一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及它的应用

摘要

本发明公开了一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及它的应用，所述猪戊型肝炎病毒抗原表位序列如SEQ ID No：8所示。通过计算机软件筛选和实验验证得到的猪戊肝病毒的抗原表位，一方面可以将其应用于快速特异猪戊肝诊断试剂盒，用于猪戊肝的快速诊断，特别是研制疫苗免疫抗体和自然隐性感染抗体的鉴别诊断技术用于猪戊肝流行的监控；另一方面也可以设计特异、安全和高效的猪戊肝疫苗用于猪戊肝的预防、控制猪戊肝的流行和阻断戊肝由猪向人传播。

权利要求

1.一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其序列如SEQ ID No 8所示。

2.权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒抗原表位在猪戊型肝炎疫苗制备中的应用。

说明书

一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及它的应用

[0001] 本申请是申请日为2009年4月1日，申请号为200910048702.6，发明名称为《猪戊型肝炎病毒抗原表位及其应用》的发明专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及一种肝炎病毒抗原表位，尤其涉及一种猪戊型肝炎病毒抗原表位及其在体外检测和疫苗中的应用。

背景技术

[0003] 戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是一种经粪、口途径传播的非甲-非乙型肝炎病毒。该病毒会在人群引起暴发流行，主要侵害青壮年，对孕妇可造成20％的病死率。1986-1988年我国新疆南部地区因饮水污染导致戊型肝炎流行，共计发病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年来戊型肝炎发病率有逐年增加的趋势，据我国卫生部统计，戊肝发病率2003年比2002年上升40.4％。因此，戊肝防控已列入各级公共卫生机构的工作日程。

[0004] 近年来研究发现，HEV可以感染猪、牛、羊、鼠和鸡等动物。其中，病毒在猪和鼠的抗体阳性率高于50％，由此推测动物是HEV传播的重要中间宿主。基因序列分析表明，从动物体内分离的戊型肝炎病毒与人的HEV有极高的基因同源性，并且已有人食用野猪肉和鹿肉而感染戊肝的报道，证明戊肝是一种可以通过食物传播的人畜共患疫病。葛胜祥等(中国人兽共患病杂志，2003，19(2)，108-109)对我国20个省、市和自治区的120个养猪场的8626只成年猪进行了HEV血清学调查，结果表明平均感染阳性率为83.4％，其中最高省份为内蒙古(100％)，最低为湖北(68％)。鉴于我国HEV居高不下的感染率，对猪戊肝病毒的表位进行研究，建立特异、有效的猪戊肝检测方法，研制安全、有效的猪戊肝疫苗，了解的流行发病规律，阻断该病由猪向人的传播，对于保证人民的健康安全意义重大。

[0005] 国内第二军医大学的学者Qi(Journal of Virological Methods 1995，5，55-66)分析了人HEV假定的开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3的蛋白顺序，合成了7个肽，发现其中3个肽具有免疫原性，可用作HEV的诊断。美国学者Meng(Virology 2001，288，203-211)从人HEV ORF2中扩增出不同大小的交互重叠的重组肽段，发现其中的片段之一——pB166为中和表位，可用作HEV的疫苗开发及诊断。日本学者Niikura(Virology 2002，293，273-280)报道了人HEV-VLP的C末端11个氨基酸肽段具有免疫原性，能够诱导产生抗体。厦门大学的学者Zhang(Vaccine 2005，23，2881-2892)发现人HEV外壳蛋白394-606位肽段以二聚体的形式可与HEV人血清强烈反应，用作疫苗可抗猕猴的实验感染。印度学者Deshmukh(Vaccine 2007，25，4350-4360)报道表达的完整人HEV ORF2蛋白和ORF2内部
458-607位肽段具有免疫原性，起到中和作用。可用作疫苗的开发。但是，到目前为止，还没有猪HEV开放阅读框ORF1、ORF2和ORF3相关的蛋白表位的系统筛选报道。

[0006] 虽然猪戊肝研究越来越得到全世界的重视，但目前国内外对猪戊肝的研究多限于局部区域的流行病学调查和一些简单的动物感染试验。在猪戊肝防控研究方面尚有以下有待回答问题和技术瓶颈。目前还没有猪戊肝病毒的表位研究报道，市场上用于猪戊肝检测的试剂盒是用于人戊肝检测的试剂盒。虽然猪戊肝病毒与人戊肝病毒序列同源性很高，但是他们之间毕竟还是有些差别，用人的戊肝病毒表位来检测猪戊肝病毒导致检测的特异性(Speciality)不强，不能特异反映出猪戊肝流行规律。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的在于提供一种猪戊型肝炎病毒抗原表位。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种用于猪戊型肝炎体外检测的多肽。

[0009] 本发明的又一个目的在于提供一种用于制备猪戊型肝疫苗的多肽。

[0010] 本发明利用计算机软件从猪戊型肝炎病毒全基因组开放阅读框ORF1、ORF2和ORF3的对应蛋白中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index，AI)。利用现有的软件，如：GCG(Madison，Wisconsin，USA)及DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)从猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的蛋白中计算AI和辅助识别抗原区。根据猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的已知蛋白质取得的氨基酸序列，再用计算机程序来估计它们的抗原区(AI)(一般10到15个氨基酸)。

[0011] 一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0012] Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ile-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gly-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro-Gly-Asp-Glu。

[0013] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0014] Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-Ala-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser。

[0015] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0016] Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-Arg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Ala-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile-Leu-Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu-Ser。

[0017] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0018] Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-Ile-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pro-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys。

[0019] 通过分析，多肽Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu、、多肽Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly、多肽Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu、多肽Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg和多肽Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu是猪戊型肝炎病毒抗原表位的重要组成部分，是抗体结合抗原识别表位不可或缺的重要组成部分，这些多肽可以单独、一种多肽的N端与另一种多肽C端的连接或连接于其它多肽的N端或C端，所述的这些多肽单独或共同对猪戊型肝炎的体外检测及免疫抗体的制备起到重要作用。

[0020] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0021] Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-Ile-Phe-Ile-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-Phe-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly。

[0022] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0023] Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg。

[0024] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0025] Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg。

[0026] 另一种猪戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下：

[0027] Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu。

[0028] 上述多肽可以通过化学合成的方式完成。化学合成采用Fmoc方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994，24，3188-3193；J.Org.Chem.1972，37，3404-3409；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985。

[0029] 上述多肽还可以通过与其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可以通过基因工程方式制得，即通过目标融合蛋白的DNA转导/转化至基因工程菌株，如：大肠杆菌(E.coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表达并纯化，或在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠骨髓瘤SP2/O细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞中表达并纯化后，得到将其中一种抗原C末端，经由酰胺键(amide bond)和另一种抗原N末端首尾相连的融合蛋白产物(Protein Expr.Purif.，2008，59，189-196)。

[0030] 基因工程方法制备蛋白质抗原的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行。具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002，第1217-1270页。适宜的原核表达载体如pEGX系列原核表达载体(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表达载体(Novagen)等。特别优选pGEX-4T-2载体。

[0031] 对于不同肽段融合的抗原，本领域众所周知其构建原则和方法。具体而言，为了不影响待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之间添加一个接头。关于接头的选择具体可参见Protein Eng.，2001，14，529-532。

[0032] 由上述多肽单独或组合或融合而形成的抗原用于检测应答猪戊型肝炎病毒而产生的抗体。具体而言，这些多肽在猪戊型肝炎体外检测中的应用。

[0033] 检测方法可以有多种，例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术和蛋白芯片检测技术等。间接酶联免疫测定，即间接ELISA是最常用的检测方法。

[0034] 间接ELISA方法基本原理是：多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相抗原(多肽)结合的抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据对照物，可对抗体进行定量或定性测定。

[0035] 上述多肽单独或组合或融合而形成的抗原用于制备抗猪戊型肝炎病毒抗体。

[0036] 本发明技术方案实现的有益效果：

[0037] 本发明通过计算机软件筛选和实验验证得到了猪戊肝病毒的抗原表位。一方面可以将其单独或组合应用于快速特异猪戊肝诊断试剂盒，用于猪戊肝的快速诊断，特别是研制疫苗免疫抗体和自然隐性感染抗体的鉴别诊断技术用于猪戊肝流行的监控；另一方面也可以设计特异、安全和高效的猪戊肝疫苗用于猪戊肝的预防、控制猪戊肝的流行和阻断戊肝由猪向人传播。

具体实施方式

[0038] 以下详细描述本发明的技术方案，本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

[0039] 本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

[0040] 实施例1猪戊肝病毒表面抗原

[0041] 利用计算机软件从猪戊型肝炎病毒全基因组开放阅读框ORF1、ORF2和ORF3的对应蛋白中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index，AI)。利用现有的软件，如：GCG(Madison，Wisconsin，USA)及DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)从猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的蛋白中计算AI和辅助识别抗原区。根据猪HEV的ORF1、ORF2和ORF3的已知蛋白质取得的氨基酸序列，再用计算机程序来估计它们的抗原区(AI)(一般10到15个氨基酸)。

[0042] 进过分析，分别从ORF1、ORF2和ORF3选定如下多肽：

[0043] ORF1：

[0044] swHEV-1：83-140

[0045] Ala-Gly-Arg-Cys-Leu-Glu-Val-Gly-Ala-His-Pro-Arg-Ser-Ile-Asn-Asp-Asn-Pro-Asn-Val-Leu-His-Arg-Cys-Phe-Leu-Lys-Pro-Val-Gly-Arg-Asp-Val-Gln-Arg-Trp-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr-Arg-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Cys-Arg-Arg-Ser-Ala-Leu-Arg-Gly-Leu-Pro-Pro，

[0046] 其相应的DNA序列为：

[0047] swHEVN-1：281-454

[0048] ccgggcgctg tcttgaggtg ggtgcccacc cacgttctat taatgacaaccctaacgtcctgcatcgctg ctttcttaaa cctgttggcc gcgacgttca gcggtggtat accgctccta cccgtggccctgcagcaaat tgccggcggt ccgctctccg cgggcttcca cctg。

[0049] swHEV-2：874-925

[0050] Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ile-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gly-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro-Gly-Asp-Glu，

[0051] 其相应的DNA序列为：

[0052] swHEVN-2：2654-2809

[0053] tcgaaca taaccccaaa cggctcgagg ccgcctatcg ggagacctgctcccgacgggggacggctgc ttaccccctg ctcggtgccg gcatatataa ggtccctgtt gggttgagct ttgatgcctgggagcgtaac caccgacccg gggatgaat。

[0054] swHEV-3：1295-1346

[0055] Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-Ala-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser，

[0056] 其相应的DNA序列为：

[0057] swHEVN-3：3917-4072

[0058] atag tgtgctcact tttgagctca cggacatagt gcactgccgt atggcagcgc ccagccagcgcaaggcggtc ctgtcaactc ttgtcggcag gtacggccga cgtactaaat tgtacgaggc cgcacacgcagatgtccgcg gatctctgaa tc。

[0059] swHEV-4：1521-1582

[0060] Glu-Ser-Leu-Arg-Gly-Phe-Trp-Lys-Lys-His-Ser-Gly-Glu-Pro-Gly-Thr-Leu-Leu-Trp-Asn-Thr-Val-Trp-Asn-Met-Ala-Val-Ile-Ala-His-Cys-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Leu-Lys-Val-Ala-Ala-Phe-Lys-Gly-Asp-Asp-Ser-Val-Val-Leu-Cys-Ser-Asp-Tyr-Arg-Gln-Ser-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala，

[0061] 其相应的DNA序列为：

[0062] swHEVN-4：4561-4746

[0063] gttcgctctg cttgggttct acaggcaccg aaggagtctc tgcgaggcttctggaagaaacactctggtg agcctggcac cctattatgg aataccgttt ggaacatggc tgtcatagca cactgttatgaattccgcga ccttaaggtt gcagcattca agggggacga ttctgttgtg ctttgc。

[0064] ORF2：

[0065] swHEV-5：90-153

[0066] Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-Arg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Ala-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile-Leu-Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu-Ser，

[0067] 其相应的DNA序列为：

[0068] swHEVN-5：5422-5607

[0069] ctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtcccagcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgttgacggc tgtggctccg gctcctgacactgcacccgt ccctgatgtt gattcccgtg gcgctatctt gcgccgccag tataatt[0070] swHEV-6：433-476

[0071] Ala-Gln-Gln-Asp-Lys-Gly-Ile-Ala-Ile-Pro-His-Asp-Ile-Asp-Leu-Gly-Glu-Ser-Arg-Val-Val-Ile-Gln-Asp-Tyr-Asp-Asn-Gln-His-Glu-Gln-Asp-Arg-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Ser-Arg-Pro-Phe，

[0072] 其相应的DNA序列为：

[0073] swHEVN-6：6451-6582

[0074] ctcagcagga caagggtata gctattccac atgatattga tctcggtgagtcccgtgtggtcattcagga ttatgataat caacatgagc aagaccgccc caccccctct cctgctccct ctcgcccttt tt。

[0075] swHEV-7：606-653

[0076] Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-Ile-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pro-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys，

[0077] 其相应的DNA序列为：

[0078] swHEVN-7：6970-7113

[0079] c cgtgtctatt tctgctgttg gtgtccttgc ccctcattct gcgctggcta ttctggaggacaccgctgat taccctgctc gcgcccatac ttttgatgat ttctgccctg agtgccgttc actcggccttcagggttgtg ctt。

[0080] ORF3：

[0081] swHEV-8：22-58

[0082] Cys-Pro-Arg-His-Arg-Pro-Val-Ser-Pro-Leu-Ala-Val-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Val-Val-Ser-Gly-Val-Thr-Gly-Leu-Ile-Leu-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，

[0083] 其相应的DNA序列为：

[0084] swHEVN-8：5246-5356

[0085] gcccg cgccaccggc cggtcagccc tctggccgtc gccgcgggcg gcgcagcggcggtgccggca gtggtttctg gggtgaccgg gttgattctc agcccttcgc cctccc。

[0086] swHEV-9：55-112

[0087] Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-Ile-Phe-Ile-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-Phe-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly，

[0088] 其相应的DNA序列为：

[0089] swHEVN-9：5345-5518

[0090] cttcgc cctcccctat attcatccaa ccaacccctt cgcatctgac attccagccg cagccggggctggagctcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtcccagcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttc。

[0091] swHEV-10：79-114

[0092] Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg，[0093] 其相应的DNA序列为：

[0094] swHEVN-10：5417-5524

[0095] tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgtt。

[0096] swHEV-11：91-114

[0097] Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg，

[0098] 其相应的DNA序列为：

[0099] swHEVN-11：5453-5524

[0100] ttggcgcg accagtccca gcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacctgccccagctggggcttcgc cgtt。

[0101] swHEV-12：79-101

[0102] Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu，

[0103] 其相应的DNA序列为：

[0104] swHEVN-12：5417-5485

[0105] tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttc。

[0106] 上述序列由GL-Biochem(shanghai)Ltd通过多肽合成仪合成后，再由HPLC纯化得到纯度大于95％的多肽。

[0107] 实施例2猪戊型肝炎病毒表位的筛选

[0108] 先用北京万泰实业生物医药有限公司生产的猪HEV总抗体ELISA试剂盒对采集到的猪血清进行进行鉴定，筛选出猪HEV阳性血清和阴性血清。

[0109] 再用猪HEV阳性血清和阴性血清对实施例1得到的猪HEV多肽进行ELISA鉴定，筛选出猪HEV表位抗原。其具体步骤如下：

[0110] 1.抗原稀释

[0111] 取10μl浓度为10mg/ml的多肽(将5mg合成的多肽溶解在0.5ml二甲基亚砜(DMSO)而得)与90ul PBS液混匀，得到的抗原稀释液溶度为1μg/μl。再取15μl抗原稀释液与5ml包被液混匀，得到的抗原稀释溶度为3μg/ml。在酶标板上加入抗原稀释溶度100μl/孔，4℃包被12h。

[0112] 2.封闭

[0113] 吸去包被夜，每孔加入200μl封闭液于37℃封闭2h。封闭液是3％牛血清白蛋白(BSA)/TBS液。

[0114] 3.加一抗

[0115] 用PBST液洗板3次，每孔加100μl 1％BSA/TBST液和10μl血清，震荡混匀，置37℃温育1h。

[0116] 4.加二抗

[0117] 用PBST液洗板5次，每孔加100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG或IgM(均购自于Immunology Consultants Laboratory，Inc.，USA)稀释液，置37℃温育1h。二抗用1％BSA/TBST液稀释。

[0118] 5.显色

[0119] 用PBST液洗板5次，每孔加底物液100ul，37度显色10min。底物液是由10ml柠檬酸缓冲液，0.4mlTMB和33μl 3％H2O2配置而成的。

[0120] 6.终止

[0121] 每孔加50μl 1mol/l HCl的终止液来终止反应，用酶标仪测OD值。当(样品OD值/阴性对照OD值)＞2.1为阳性，当(样品OD值/阴性对照OD值)＜2.1为阴性。实验结果见表一、表二和表三。

[0122] 所述试剂如下：

[0123] PBS液(500ml，pH7.4)：0.575g Na2HPO4和0.114g NaH2PO4加蒸馏水溶解，定容至入500ml。

[0124] 包被液(1000ml，pH9.6)()：1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3加蒸馏水溶解，定容至入1000ml。

[0125] TBS液(2000ml，pH8.6)：16g NaCl、0.4g KCl和2.42g Trizma-Base加蒸馏水溶解，定容至入2000ml。

[0126] TBST液(1000ml，Tween-20 的 浓 度 为0.1 ％ )：1000ml TBS 液 加 入 1.0ml Tween-20。

[0127] 柠檬酸缓冲液(100ml，pH3.5-4.0)：0.84g柠檬酸和0.294g柠檬酸钠加蒸馏水溶解，定容至入100ml。

[0128] 终止液(500ml，1M HCl)：40.88ml浓盐酸溶解于459.12ml蒸馏水。

[0129] 表一合成猪HEV多肽与猪HEV阳性血清盘的免疫反应(对于IgG)

[0130]

[0131] “+”表示阳性；“-”表示阴性。

[0132] 表二合成猪HEV多肽与猪HEV阴性血清盘的免疫反应(对于IgG)

[0133]

[0134] “+”表示阳性；“-”表示阴性。

[0135] 表三合成猪HEV多肽与猪HEV阳性血清盘的免疫反应(对于IgM)

[0136]

[0137] 经鉴定多肽swHEV-2、swHEV-3、swHEV-5、swHEV-7、swHEV-9、swHEV-10、swHEV-11、swHEV-12是阳性表位，是猪HEV表位。