一种具有与氟康唑协同抗真菌作用的增效剂转让专利
申请号 : CN201010196758.9
文献号 : CN102274215B
文献日 : 2013-04-10
发明人 : 于录 , 邓旭明 , 金晶 , 唐旭东 , 郭娜 , 梁俊超 , 李蕾
申请人 : 吉林大学
摘要 :
本发明提供了和厚朴酚与氟康唑联合抗真菌的新应用，其中，真菌为白色念珠菌。本研究运用CLSI推荐的标准微量稀释法药物敏感性实验，结合棋盘式微量稀释法和时间-杀菌曲线等系列方法评价和厚朴酚对临床分离耐药白色念珠菌的体外敏感性，同时评价和厚朴酚与氟康唑的抗临床耐药真菌的体外协同效果。又通过小鼠感染治疗实验，评价了和厚朴酚与氟康唑的抗临床耐药真菌的体内协同效果。
权利要求 :
1.和厚朴酚与氟康唑联合用于制备抗白色念珠菌作用的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的和厚朴酚与氟康唑联合用于制备抗白色念珠菌作用的药物的应用，其特征在于：所述的和厚朴酚结构式如下：
说明书 :
一种具有与氟康唑协同抗真菌作用的增效剂
技术领域
[0001] 本发明涉及和厚朴酚与氟康唑联合应用后可增强氟康唑抗真菌活性的用途。
背景技术
[0002] 在过去的二十多年里严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是在发病率还是感染的种类方面都在不断增加，特别是在免疫抑制患者中。在人类真菌感染中，最重要的机会致病菌是白色念珠菌，其可以导致从慢性皮肤感染到危机生命的系统性真菌感染。白色念珠菌(C.albicans)是一种常见的致病性真菌，可以侵犯皮肤、黏膜和内脏，表现为急性、亚急性和慢性炎症。这些感染不但常见，而且危害极大。临床咽喉、食管、阴道的念珠菌病常经常是AIDS的第一个症状。近年来，广谱抗生素在临床上的不合理使用，也使得真菌的耐药性不断增强。
[0003] 近年来，随着肿瘤及艾滋病患者的不断增加，器官移植、导管插管及内窥镜技术的普遍开展，高效广谱抗生素、免疫抑制剂及糖皮质激素的广泛应用，真菌感染机会增多，特别是深部真菌的感染。随着抗真菌药物在临床上的大量应用，以及药物的选择压力性，使得临床耐药菌株不断出现且日趋严重。研发新型高效的抗真菌药物，以替换严重耐药的药物，是应对耐药最有效的方法。近年来有多种药物进行临床前观察，其中包括新的唑类药物、阻断真菌细胞壁合成的药物等，体外和动物实验均取得了较好疗效，有的在国外已经上市。特别是作用于细胞壁的药物，和现有药物无交叉耐药，而且由于人体细胞无细胞壁，对人体的副作用小。这些药物有望于未来几年应用于我国临床。
[0004] 和厚朴酚是中药厚朴主要成分之一，本发明采用和厚朴酚与氟康唑联合使用的方式抑制白色念珠菌的生长，为研究开发新型的白色念珠菌临床治疗方法奠定基础。
[0005] 和厚朴酚为本发明提供的对氟康唑抗真菌活性起协同作用的天然化合物发明内容：
[0006] 利用微量稀释法药物敏感性实验分别测定氟康唑和和厚朴酚对真菌的抑制效果，再通过药物协同实验测定氟康唑与和厚朴酚联合抗白色念珠菌的效果，说明和厚朴酚具有提高氟康唑抗真菌活性的作用。药物协同实验包括棋盘式微量稀释实验，时间-杀菌曲线实验和。最后，通过对感染白色念珠菌小鼠的治疗实验，考察和厚朴与氟康唑联合使用的体内抗真菌效果。受试菌包括：22株临床氟康唑耐药白色念珠菌，以及3株对照用质控菌株：白色念珠菌ATCC 10231近平滑假丝酵母菌ATCC 90018和克柔念珠菌ATCC 6258。
[0007] 本发明中天然化合物和厚朴酚，分子式为C18H18O2，分子量为266.33，其化学结构为：
[0008]
[0009] 3′，5-二-2-丙烯基-1，1′-联苯-2，4′-二酚
[0010] 说明书附图说明：
[0011] 图1时间-杀菌曲线实验结果
[0012] 图2体内协同实验结果
具体实施方式
[0013] 参 照 文 献 (National committee for clinical laboratory standards.Referencemethod for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast；Approved StandardM27-A.Lancaster Avenue，Villanova.Pennsylvania：CLSI，1997.1-12)；(Odds F C，Synergy，antagonism，and what the chequerboard puts between them，J AntimicrobChemother(2003)52，1)；(Meletiadis J etc，In vitro drug interaction modeling ofcombinations of azoles with terbinafine against clinical Scedosporium prolificansisolates，Antimicrob Agents Chemother.(2003)106-117.)；(Eliopoulos GM etc，Antimicrobial combination.In：Lorian V，editor.Antibiotics in Laboratory Medicine，4th ed.Baltimore，MD：The Williams and Wilkins Co.(1996)330-96) 和 (Sanati，Hetc，Combination therapy with amphotericin B and fluconazole against invasivecandidiasis in neutropenic-mouse and infective-endocarditis rabbit models，Antimicrob Agents Chemother(1997)1345-1348.)方法进行药物敏感性实验和协同实验，具体操作如下：
[0014] (1)微量稀释法药物敏感性实验：将受试菌在SDA培养基上连续转种2次，以确保其纯度和活力(培养温度为35℃)。经35℃培养24h，取5个直径大于1mm的菌落于5ml无菌生理盐水中震荡15s，制成菌悬液，用血细胞计数板将其浓度调至菌浓度为(1～
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5)×10CFU/ml；用1640液基1∶50稀释后再1∶20稀释(共稀释1000倍)，至菌浓度为
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(1～5)×10CFU/ml(2倍菌接种液浓度)。将冷冻的药敏板按-20℃，4℃及室温各1h的融化程序融化后置超净工作台上，用微量移液器以从第11孔至第1孔的顺序，每孔加100μl菌悬液。第12孔不加，为空白对照。接种后的药敏板置微量振荡板上振荡5min，使混合均匀，35℃湿盒温育。分别于24h和48h观察受试菌生长情况，记录最低抑菌浓度值(MIC)。
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5)×10CFU/ml；用1640液基1∶50稀释后再1∶20稀释(共稀释1000倍)，至菌浓度为
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(1～5)×10CFU/ml(2倍菌接种液浓度)。将冷冻的药敏板按-20℃，4℃及室温各1h的融化程序融化后置超净工作台上，用微量移液器以从第11孔至第1孔的顺序，每孔加100μl菌悬液。第12孔不加，为空白对照。接种后的药敏板置微量振荡板上振荡5min，使混合均匀，35℃湿盒温育。分别于24h和48h观察受试菌生长情况，记录最低抑菌浓度值(MIC)。
[0015] (2)棋盘式微量稀释实验：将受试菌按1∶100接种至1mLYPD培养液中，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期。取该菌液至1mL YPD培养液中，用上述
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方法再次活化16h，然后用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至10CFU/mL。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3-12号孔各加新鲜配制的菌液100μL；2号孔分别加菌液160μL和受试化合物溶液40μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。和厚朴酚和氟康唑在96孔板上以二维棋盘的纵(B至H)横(2至11)两方向分别进行二倍的倍比稀释。各孔中DMSO含量均低于1％，各药敏板于35℃恒温箱培养24小时后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。每个培养板平行测定三次。
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方法再次活化16h，然后用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至10CFU/mL。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3-12号孔各加新鲜配制的菌液100μL；2号孔分别加菌液160μL和受试化合物溶液40μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。和厚朴酚和氟康唑在96孔板上以二维棋盘的纵(B至H)横(2至11)两方向分别进行二倍的倍比稀释。各孔中DMSO含量均低于1％，各药敏板于35℃恒温箱培养24小时后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。每个培养板平行测定三次。
[0016] 药物联合应用评价方法：当MCI值高于检测最高限时以最高限浓度的两倍值用以计算部分抑菌浓度指数(FICI)。FICI和ΔE是评价药物联合应用的两种重要模型。FICI＝MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。FICI≤0.5时为协同作用(Synergism，SYN)；0.5＜FICI≤4时为无关作用(indifference，IND)；FICI＞4时为拮抗作用(antagonism，ANT)。ΔE模型用Ii＝(IA+IB)-(IA×IB)公式来表示。Ii表示理论上两种药物联合应用时的抑菌生长百分率。IA和IB分别表示实验中A药和B药单独应用时的实际抑菌生长百分率。在ΔE模型中∑SYN和∑ANT是协同和拮抗百分率的总和，＜100％认为两药有弱的协同作用；100至200％认为两药有中等的协同；＞200％认为两药有较强的协同作用。药物敏感性结果表1，体外协同实验结果结果见表2。
[0017] 表1氟康唑与和厚朴酚单独使用和联合应用药物敏感性结果
[0018]
[0019] 根据CLSI规定的菌株对FLC敏感或耐药的判定标准为：MIC≤8判定为敏感菌株；MIC≥8判定为耐药菌株
[0020] 表2氟康唑与和厚朴酚体外协同实验结果
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[0022] (3)时间-杀菌曲线实验：临床耐药白念珠菌C.albicans YL313以1∶100接种至1mL YPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期期。取该菌液至1mL YPD培养液中，用上述方法再次活化16h后，在紫外分光光度计600nm处测定菌液OD值，以RPMI1640液体培养基稀释并调整菌液浓度至OD值为0.35(以血细胞计数板计数，约相当于5×106细胞/mL)，将此菌液稀释10倍，得到浓度为5×105细胞/mL的菌液。上述菌液各分四份，每份2mL菌液，分别加入氟康唑8μg/mL、和厚朴酚32μg/mL、8μg/mL氟康唑+32μg/mL和厚朴酚、空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于
0.5％，30℃，200rpm振荡培养。分别于0、12、24、36和48h后，所有菌液中各取100μL，再用0.9％生理盐水10倍系列稀释，从不同稀释倍数的菌液中各取100μL均匀涂布于含YPD琼脂固体培养基表面。平皿于30℃真菌培养箱中培养48h后计数菌落数目，以YPD平皿上生长菌落数达20个为最低限量。计算活菌落数目(CFU)，以log10CFU/mL对时间作曲线[0023] (4)体 内 协 同 实 验：将 体 重18-20g 的BALB/c 小 鼠 尾 静 脉 接 种C.albicansYL371(1×105cfu/只)，24小时后随机分成四组：空白对照组(不给药物)，和厚朴酚治疗组(5mg/kg/day)，氟康唑治疗组(1mg/kg/day)，联合治疗组(氟康唑1mg/kg/day，和厚朴酚5mg/kg/day)，每组10只，腹腔注射给药，连续治疗5天，第六天统计各组小鼠存活数量，并断颈处死，取肾脏研磨，将组织匀浆悬于5ml无菌的生理盐水中，10倍稀释成不同梯度，取10μl上层清夜滴于YPD固体培养基，24小时后计算菌落数，统计每克肾脏白色念珠菌的浓度(cfu/g表示)。结果表明，空白对照组小鼠存活率20％，和厚朴酚治疗组小鼠存活率20％，氟康唑治疗组小鼠存活率80％，联合治疗组小鼠存活率100％。
0.5％，30℃，200rpm振荡培养。分别于0、12、24、36和48h后，所有菌液中各取100μL，再用0.9％生理盐水10倍系列稀释，从不同稀释倍数的菌液中各取100μL均匀涂布于含YPD琼脂固体培养基表面。平皿于30℃真菌培养箱中培养48h后计数菌落数目，以YPD平皿上生长菌落数达20个为最低限量。计算活菌落数目(CFU)，以log10CFU/mL对时间作曲线[0023] (4)体 内 协 同 实 验：将 体 重18-20g 的BALB/c 小 鼠 尾 静 脉 接 种C.albicansYL371(1×105cfu/只)，24小时后随机分成四组：空白对照组(不给药物)，和厚朴酚治疗组(5mg/kg/day)，氟康唑治疗组(1mg/kg/day)，联合治疗组(氟康唑1mg/kg/day，和厚朴酚5mg/kg/day)，每组10只，腹腔注射给药，连续治疗5天，第六天统计各组小鼠存活数量，并断颈处死，取肾脏研磨，将组织匀浆悬于5ml无菌的生理盐水中，10倍稀释成不同梯度，取10μl上层清夜滴于YPD固体培养基，24小时后计算菌落数，统计每克肾脏白色念珠菌的浓度(cfu/g表示)。结果表明，空白对照组小鼠存活率20％，和厚朴酚治疗组小鼠存活率20％，氟康唑治疗组小鼠存活率80％，联合治疗组小鼠存活率100％。