红色红曲霉（Monascusrubber）Mr-99菌株及其应用

摘要

本发明属于生物技术保健品领域，涉及一株液体发酵高产胞外多糖红色红曲霉Mr-99菌株、用途和多糖制备方法。红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株，该菌株已于2011年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2011053。该菌株具有胞外多糖产量高、生长速度快、抗高温等多种优良特性。通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，胞外多糖产量最高可达18.6g/L。

权利要求

1.红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株，该菌株已于2011年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011053。

2.根据权利要求1所述的红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株用于生产红曲胞外多糖中的应用。

3.一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）取权利要求1所述的红色红曲霉Mr-99菌株保存菌种，在无菌条件下，用接种针挑少许菌种，转接于含PDA的培养平板上，活化培养；以同样方式接入活化好的菌种到PDA培养平板上，培养制得一级种子；

2）在查氏合成培养液，接入一级种子菌饼，摇床培养制得二级发酵种子；

3）接种二级发酵种子，发酵时间为70～100h；

4）发酵培养完毕，过滤发酵液，滤液离心，去除沉淀，取上清；

5）离心后的上清液中用乙醇沉淀法提取胞外多糖。

4.根据权利要求3所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：步骤3）中有机碳源选用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一种或多种，氮源选用无机氮源和有机氮源中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：有机碳源选用麦芽糖。

6.根据权利要求4所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：无机氮源选用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵中的一种或多种，有机氮源选用牛肉膏、酵母粉、蛋白胨中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：有机氮源选用酵母粉。

8.根据权利要求3～7任意一项权利要求所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于步骤3）中接种量为6%～10%（V/V），发酵罐的转数150～250 r/min，温度30～

35 ℃，通气量80～150 L/h，罐压0.1～0.5MPa。

9.根据权利要求3～7任意一项权利要求所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：步骤5）中向上清液中加入无水乙醇后置于2～8℃温度下静止过夜，然后于10000 ～15000rpm离心5～20 min，沉淀用乙醇和丙酮反复冲洗，最后于10000 ～

15000rpm离心5～20 min取沉淀烘干，即为胞外多糖。

10.根据权利要求9所述的一种高产红曲胞外多糖的生产方法，其特征在于：无水乙醇与上清液的体积比为2:1～6：1。

说明书

红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术保健品领域，涉及一株液体发酵高产胞外多糖红色红曲霉Mr-99菌株、用途和多糖制备方法。

背景技术

[0002] 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的由10个以上单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，具有能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老，增强机体免疫力等功能的一类活性多糖。自1970年日本千原羽田从香菇中分离出一种抗肿瘤的多糖后，科学界掀起了食用真菌多糖研究的热潮，目前己在国内临床应用的真菌多糖主要有：香菇多糖、云芝多糖、云芝糖肽、灵芝肽多糖、猴头菌多糖、银耳多糖等。

[0003] 红曲霉是一类十分重要的药用真菌，系中药红曲的基原菌，是我国重要的微生物资源，在我国已有上千年的使用历史，被广泛用于食品发酵剂，食品着色剂和中药配伍的生产。红曲霉属腐生真菌，通常出现在乳酸自然发酵的基质中，大曲、制曲作坊、酿酒液等都适于其繁殖，红曲霉最适生长pH 3.5～5.0，可耐pH 2.5，尤其嗜乳酸；适宜生长温度范围为26℃～42℃，能耐10 %的乙醇。由于红曲霉在发酵过程中能产生多种具有生理活性的代谢产物：如红曲色素、Monacolin类物质、γ-氨基丁酸以及多种酶类等，近年来，国内外关于红曲霉制剂及其代谢产物的研究成为热点。多糖类物质是红曲霉所含有的重要化学成分之一，相关研究表明红曲多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和提高免疫力等多种生物学功能，目前国内对红曲多糖的发酵生产工艺研究较少，尚处于探索阶段，国内已有文献报道的产胞外多糖红曲霉菌株的产量均处于较低水平，达不到工业化生产的要求。

发明内容

[0004] 针对市场上红曲多糖需求日益增长，而目前高产红曲多糖菌株缺乏、发酵生产工艺不完善等问题。本发明的目的是提供一株红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株。本发明的另外一个目的是提供采用上述的红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株制备红曲胞外多糖的方法。

[0005] 为了实现上述第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

[0006] 红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株，该菌株已于2011年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2011053。

[0007] 该菌株从自然发酵红曲米中筛选到一株红曲霉Mr-99菌株，该菌株具有高产红曲胞外多糖的特点，可用于红曲胞外多糖工业化生产菌株。

[0008] 该菌株在CYA培养基上25 ℃培养后7 d，菌落直径23 mm ～25 mm，表面质地丛转毛状，边缘流苏状；菌落初期为白色绒毛状，5 d后中心菌丝开始变红色，培养25 d后菌落的色泽为粉红色，直径达到 60 mm（附图1、图2）。

[0009] 显微镜观察菌丝光滑、有隔膜、含油滴、直径3 μm-7 μm，分枝状，含有色素颗粒；分生孢子球形或倒梨形，具有平截基部，单生或成链，直径6 μm～8 μm；闭囊壳呈椭球形，透明或红色，内充满密集排列的子囊孢子，子囊孢子卵形或者球形，大小为6 μm～7×4.5 μm，淡红色（附图3、图4）。

[0010] 生理生化实验表明，该菌株的适宜生长温度范围为28 ℃～36 ℃，最适pH范围为4.0～5.0，不能水解明胶，生长速度快，不产生桔霉素、抗高温等生物学特性。能够很好的利用各种有机碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、番薯粉等，其中最适生长碳源为麦芽糖；在氮源利用方面，可以利用可利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵等无机氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多种有机氮源，但在有机氮源中较无机氮源中生长的好，而且在以酵母粉为氮源的培养基中生长最好。

[0011] ITS基因序列分析结果表明，与红色红曲霉（Monascus rubber）的相似度最高达99%。根据李钟庆和郭芳红曲菌分种检索表、ITS基因序列Blast比对结果和傅立叶变换红外光谱扫描图谱，将菌株Mr-99为鉴定红色红曲霉（Monascus rubber）。

[0012] 为了实现上述第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

[0013] 一种高产红曲胞外多糖的生产方法，该方法包括以下的步骤：

[0014] 1）取所述的红色红曲霉Mr-99菌株保存菌种，在无菌条件下，用接种针挑少许菌种，转接于含PDA的培养平板上，活化培养；以同样方式接入活化好的菌种到PDA培养平板上，培养制得一级种子；

[0015] 2）在查氏合成培养液，接入一级种子菌饼，摇床培养制得二级发酵种子；

[0016] 3）接种二级发酵种子，发酵时间为70～100h；

[0017] 4）发酵培养完毕，过滤发酵液，滤液离心，去除沉淀，取上清；

[0018] 5）离心后的上清液中用乙醇沉淀法提取胞外多糖。

[0019] 作为优选，上述步骤3）中有机碳源选用乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉和番薯粉中的一种或多种，氮源选用无机氮源和有机氮源中的一种或多种。

[0020] 作为最优选，上述的有机碳源选用麦芽糖。

[0021] 作为再优选，上述的无机氮源选用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵中的一种或多种，有机氮源选用牛肉膏、酵母粉、蛋白胨中的一种或多种。

[0022] 作为优选，上述步骤3）中接种量为6%～10%（V/V），发酵罐的转数150～250 r/min，温度30～35 ℃，通气量80～150 L/h，罐压0.1～0.5MPa。

[0023] 作为优选，上述步骤5）中向上清液中加入无水乙醇后置于2～8℃温度下静止过夜，然后于10000 ～15000rpm离心5～20 min，沉淀用乙醇和丙酮反复冲洗，最后于10000 ～15000离心5～20 min取沉淀烘干，即为胞外多糖。

[0024] 作为再优选，上述的无水乙醇与上清液的体积比为2:1～6：1。

[0025] 红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株筛选自自然发酵的红曲米，可用于发酵生产红曲胞外多糖。该菌株在葡萄糖 60 g/L，蛋白胨 20 g/L，K2HPO4 10 g/L，MgSO4·7H2O，1.1 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 6.5的发酵培养基上，在摇床转速200 r/min，温度32 ℃的发酵条件下，培养96 h；发酵液用乙醇沉淀法提取，经苯酚-硫酸比色法（Dubois et al., 1956）检测胞外多糖产量最高可达18.6 g/L。红曲霉的应用至今已有上千年的历史，在民间红曲霉广泛作为粗药和用于制醋、酿酒等，在食品生产中已获得了长期使用，实践证明，红曲霉多数种都是比较安全的，被FDA认为是GRAS（generally recognized as safe）级食品添加剂。因此此法生产的红曲胞外多糖不存在安全上的隐患，能达到食品安全级。

附图说明

[0026] 图1为红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株在CYA上培养7天菌落正面照片。

[0027] 图2为红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株在CYA上培养7天菌落背面照片。

[0028] 图3为红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株的菌丝显微特征。

[0029] 图4为红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株的闭囊壳显微特征。

[0030] 图5为红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株的红外光谱扫描图谱。

[0031] 图6为红色红曲霉（M. ruber）Mr-99菌株制备的红曲胞外多糖。

[0032] 生物材料保藏说明

[0033] 红色红曲霉（Monascus rubber）Mr-99菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学生命科学学院，保藏时间：2011年3月2日，保藏号为CCTCC NO：M2011053。

具体实施方式

[0034] 下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。

[0035] 实施例1 红色红曲霉Mr-99菌株的分离、纯化和筛选

[0036] 1.1 培养基

[0037] （1）PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉18 g，水1000 mL，pH 自然；

[0038] （2）查氏合成培养基（种子培养基）：葡萄糖 30 g，NaNO3 3 g，酵母提取物1 g，K2HP04 1 g，KCl 0.5 g，MgS04.7H2O 0.5 g，FeS04·7H20 0．01 g，水1000 mL，pH 5.0；

[0039] （3）发酵培养液：葡萄糖 50 g，蛋白胨 20 g，KH2PO4 8 g，MgS04.7H2O 0.5 g，KCl0.5 g，去离子水 1000 mL，pH 6.0；

[0040] （4）CYA培养基（参照李钟庆 等，2004，鉴定用）：蔗糖 30.0 g，NaNO3 3 g，酵母提. .取物 5.0 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.05 g，FeSO47H2O 0.01 g，琼脂 18 g，水
1000 mL，pH 6.0。

[0041] 分离、纯化和筛选

[0042] 红色红曲霉Mr-99菌株分离自自然发酵的红曲米。将红曲米0.5 g用研钵研磨成粉状，取少量均匀的洒入PDA培养基表面，30 ℃培养48 h，待白色绒毛状菌丝长出后，挑取少许菌丝转接于另一PDA培养平板上继续培养，培养l W后重复上述分离纯化操作，经三次纯化后即可得到得性状均一的红曲霉菌株。将筛选获得的红曲霉菌株保存于PDA试管斜面培养基上并置于4 ℃冰箱中，编号备用。菌种使用之前需先活化，250 mL三角瓶装入50 mL发酵培养液，接入5块直径为1 cm菌饼，32 ℃摇床（200 r/min）培养96 h，发酵液用乙醇沉淀法提取红曲胞外多糖，经苯酚-硫酸比色法检测筛选获一株高产胞外多糖红色红曲霉Mr-99菌株，胞外多糖产量可达15 g/L ～18 g/L。

[0043] 实施例2 发酵法生产和制备胞外多糖的工艺流程

[0044] 取红色红曲霉Mr-99菌株保存菌种，在无菌条件下（无菌室或超净工作台），用接种针挑少许菌种，转接于含PDA的培养平板上，30 ℃活化培养108 h。以同样方式接入活化好的菌种到PDA培养平板上，在30 ℃培养120 h，即为一级种子。250 mL三角瓶装入50 mL 查氏合成培养液，接入5块直径为1cm Mr-99菌株一级种子菌饼，32 ℃摇床（200 r/min）培养96 h，即为二级发酵种子。根据发酵规模大小，如3.7 L发酵罐装2.5L发酵培养液，接种量8 %（V/V），转数200 r/min，温度32 ℃，通气量100 L/h，罐压0.3 MPa，发酵时间为96 h。发酵培养完毕，用四层纱布过滤发酵液，滤液用12000 rpm离心20 min，去除沉淀，取上清。

[0045] 向上述离心后的上清液中缓慢加入无水乙醇，边加入乙醇边震荡混匀，直至无水乙醇与上清液的体积比为4:1，放入4℃冰箱静止过夜，然后于12000 rpm离心10 min，沉淀用乙醇和丙酮反复冲洗（4次），最后于12000 rpm离心10 min取沉淀烘干，即为胞外多糖（附图4）。

[0046] 本发明中的红色红曲霉Mr-99菌株选育于自然发酵的红曲米，采用深层液体发酵方法，发酵产物与普通红曲发酵产物相比，普通红曲液体发酵产物胞外红曲多糖含量很低，经苯酚-硫酸比色法（Dubois et al., 1956）检测为0.5～3.5 g/L，按上述方法用Mr-99红曲霉菌株发酵发酵液中红曲胞外多糖含量可达15 g/L ～18 g/L。

[0047] 综上所述，经过红色红曲霉Mr-99菌株发酵，可以产生含量较高红曲胞外多糖发酵液，可用于红曲霉保健制品的制备。