.Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids：gene correction within the terminal repeats of AAV.Cell.33：135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了AAV的低感染颗粒(lip)基因和包膜(cap)基因(Hermonat PL，Labow MA，Wright R，Berns KI，Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus：isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2 mutants.J Virol.51：329-339.Hermonat，P.L.，and Muzyczka，N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector：transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6466-6470.)。1986年，Labow等人鉴定了位于上游5’端片段和rep基因之间的p5启动子(LabowMA，Hermonat PL，Berns KI.Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2 genome.J Virol.160：251-258.)。

[0004] 1984年，美国博沃基因国际有限公司的主要技术技术负责人之一Paul L.Hermonat教授率先证明AAV载体可用于人类疾病的基因治疗(Hermonat，P.L.，and Muzyczka，N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector：transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6466-6470.)。目前，主要是欧美国家在进行以AAV为基础的基因治疗人类疾病的临床试验。据美国粮食和药品管理局统计，现有十余项以AAV为基础的基因治疗临床试验正在进行，主要是将携带治疗基因的AAV病毒注入患者体内，使其在体内表达治疗基因，从而达到治疗疾病的目的。主要针对治疗的疾病有帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病。但是，应用于临床治疗的AAV病毒仍存在一些问题，例如携 带治疗基因大小受到明显限制，病毒本身不稳定，导致治疗基因表达不稳定，以及造成疗效不一致。虽然AAV病毒本身的免疫原性很弱，但所表达的治疗基因容易在患者体内诱发自身免疫反应，甚至导致严重的毒副作用。 [0005] AAV是一种非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因产物辅助，才能装配成为具有感染性的病毒颗粒。AAV基因组全长约4700碱基对(bp)，两端为重复末端片段(TR)，中间为病毒的结构基因，包括与病毒复制有关的Rep基因和病毒衣壳Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不稳定性及其携带外源性基因(治疗基因)长度有限等方面缺陷，因此有必要对其进行基因重组形成重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)。现有大量研究表明，将AAV基因组中的结构基因删除，可明显增加外源性基因的容量。此外，将具有治疗作用的外源性基因插入rAAV中，制备成具有感染性的rAAV病毒颗粒，注射入患者体内，使其感染体内细胞，进而表达治疗基因，从而达到治疗疾病的作用。目前，主要是将rAAV应用于帕金森氏综合症、风湿性关节炎、血友病、心力衰竭、进行性肌萎缩和奥兹海默综合症等非肿瘤性疾病的治疗。但rAAV仍然存在一些不足，如重组病毒不稳定，病毒滴度低，接纳治疗基因的容量仍然有限(一般仅能插入的外源性基因片段最大约2000碱基对(bp)，否则rAAV的稳定性将被破坏)。因此，需要设计更为合理的重组腺相关病毒(rAAV)载体，以满足实际应用的需要。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种稳定性高、携带外源性基因容量大的AFP重组腺相关病毒(rAAV)载体。

[0007] 本发明所提供的重组腺相关病毒载体，

[0008] 是将腺相关病毒(AAV)载体中的腺相关病毒结构基因替换为甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体。

[0009] 本发明的AFP重组腺相关病毒载体是在已知的腺相关病毒载体的基础上进行改造得到的，所述腺相关病毒结构基因为Rep和Lip/Cap基因，肿瘤特异抗原基因AFP为肿瘤相关抗原基因，其突变型基因是具有相同功能的相关肿瘤特异抗原基因片段。 [0010] 已知的腺相关病毒载体具有p5启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。

[0011] 本发明的第二个目的是提供上述AFP重组腺相关病毒载体的构建方法。 [0012] 本发明所提供的构建方法，是使用常规的基因重组的方法，先将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用前述特异抗原基因AFP或其突变型基因m AFP取代该剔除基因，得到AFP重组腺相关病毒载体。

[0013] 在上述AFP重组腺相关病毒载体的构建方法中，为提高目的基因的转录水平，还可进一步将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta 肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。

[0014] 与本发明AFP重组腺相关病毒载体相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被本发明重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，如单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系等(所述AFP重组腺相关病毒载体中的相关基因或其突变型基因可在单核细胞-树突状细胞系或T淋巴细胞系等细胞系中在转录启动子的作用下获得表达)等均属于本发明的保护范围。

[0015] 医药用途方面，本发明的另一个目的是提供一种抗肿瘤药物。

[0016] 本发明所提供的抗肿瘤药物的活性成分为上述AFP重组腺相关病毒载体或与本发明AFP重组腺相关病毒载体相关的产品。

[0017] 如以本发明的AFP重组腺相关病毒为载体，将肿瘤抗原-野生型和/或突变型肿瘤特异抗原基因导入单核细胞-树突状细胞系，并诱导产生树突状细胞，以达到患者体外和体内免疫刺激的目的，用以治疗相关恶性肿瘤，或以该树突状细胞刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞(例如但不仅局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)治疗相关恶性肿瘤。

[0018] 所述相关恶性肿瘤为肝癌等。

[0019] 本发明所提供的药物可采用溶剂或粉剂等剂型。

[0020] 所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。

[0021] 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。

[0022] 用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将此药感染或转染患者的单核细胞。或将转化有野生型和/或突变型甲胎蛋白AFP的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。

[0023] 上述药物的用量一般为100μl/5×106/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。

[0024] 为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。

[0025] 本发明还提供了一种杀灭肿瘤的方法。

[0026] 本发明所提供的杀灭肿瘤的方法，可包括以下步骤：

[0027] 1)将肿瘤所在体系(该体系可通过人工模拟的方式产生或肿瘤患者体内)中自然产生的单核细胞-树突状细胞或T淋巴细胞被本发明携带野生型肿瘤特异抗原基因的重组腺相关病毒载体和/或携带突变型特异抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞；

[0028] 2)将步骤1)中处理后的单核细胞-树突状细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤；或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的单核细胞-树突状细胞混合培养形成抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，再将该抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤；或将被处理的T淋巴细胞和未被处理的单核细胞-树突状细胞加入肿瘤所在体系中杀灭肿瘤。

[0029] 本发明所述杀灭肿瘤的方法可具体应用到肿瘤治疗中，包括给予一个肿瘤患者回输抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，该细胞由来源于患者的自然产生的T淋巴细胞与来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带野生型特异抗原基因的重组腺相关病毒和/或携带突变型特异抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；

[0030] 或者，给予一个肿瘤患者回输来源于患者的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带野生型特异抗原基因的重组腺相关病毒和/或携带突变型特异抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；

[0031] 再或者，给予一个肿瘤患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患者的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些T淋巴细胞已经被本发明携带野生型特异抗原基因的重组腺相关病毒和/或携带突变型特异抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理。

[0032] 本发明提供了一种稳定性高、携带外源性基因容量大的AFP重组腺相关病毒(rAAV)载体。在本发明的rAAV载体中，AAV的结构基因Rep和Lip/Cap基因被野生型或突变型的肿瘤特异性抗原基因AFP取代。本发明的重组腺相关病毒载体可将其携带的野生型或突变型的特异性抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，携带带有的这些特异性抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。

[0033] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

[0034] 图1为重组腺相关病毒载体的结构示意图。

[0035] 图2A至图2H为八种重组腺相关病毒载体rAAV的酶切及PCR检测结果；其中图2H-1为rAAV/AFP的酶切结果，图2H-2为rAAV/AFP的PCR检测结果。

[0036] 图3为重组腺相关病毒rAAV的制备流程图。

[0037] 图4为重组腺相关病毒rAAV/AFP的病毒滴度检测结果。

[0038] 图5为一种或多种携带肿瘤抗原基因的rAAV病毒感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验流程。

[0039] 图6为重组腺相关病毒rAAV/AFP感染外周血单核细胞的效率检测结果。 [0040] 图7为被重组腺相关病毒rAAV/AFP感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果。

[0041] 图8为被rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平检测结果。 [0042] 图9为被rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL杀伤肿瘤细胞试验杀伤特异性检测结果。

[0043] 图10为四例肝癌患者经VrAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL治疗前后患者血清中AFP肿瘤相关抗原水平的变化情况。

具体实施方式

[0044] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。 [0045] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

[0046] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列测定均由美国Invitrogen公司完成。 [0047] 第八部分：重组腺相关病毒载体rAAV/AFP

[0048] 实施例8-1、重组腺相关病毒载体rAAV/AFP和rAAV/mAFP的构建及检测 [0049] 材料及其来源：

[0050] A.携带AAV 2型全基因组DNA的pBR322质粒(命名为pBR-AAV2)：由美国博沃基因国际有限公司的主要技术技术负责人之一Paul L.Hermonat教授制备(Hermonat，P.L.，and Muzyczka，N.Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector：transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6466-6470.)。

[0051] B.人HepG2细胞株：来源于美国细胞及组织收集中心，表达甲胎蛋白抗原(AFP)；也可商业渠道获得。

[0052] C.携带CMV启动子的pCI-neo质粒购于美国Promega公司，携带SV40早期启动子的质粒pSG424购于美国Clonitic公司。

[0053] D.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的甲胎蛋白抗原(AFP)基因序列(美国NCI基因库：NM_001134)设计。

[0054] 用下述方法构建本发明携带AFP基因或其突变型基因的重组腺相关病毒载体(如 图1所示)，具体过程包括以下步骤：

[0055] 一、重组腺相关病毒载体的构建

[0056] A.pBR-AAV2质粒的改建，具体方法为：先用限制性内切酶Bst98I和Hpa I(购自美国Promega公司)将pBR-AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，反应体系为：1μg pBR-AAV2，10U Bst98I，10U Hpa I，2.5μl 10×缓冲液D以及19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时。然后，将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列(CGAATTCATGCGATATCGTT)插入质粒中，反应体系为：500ng质粒，300ng EcoR I和EcoR V的核苷酸序列，10IU T4 DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4 DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：在4℃下水浴8小时。然后，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段：CTGCGCTGG，目的是提高rAAV病毒的稳定性以及提高病毒的复制效率，方法为：首先用限制性内切酶Ban I(购自美国Promega公司)切割两端的TR，反应体系为：1μg上述制备的质粒，10U Ban I，1.5μl 10×缓冲液G以及
11.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时，再将9个核苷酸片段插入质粒中，反应体系为：500ng质粒，300ng 9个核苷酸序列，10IU T4 DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4 DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：在4℃下水浴8小时。

[0057] B.采用基因扩增技术(多聚酶链反应，PCR)扩增CMV启动子，SV40早期启动子。具体方法为：先以pCI-neo质粒(购自美国Promega公司)为模板，在引物1：AGATCTTCAATATTGGCCAT(序列表中SEQ ID NO：1)和引物2：TGTCAGAAGCACTGACTGC(序列表中SEQ ID NO：2)的引导下PCR扩增CMV启动子，PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，60℃35秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行
1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，在740bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到CMV启动子。再以pSG424质粒(购自美国Clonitic公司)为模板，在引物3：
GAACCAGCTGTGGAATGTGTC(序列表中SEQ ID NO：3)和引物4：TCAGGAAGCTTAGATCTAGC(序列表中SEQ ID NO：4)的引导下PCR扩增SV40早期启动子，PCR扩增条件为：先94℃4分钟；
再94℃30秒，60℃35秒，72℃40，秒，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，在359bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到SV40早期启动子。

[0058] C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长AFP cDNA和部分AFP cDNA片段(分别 命名为A(自5’端第12-1277位碱基)、B(自5’端第653-1277位碱基)、C(自5’端第653-1902位碱基))，本实施例以上述片段为例但不限于上述片段，其它与AFP cDNA具有相同功能的AFP cDNA片段均可用于构建本发明的重组腺相关病毒载体)，具体方法为：采用核酸分离技术，从人HepG2细胞中分离总DNA和mRNA(也可人工合成或商业渠道获取)，然后以总DNA为模板，在引物5：CCCGGGCCCAGCACCCCAAG(序列表中SEQ ID NO：5)和引物6：
CATCCATGGTGAGCTGCG(序列表中SEQ ID NO：6)的引导下PCR扩增beta肌动蛋白启动子，PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃30秒，58℃35秒，72℃1分钟20秒，共30个循环；最后72℃8分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，在1176bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到beta肌动蛋白启动子。再将mRNA反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物7：CTTCCACCACTGCCAATAAC(序列表中SEQ ID NO：7)和引物8：TTGTCTTCTCTTCCCCTG(序列表中SEQ ID NO：8)的引导下PCR扩增全长AFP cDNA，PCR扩增条件为：先94℃4分钟；再94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟，共
30个循环；最后72℃10分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，在
1890bp处出现一条预期的特异性条带，将该目的条带回收并纯化后得到全长AFP cDNA，用上述相同方法得到AFP cDNA片段A(引物7和引物9：TGCTTGGCTCTCCTGGATGT(序列表中SEQ ID NO：9))、AFP cDNA片段B(引物10：CCAAACAAAGGCAGCAAC(序列表中SEQ ID NO：10)和引物9)、AFP cDNA片段C(引物10和引物8)。

[0059] D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长AFP cDNA或部分AFP cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，其中，酶切反应体系为：1μg质粒；10U限制性内切酶BamH I和Sal I(购自美国Promega公司)，2.5μl 10×缓冲液C以及
19.5μl去离子水；反应条件为：在37℃下水浴4小时，连接反应体系为：500ng酶切后的质粒，300ng启动子DNA，10IU T4 DNA连接酶(购自美国Promega公司)，1.5μl 10×T4 DNA连接缓冲液以及11.5μl去离子水；反应条件为：在4℃下水浴8小时。然后，将携带有启动子的质粒和全长的AFP cDNA分别用限制性内切酶EcoR V和Not I酶切。酶切反应以及进行连接反应的体系和条件与上述相同。最后分别得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长AFP cDNA的重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/AFP)，以及携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和A或B或C不同AFP cDNA片段(突变型)的重组腺相关病毒载体(分别命名为rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP统一命名为rAAV/mAFP)。

[0060] E.将连接后的DNA-rAAV/AFP和rAAV/mAFP分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(美国Invitrogen公司)，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到rAAV/AFP质粒和rAAV/mAFP质粒。 [0061] 二、重组腺相关病毒载体的检测

[0062] 先对步骤一获得的经纯化的rAAV/AFP质粒和rAAV/mAFP质粒用限制性内切酶(依次为Not I&BamH I、EcoR I&Not I、EcoR V&NheI、EcoR V&Not I、PstI)进行酶切，所用限制性内切酶均购自美国Promega公司。反应结束后，对酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，其中rAAV/AFP质粒的检测结果如图2H-1所示(1.rAAV/AFP(NotI和BamH I内切酶)。2.rAAV/AFP(EcoRI和NotI内切酶)。3.rAAV/AFP(EcoR V和Nhe I内切酶)。4.rAAV/AFP(EcoR V和NotI内切酶)。5.rAAV/AFP(PstI内切酶)。6.DNA分子量标准。)，经Not I和BamHI酶切获得了1305bp的特异性条带，经EcoRI和NotI酶切获得了1295bp的特异性条带，经EcoR V和Nhe I酶切获得了3568bp的特异性条带，经EcoR V和Not I酶切获得了1896bp的特异性条带，经Pst I酶切获得了251bp、382bp、509bp、983bp和1613bp的特异性条带，与预期结果相符。rAAV/mAFP质粒的酶切检测结果也与预期结果相符。再对rAAV/AFP质粒和rAAV/mAFP质粒用基因扩增(PCR)的方法做进一步的检测，其中rAAV/AFP质粒的检测结果如图2H-2所示(1.DNA分子量标准。2.AFP cDNA。3.阴性对照。)，经扩增获得了1890bp的预期的特异性条带。rAAV/mAFP质粒的PCR检测结果也与预期结果相符(扩增产物的大小依次为rAAV/AmAFP：1266bp、rAAV/BmAFP：625bp、rAAV/CmAFP：1250bp)。
上述检测结果表明获得了插入位置及序列均正确的携带AFP基因的重组腺相关病毒载体rAAV/AFP和以及携带AFP突变型基因的重组腺相关病毒载体rAAV/mAFP。

[0063] 实施例8-2、重组腺相关病毒(rAAV)的制备及病毒滴度测定

[0064] 材料及其来源：

[0065] A.实施例8-1构建的携带AFP基因的重组腺相关病毒载体rAAV/AFP和以及携带AFP突变型基因的重组腺相关病毒载体rAAV/mAFP(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)。

[0066] B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的辅助质粒pHelper：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心刘勇教授构建(Liu，Y.，Chiriva-Internati，M.，Grizzi，F.Salati，E.，Roman，J.J.，Lim S.，and Hermonat，P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8：948-957.)。

[0067] C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因(E1、E2A、E4、VAI和VAII基因)的AAV-HEK293细胞：由美国阿肯色大学医学院附属医院基因治疗中心建立(Liu，Y.，Chiriva-Internati，M.，Grizzi，F.Salati，E.，Roman，J.J.，Lim S.，and Hermonat，P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16 E6 antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8：948-957.)。 [0068] D.脂质体转染试剂Lipofectin：购自美国Invotrogen公司。

[0069] E.DMEM培养基和胎牛血清(或小牛血清)：购自美国Cellgro公司。

[0070] F.PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士Roche公司。 [0071] G.DNA拷贝数标准：分别为1012拷贝数(copies)/μl至106(copies)/μl，购自美国Promega公司。

[0072] 一、重组腺相关病毒(rAAV)的制备

[0073] 参照图3，用下述方法制备重组腺相关病毒(rAAV)，以制备一盘10.0cm细胞培养皿的病毒为例，当AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70％时，进行如下操作：

[0074] A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0μg rAAV载体(rAAV/AFP或rAAV/mAFP)，1.0μg pHelper质粒，4.0μl Lipofectin和50.0μl含5％胎牛血清(或小牛血清)的DMEM培养基混匀，室温静置20分钟。

[0075] B.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。 [0076] C.72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。

[0077] D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。

[0078] E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。将获得的携带肿瘤相关抗原基因AFP基因全长AFP cDNA或部分AFP cDNA片段(A、B、C突变型基因)的rAAV病毒分别命名为rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP。

[0079] 二、重组腺相关病毒(rAAV)的病毒滴度测定

[0080] 采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的各种rAAV病毒(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)进行病毒滴度测定，具体方法包括以下步骤：仅所用的DNA探针为针对肿瘤相关抗原基因的特异性探针。

[0081] A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。

[0082] B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA拷贝数标准，抽真空。

[0083] C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。

[0084] D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，探针为“实施例8-1步骤C中所获得的AFP cDNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。 [0085] E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒DNA进行DNA杂交。

[0086] 其中，rAAV/AFP的检测结果如图4所示，rAAV/AFP的病毒滴度为1010-1011拷贝/10 11
mL，三种rAAV/AmAFP的病毒滴度均为10 -10 拷贝/mL。

[0087] 实施例8-3、肿瘤相关抗原导入单核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验 [0088] 材料及其来源：

[0089] A.rAAV病毒：rAAV/AFP和rAAV/mAFP(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)。 [0090] B.AIM-V细胞培养基：购自美国Invitrogen公司。

[0091] C.细胞因子：集落细胞刺激因子(GM-CSF)，白细胞介素2，4，7(IL-2，4，7)以及肿瘤坏死因子(TNF-α)购自美国R&D公司。

[0092] 一、杀灭肿瘤实验

[0093] 如图5所示，将本发明一种或多种携带肿瘤相关抗原基因(AFP基因及其突变型基因)的rAAV病毒感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭肿瘤实验的整个过程包括以下步骤：

[0094] A.取肿瘤患者50-150毫升外周血，用血细胞分离仪(或淋巴细胞分离液)按常规方法获取外周血单个核细胞(PBMC)，与AIM-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧化碳培养箱中培养2小时。

[0095] B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞(单核细胞，monocyte，Mo)。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其与AIM-V培养基混匀后，继续培养备用。

[0096] C.加入一种(或多种，效果更佳)本发明实施例8-2获得的rAAV病毒，加入量约为100-1000MOI，同时再加入GM-CSF(800IU/mL)，继续培养4小时。

[0097] D.除去旧培养基，补充含GM-CSF，IL-4(800IU/mL)以及TNF-α(20IU/mL)的AIM-V培养基，继续培养。

[0098] E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞(DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混 合，在AIM-V培养基中加入IL-2(20IU/mL)以及IL-7(500IU/mL)，继续培养。 [0099] F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)进行检测。 [0100] 二、树突状细胞(DC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的检测

[0101] A.rAAV感染外周血单核细胞的效率检测

[0102] 采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对肿瘤相关抗原AFP的特异性荧光抗体(购自美国BD公司)标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单核细胞或未成熟的DC，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，重组腺相关病毒rAAV/AFP感染外周血单核细胞的效率检测结果如图6所示，rAAV/AFP感染外周血单核细胞的效率为89％，所构建和制备的各种携带肿瘤相关抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染外周血单核细胞的效率均约为90％，即约百分之九十的外周血单核细胞可被rAAV病毒感染，证明本发明的rAAV具有较高的感染效率。

[0103] B.树突状细胞(DC)的CD分子水平的检测

[0104] DC表达CD80、CD83以及CD86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法，即分别采用荧光标记的针对这三种CD分子的抗体(购自美国BD公司)对步骤一获得的DC表达CD80、CD83以及CD86的水平进行检测，以AFP蛋白刺激的DC以及无刺激的DC为对照。其中，重组腺相关病毒rAAV/AFP感染的DC表达CD80、CD83以及CD86水平的检测结果如图7所示。rAAV/AFP及其它携带肿瘤相关抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所表达的CD分子水平明显高于对照，证明构建和制备的携带肿瘤相关抗原AFP及其突变型基因的rAAV感染外周血单核细胞后，所诱导的DC的功能强大。

[0105] C.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达的γ干扰素(IFN-γ)水平的检测

[0106] CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A类似的方法检测被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平(以无刺激的DC所诱导的CTL为对照。)，DC与外周血淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体(购自美国BD公司)，最后利用流式细胞仪检测结果。其中，被rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平如图8所示，rAAV/AFP及其它携带肿瘤相关抗原基因的rAAV(rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所诱导的CTL表达IFN-γ的水平明显高于对照，证明被本发明构建和制备的携带肿瘤相关抗原AFP及其突变型基因的rAAV感染的DC所诱导的CTL功能强大。

[0107] D.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤肿瘤细胞试验

[0108] 混合培养结束后，将步骤一中被rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、 rAAV/CmAFP)感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞按20∶1(淋巴细胞∶肿瘤细胞)与肝癌细胞混合后，采用传统的MTT法和51Cr(铬-51)杀伤试验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。其中rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL的肿瘤细胞杀伤率统计结果如图9所示，本发明构建和制备的携带肿瘤相关抗原AFP及其突变型基因的rAAV感染的DC所诱导的CTL能够更有效地裂解(杀伤)肿瘤细胞，杀伤率可达50％以上。

[0109] 以AFP抗原阴性的宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌和肺腺癌为对照，再用上述相同的方法检测步骤一中被rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP、rAAV/CmAFP)感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的特异性。其中，被rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL的肿瘤细胞杀伤特异性检测结果如图9所示，被本发明构建和制备的携带肿瘤相关抗原-AFP及其突变型的rAAV感染的DC所诱导的CTL对AFP抗原阴性癌细胞无杀伤作用，证明本发明构建和制备的携带肿瘤相关抗原-AFP及其突变型基因的rAAV感染的DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。

[0110] 上述检测结果表明，被本发明携带肿瘤相关抗原AFP及其突变型基因的rAAV感染的DC(统称为rAAV-DC)所诱导的CTL对肝癌等AFP抗原阳性的恶性肿瘤具有较好的疗效，可用于制备抗肿瘤药物。

[0111] 实施例8-4、肿瘤治疗的临床实验

[0112] 一、疗效及存活时间检测

[0113] 应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术，即将实施例8-3中被本发明rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)中的一种或两种感染的DC(rAAV-DC)所诱9 9
导的CTL回输8例肝癌患者，输注量为1×10-5×10。治疗疗程：通常为6个月，每月2-3次，病情改善后可减为每月1-2次，进一步可减为每1-3月治疗一次。治疗效果(rAAV-DC治疗后的反应)统计结果如表8-1所示(B：血清肿瘤标志物减少或消失。Q：病人生活质量改善。如疼痛减轻或消失，食欲增加等等。C：CTor PET-CT显示癌症病灶或转移病灶明显减小或消失。)，不良反应：多数病例治疗后短时间内会出现轻度流感样反应，但病人均能承受，且症状短期内消失，没有观察到严重不良反应及毒性反应。疗程及生存时间统计结果如表8-2所示(治疗后已存活时间：病人开始接受rAAV-DC治疗后的存活时间(已经死亡病例计算至死亡时)。)，死亡病例均非因rAAV-DC治疗引起，本组病人大多数处于癌症终末期，部分病人已经因过度放化疗造成免疫功能、肝肾功能衰竭。上述统计结果进一步证明，被本发明的rAAV感染的DC(统称为rAAV-DC)所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定的疗效，可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，且安全性较高，可用于制备抗肿 瘤药物。

[0114] 表8-1用重组腺相关病毒-树突状细胞技术(rAAV-DC)

[0115] 治疗8例肝癌患者的疗效的统计结果

[0116]

[0117] 表8-28例肝癌患者的疗程与生存时间统计结果

[0118]

[0119] 二、肿瘤患者治疗前后影像学方面和血清肿瘤标志物方面的变化情况 [0120] A、肿瘤患者治疗前后影像学方面的变化情况

[0121] 对步骤一中的8例肝癌患者治疗前后转移病灶变化情况进行影像学观测，结果经本发明rAAV(rAAV/LMP-1、rAAV/AmLMP-1、rAAV/BmLMP-1和rAAV/CmLMP-1)中的一种或两种感染的DC(rAAV-DC)所诱导的CTL治疗后，患者的转移病灶明显消失，进一步证明，被本发明的rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，可用于制备抗肿瘤药物。

[0122] B、治疗前后患者血清中肿瘤相关抗原水平的变化情况

[0123] 检测步骤一中的8例肝癌患者治疗前后血清中肿瘤相关抗原AFP的水平(数据来源于实验医院的检测结果)。其中，四例经rAAV/AFP感染的DC所诱导的CTL治疗前后肝癌患者血清中AFP肿瘤相关抗原水平的变化情况如图10所示，结果经本发明rAAV(rAAV/AFP、rAAV/AmAFP、rAAV/BmAFP和rAAV/CmAFP)中的一种或两种感染的DC(rAAV-DC)所诱导的CTL治疗后，其血清中肿瘤相关抗原AFP水平均明显下降，表明患者体内瘤负荷量明显降低(肿瘤细胞明显减少)，进一步证明，被本发明的rAAV感染的DC所诱导的CTL在患者体内可有效地抑制恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，可用于制备抗肿瘤药物。 [0124] 工业应用性

[0125] 实验证明，被本发明AFP重组腺相关病毒rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的AFP重组腺相关病毒载体或与本发明AFP重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物，在恶性肿瘤如肝癌的临床治疗和应用中具有重要的意义。