一株枯草芽孢杆菌及其在处理奶牛场液体排废物的应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）CM2。该菌株在2010年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏中心，保藏形式为用于专利程序的生物材料保藏，保藏编号为CGMCC No.4232。该菌株蛋白酶活性高，能产生抑制植物土传病原真菌的稳定性物质和促进植物生长的物质。用该菌能发酵奶牛场液体排废物（牛尿等），其发酵物可以作为植物液体肥料的主要原料。用该原料生产的液体肥料能作为叶面肥在植物生长期叶面喷施，还可以作为根施肥在植物生长的任何时期灌根和随水浇灌使用。该液体肥料有预防植物病害和虫害、促进植物生长、增加农产品品质和产量的作用。该液体肥料适用于各种农作物和经济作物。

权利要求

1.一株枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）CM2，保藏编号为CGMCC No.4232。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CM2在处理奶牛场液体排废物中的应用。

3.一种用权利要求1所述枯草芽孢杆菌CM2生产液体肥料原料的方法，其特征在于，是收集奶牛场液体排废物，在其中加入液体排废物体积比1/2-1/6的絮凝剂，絮凝沉淀后，沉淀物用于固体发酵生产有机肥；上清加到混合罐中，然后在混合罐内加入液体体积比的5%-30%的豆粕或者工业蛋白胨，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为

6.5-7.5，混合液排入发酵罐，灭菌后接种CM2菌株的种子液，30℃发酵，发酵结束后发酵物固液分离，固体用来生产有机肥，液体即为生产液体肥料的原料。

4.一种用权利要求1所述枯草芽孢杆菌CM2生产叶面肥的方法，其特征在于，是收集奶牛场液体排废物，在其中加入液体排废物体积比1/2-1/6的絮凝剂，絮凝沉淀后，上清加到混合罐中，然后在混合罐内加入液体体积比15%的工业蛋白胨，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为7.0，混合液排入发酵罐，灭菌后接种CM2菌株的种子液，30℃发酵，发酵结束后发酵物固液分离，液体即为叶面肥。

说明书

一株枯草芽孢杆菌及其在处理奶牛场液体排废物的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体是涉及微生物在农业生产上的应用，主要是一株枯草芽孢杆菌处理奶牛场液体排废物等方面的应用和用该菌能发酵奶牛场液体排废物（牛尿等）的发酵物作为植物液体肥料的主要原料来生产叶面肥和根施肥的方法。技术背景

[0002] 奶牛养殖业正在向大群饲喂和舍饲的集约化管理体系方向发展，大群的奶牛集中饲养在有限的小区域，会产生大量废弃物和有臭味的固体、液体和气体，对环境的污染越来越严重。有些近邻城市和村庄的奶牛场不得已搬迁到远郊或者农田中。短时间存在的牛场或者散养的奶牛排除的废物在农村广阔环境中是可以消化的，但是长期养殖和比较集中的奶牛场的排废物成为农田重要的污染源。近几年由于国家对有机肥生产的支持和补助，奶牛场的牛粪等固体排废物得到了有效的处理和资源化利用。但是奶牛场排除出的液体废物如牛尿等排到了田间的沟渠中，由于自然的环境对这些的污染物净化能力有限，导致严重的水体和土壤环境的污染。

[0003] 养殖污染导致环境纠纷不断，因此奶牛场的污染物处理非常重要，一个集约化的养殖场在建设工程中要充分考虑到污染物的处理装置和处理技术。

[0004] 奶牛场的污染源存在三个方面，即固体污染物：牛粪；液体污染物：牛尿和牛场冲洗废水；气体污染：牛粪和牛尿发出的臭味。三种污染物中如果牛粪和牛尿处理的及时和得当，就会大大减少臭味的发生。因此奶牛场污染关键处理技术在于牛粪和牛尿的处理。

[0005] 牛粪的处理技术基本已得到解决，一般采取的是加入微生物促腐剂，抑制臭味发生和促进牛粪快速腐熟生产有机肥。牛尿等液体排废物一般的处理方法是建立沼气发酵池，生产出沼气后再把牛尿等液体作为液体肥料施到农田中。但是沼气法处理投入成本高，除了需建立沼气池外，还要建立输送沼气的管道。并且沼气发酵结束后沼气池内大量处理过的水还要进行二次处理，如还需要运送到农田中灌溉等。基于沼气法处理牛尿等废水要求的条件严格，只有大型的养殖场和资金雄厚的企业才能采用。一般的奶牛场只是建立了牛粪的处理，而牛尿等液体废物直接排放到田间的沟渠中。发明人曾考察了江苏省泗洪县和泗阳县的奶牛场。这些奶牛场基本是建立在离村庄比较远的农田中，牛粪被处理成有机肥用于农田，而牛尿等液体废物直接排放到田间的沟渠中。顺着用于排放雨水的沟渠牛尿等污染物四处横流，下大雨时这些污水蔓延到居民的院落和房间中，造成严重的环境污染和疾病的流行。牛尿排放地方杂草和农作物死亡严重，苍蝇大量滋生，农民的生存环境日益恶劣。每头牛每天大概产生10-15公斤的牛尿，一般的奶牛场平均5000头牛，一天大概产生牛尿50000公斤多，再加上奶牛场冲洗场地的废水，每天养殖废水的排放量达到50-100吨。

[0006] 有关利用微生物把牛尿等物质转化为可利用的资源的现有技术有：公开号为CN101817593的中国专利申请是利用恶臭假单胞菌降解牛尿废水中的吲哚和恶臭素等杂环芳香族化合物；降解的目的是让排放到环境中的牛尿等物质无害化，以达到这些废水能够排放到环境中。公开号为CN101591203的中国专利申请是以牛粪混合牛尿为载体，利用产抗菌肽的生物工程构建的酵母菌固体发酵生产有机免疫肥；这个专利技术采用的方法处理奶牛场牛尿的数量有限，固体发酵生产的有机肥中，如果采用牛尿，大量的水分很难去除，只能采用自然挥发或向土壤中渗漏的方法减少发酵料的水分，才能达到酵母菌固体发酵的需要。公开号为CN101665805的中国专利申请是利用养殖废水生产微生物絮凝剂的方法，这个方法能充分利用牛尿的资源来生产应用价值高的微生物絮凝剂，发酵生产的絮凝剂要经过工业的提取和干燥而得到絮凝剂产品，在这些工业化生产过程中，还会产生大量的废水，比如发酵物中上清液和产品冲洗和干燥中的水分还要经过处理排放到环境中。本发明的技术是在工业生产叶面肥中能全部应用牛尿中的水分而不需要应用环境中的其他水资源。能充分利用奶牛场等大型养殖厂产生的养殖废水。开发出一种能广泛应用于农业生产，提高农作物产量和品质的一种叶面肥或者液体有机肥，在生产这些肥料中不需要利用其他水资源，该技术应用的结果是使有害废水得到利用，同时节约了大量的水资源。

发明内容

[0007] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其在处理奶牛场液体排废物等方面的应用。

[0008] 本发明所说枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）CM2，该菌株的保藏编号为CGMCC No.4232。

[0009] 本发明CM2菌株的蛋白酶活力是449.2U/ml；对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌抑菌圈明显；实生苗促生效果显著；该菌株经形态和生理生化鉴定为芽孢杆菌属的一个种（bacillus sp.）；又经16SrDNA序列分析，提取菌落DNA，用细菌通用引物扩增出1442bp的清晰条带，经测序和在Genbank上比对与bacillus subtilis 相似性99%以上。

[0010] 本发明还公开了所述枯草芽孢杆菌CM2在处理奶牛场液体排废物中的应用。

[0011] 一种用所述枯草芽孢杆菌CM2生产液体肥料原料的方法，是收集奶牛场液体排废物，在其中加入液体排废物体积比1/2-1/6的絮凝剂，絮凝沉淀后，沉淀物用于固体发酵生产有机肥；上清加到混合罐中，然后在混合罐内加入液体体积比的5%-30%的豆粕或者工业蛋白胨，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为6.5-7.5，混合液排入发酵罐，灭菌后接种CM2菌株的种子液，30℃发酵，发酵结束后发酵物固液分离，固体用来生产有机肥，液体即为生产液体肥料的原料。

[0012] 一种用所述枯草芽孢杆菌CM2生产叶面肥的方法，是收集奶牛场液体排废物，在其中加入液体排废物体积比1/2-1/6的絮凝剂，絮凝沉淀后，上清加到混合罐中，然后在混合罐内加入液体体积比的20%的豆粕或者工业蛋白胨，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为7.0，混合液排入发酵罐，灭菌后接种CM2菌株的种子液，30℃发酵，发酵结束后发酵物固液分离，液体即为叶面肥。

[0013] 上述生产叶面肥方法中发酵物固液分离后的液体能达到农业部氨基酸叶面肥国家标准(GB/T17419—1998)的要求（表1），直接作为氨基酸叶面肥；此外，也可以根据生产不同叶面肥的要求，在CM2液体发酵物中加入腐殖酸生产含腐植酸水溶性肥料；或加入各种大量元素生产大量元素水溶肥料；或加入微量元素生产微量元素水溶肥料。这些液体肥料的生产和包装标准参照下列标准执行：含腐植酸水溶性肥料标准是NY1106-2006；大量元素水溶肥料标准NY1107-2006；微量元素水溶肥料标准是GB17420-200X；含腐植酸水溶性肥料GB17419-200X；液体技术包装要求NY/T1108-2006；水溶肥料水不溶物含量的测定NY/T1115-2006；水溶性肥料汞、砷、镉、铅、铬的限量及其含量测定NY1110-2006。

[0014] 。

[0015] 本发明利用一株蛋白酶活性高，能产生抑制植物土传病原真菌稳定性物质和促进植物生长的物质枯草芽孢杆菌CM2，以奶牛场液体排废物（牛尿等）为原料，经该菌株发酵的产物可以作为植物液体肥料的主要原料。用该原料生产的液体肥料能作为叶面肥在植物生长期叶面喷施，还可以作为根施肥在植物生长的任何时期灌根和随水浇灌使用。该液体肥料有预防植物病害和虫害、促进植物生长、增加农产品品质和产量的作用。

[0016] 本发明与现有技术相比，用微生物直接处理牛尿等液体污染物，处理后的液体能转化为具有很好商品价值的肥料原料或叶面肥。该技术与沼气法处理牛尿相比较的优点是处理产物可直接包装成液体肥料，不需要二次处理，减少水资源的使用（生产叶面肥不用其他水资源，而用牛尿为载体）。本专利中的技术中小型的养殖场和有机肥企业均可应用，采用了此技术不但养殖废水得到处理，还能给企业增加产品种类，生产的叶面肥和其他液体肥料在推广应用中能获得巨大的经济效益。是一项农业生产、畜禽养殖业和有机肥料（包括有机叶面肥）生产三者相结合而形成的对环境友好的优良循环链。

具体实施方式

[0017] 实施例1：功能菌株的获得

[0018] 采集农田土壤、植物组织（根茎叶果实）、牛粪发酵物和牛场氧化塘的水样，利用稀释平板法和倾注培养法获得微生物菌株578株；这些菌株经纯化后分别用牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基发酵24h，按照QB/T1803 —1993Follin-Phenol法测定蛋白酶酶活。保留蛋白酶活力在200U/ml以上的菌株80株。利用对峙培养法筛选对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）有拮抗的菌株（试验方法见文献：王慧萍等茄子黄萎病菌抗性根际芽孢杆菌的筛选与鉴定，微生物学杂志，2006，26（11）：40-44）；保留有抑菌圈的菌株23株。采用实生苗促生实验筛选促生效果明显的菌株（实验方法见文献：刘维红等.ACC脱氨酶活性细菌筛选及对番茄促生的研究，江苏农业科学，2006，（2）。80-84），得到一株编号为CM2的菌株。

[0019] 2010年10月20日将CM2菌株送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No:4232，分类命名为枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）；保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

[0020] 实施例2：CM2菌株蛋白酶活性测定

[0021] CM2菌株斜面保存的菌种经牛肉膏蛋白胨培养基31℃活化24h，用2%的酪蛋白做标准曲线，采用FoLin—酚法测定蛋白酶活力（实验方法见陈毓荃：生物化学实验方法和技术[M].北京:科学出版社，2005，183-186）。测定CM2菌株的蛋白酶活力是449.2U/ml。

[0022] 实施例3：CM2菌株蛋白酶碳源和氮源的选择

[0023] （1）将斜面保存的CM2菌株接一环到种子培养液中，250mL三角瓶装液量50mL，31℃，180r/min振荡培养36h。

[0024] （2）采用发酵培养基：碳源，氮源，NaC1 0.4g，KH2HPO4 0.03g，CaC12 0.02g，MgSO47H2O 0.02g，pH值7.0~7.2。

[0025] （3）以2g葡萄糖作为碳源，大豆粉，胰蛋白胨，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，硫酸铵各2g作为氮源，培养基装量为50mL，自然pH值，31℃、180r/min发酵36h,测定酶活力。不同氮源的酶活力分别为234U/mL，260U/mL，480U/mL，254U/mL，386U/mL，0U/mL。由此可见，以蛋白胨为氮源产酶量最高，以硫酸铵作为氮源时则不产酶。

[0026] （4）以筛选出来的2g蛋白胨作为氮源，小麦粉，玉米粉，小麦粉+玉米粉，蔗糖，木糖，乳糖，葡萄糖各2g作为碳源，培养基装量为50mL，自然pH值，31℃、180r/min-1发酵36h，测定酶活力。不同碳源的酶活力分别为205U/mL，261U/mL，376U/mL，、416U/mL，318U/mL，308U/mL，508U/mL。以葡萄糖作为氮源时，产酶量最高。

[0027] 实施例4：CM2拮抗植物病原菌活性测定

[0028] 将斜面保存的CM2菌株划线法接种牛肉膏蛋白胨培养基平板上，选取单菌落，用无菌打孔器取单菌落的菌片，菌片用无菌镊子摆放到马铃薯葡萄糖培养基平板上，对面同样摆放植物病原真菌的菌片。利用对峙培养法测定CM2菌株对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）的拮抗圈（试验方法见文献：王慧萍等茄子黄萎病菌抗性根际芽孢杆菌的筛选与鉴定，微生物学杂志，2006，26（11）：40-44）。测定抑菌圈直径为2.2cm和1.8cm。

[0029] 实施例5：CM2菌株产抑菌真菌物质稳定性的测定

[0030] （1） 将CM2菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，31℃，180r/min振荡培养36h，5000r/min离心10min，上清液通过0.22μm微孔滤膜过滤得无菌体发酵液。

[0031] （2） 将无菌发酵液置于100℃水浴锅中，分别处理20min、40min、60min、80min、100min，检测对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑菌活性，以未处理样品为CK，确定其抑菌活性为100%。

[0032] （3） 将（1）发酵液pH值分别调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室温下放置48h后检测抑菌活性，以pH值为3.0~10.0的无菌培养基为CK。检测抑菌活性5.0-8.0之间活性不变，过酸和过碱活性下降。

[0033] （4） 将（1）发酵液加入蛋白酶K和胰蛋白酶（浓度为10ug/mL），31℃水浴60min检测抑菌活性，以未加蛋白酶的样品为CK，定其抑菌活性为100%。

[0034] （5） 将（1）发酵液置于4℃冰箱中保存，每隔30d检测其抑菌活性，共检测6次。半年内活性不下降。

[0035] 实施例6：CM2菌株产生促生物质的检测

[0036] CM2菌株以牛肉膏蛋白胨液体培养基发酵，发酵物离心，取上清液100℃加热30min。分别采用浸种后培养，和直接浸种培养。结果表明：CM2菌株的发酵上清液能提高番茄种子的发芽率，并且对番茄的根茎的伸长有促进作用（见表2）。

[0037]

[0038] 注：同列的相同字母表示新复极差检验差异不显著（p＞0.05）。

[0039] 实施例7：液体肥料原料的生产

[0040] （1） 在南京师范大学技术人员指导下，江苏省瑞龙肥业有限公司的奶牛场建设时建造雨污分流设施。在奶牛场内建立一个沉淀池（长×宽×高：8米×6米×0.8米），牛尿等污水进入沉淀池。沉淀池在距池底0.6米上开一个可调节的排水口，排水直接排入过滤池（长×宽×高：8米×6米×1.2米）。沉淀池上部要加防雨盖，防止雨水进入池中。污水进入沉淀池后加入体积比1/3的絮凝剂（絮凝剂是：生物质电厂灰），絮凝沉淀后，上清排入过滤池。

[0041] （2） 过滤池的液体用水泵抽到混合罐（500L），在混合罐内加入体积比的5%的豆粕，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为7.5，混合液排入700L的发酵罐，实体灭菌后接种CM2菌株的种子液（种子液是经牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基摇瓶发酵12h），30℃，发酵12h。发酵物固液分离。固体用来生产有机肥，液体即为生产液体肥料的原料。

[0042] 实施例8：与实施例7基本相同，不同之处在于步骤（2）是；过滤池的液体用水泵抽到混合罐（700L），在混合罐内加入体积比的30%的豆粕，搅拌均匀，用氢氧化钾或盐酸调节混合液的pH值为6.5，混合液排入1500L的发酵罐，实体灭菌后接种CM2菌株的种子液（种子液是经牛肉膏蛋白胨液体发酵培养基摇瓶发酵12h），30℃，发酵12h。发酵物固液分离。固体用来生产有机肥，液体即为生产液体肥料的原料。

[0043] 实施例9：CM2菌株发酵牛尿发酵物的促生测定

[0044] （1） 实施例7生产的液体用水稀释100倍、200倍和500倍。

[0045] （2） 辣椒种子经催芽后播种花盆中，每湓留苗2株，当盆栽辣椒苗生长到3-5叶期，每盆浇稀释液20mL，每处理6盆，3次重复，设清水处理为对照。28℃，日光照10h，于第17天测量辣椒苗株高及鲜重。测定结果见表3：