一种千层塔原叶体诱导和增殖方法

摘要

本发明公开了一种千层塔原叶体诱导和增殖方法。该方法以孢子囊或孢子作为外植体，进行离体组织培养，并建立了千层塔原叶体的诱导体系，原叶体的诱导频率达到15%，在人工调控下，对原叶体进行增殖培养，月增殖倍数达到5倍。方法简单易行，效率高，为千层塔的人工快速繁殖建立重要的技术基础。

权利要求

1.一种千层塔原叶体诱导和增殖方法，其特征在于，按以下步骤进行：（1）外植体的选择

从野外采集蛇足石杉的孢子囊，经自来水冲洗干净；

（2）外植体的表面灭菌

将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70%的乙醇溶液中30s~60s；接着置于浓度0.1%的HgCl2溶液中浸泡5min ~8min，再用无菌水冲洗3-5次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为千层塔原叶体诱导的外植体；

（3）原叶体的诱导培养

将得到的外植体接种在原叶体诱导培养基上，在培养温度为22±2℃、光照时间12h/d~16h/d、光照强度为300 Lx~1500 Lx条件下培养10-12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；

所述的原叶体诱导培养基组成为：在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L；

（4）原叶体的增殖

2 2

将步骤（3）中获得的原叶体组织切割成0.2cm~0.5cm 的小片，然后转入原叶体增殖培养基上继续培养，培养条件与步骤（3）中相同，培养6周后，获得大量的新增殖的原叶体；

所述的原叶体增殖培养基组成为：在常规的MS培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸

0.2mg/L~1mg/L和6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2 mg/L。

说明书

一种千层塔原叶体诱导和增殖方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种千层塔原叶体诱导和增殖方法。

背景技术

[0002] 千层塔为石杉科（Huperziaceae）石杉属（Huperzia Bernh.）植物蛇足石杉（Huperzia serrata（Thunb.）Trevis）的全草，异名：虱子草、矮杉树、虱婆药。千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛、苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1972年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。由于千层塔所具有的显著医疗作用和潜在的市场效益，其野生资源迅速减少。世界各国同行从不同的角度对这一重要药用植物资源进行研究。

[0003] 自然环境中千层塔生活史包括两种繁殖方式，一种是通过孢子进行繁殖。孢子萌发后属地下生配子体，需6~15年才能成熟。成熟的配子体即块状体，其上产生精子器和卵子器。在水环境中，卵子和精子结合形成胚，再发育成孢子体。孢子体是千层塔作为药用植物的原植物形式。孢子体的根生于茎的基部，为不定根。不定根和真菌共生，其真菌的菌丝侵入根的皮层细胞间隙中，而不侵入细胞内，为外生菌根。共生真菌的菌丝起到了根毛的功能，增加根系的吸收面积。自然界中千层塔的另一种繁殖方式是芽孢繁殖，但这种方式在野外极少发现。因此，千层塔野生资源的再生受到了极大限制。

[0004] 利用植物组织培养可进行珍稀和濒危药用植物的微繁殖，建立高效和稳定培养系，培育出脱毒的优质品种，解决珍稀濒危药用植物人工种植存在的种子稀少、种苗奇缺、种质退化等严重问题，保存野生药用植物资源和基因多样性，为药用植物的可持续利用提供技术手段。

[0005] 但是，千层塔组织培养过程主要采用的是根、茎、叶。这些外植体存在外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低，外植体接种后污染和褐化现象严重，不能生长、分化和增殖等问题。

发明内容

[0006] 针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种千层塔原叶体诱导和增殖方法，该方法以孢子囊或孢子作为外植体，进行离体组织培养，为千层塔的快速繁殖建立技术基础。

[0007] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

[0008] 一种千层塔原叶体诱导和增殖方法，其特征在于，具体按以下步骤操作：

[0009] （1）外植体的选择

[0010] 从野外采集蛇足石杉的孢子囊，经自来水冲洗干净；

[0011] （2）外植体的表面灭菌

[0012] 将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数为70%的乙醇溶液中30s~60s；接着置于浓度0.1%的HgCl2溶液中浸泡5min~8min，再用无菌水冲洗3-5次，将孢子囊或者孢子囊破裂后从中散出的孢子作为千层塔原叶体诱导的外植体；

[0013] （3）原叶体的诱导培养

[0014] 将得到的外植体接种在原叶体诱导培养基上，在培养温度为22±2℃、光照时间12h/d~16h/d、光照强度为300 Lx~2000 Lx条件下培养10-12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织；

[0015] （4）原叶体的增殖

[0016] 将步骤（3）中获得的原叶体组织切割成0.2cm2~0.5cm2的小片，然后转入原叶体增殖培养基上继续培养，培养条件与步骤（3）中相同，培养6周后，获得大量的新增殖的原叶体。

[0017] 所述原叶体诱导培养基组成为：在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。

[0018] 所述原叶体增殖培养基组成为：在常规的MS培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L，以及6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2mg/L 。

[0019] 采用本发明的千层塔原叶体诱导和增殖的方法，带来的技术效果体现在以下几方面：

[0020] 1、选取千层塔[Huperzia serrata （Thunb.）Trev.]的孢子囊或孢子作为外植体，由于孢子囊或孢子与根、茎或叶片相对比，对外植体除菌较容易，因此，很容易建立千层塔的无菌组织培养体系，从而避免了外植体灭菌困难、无菌外植体获得率低，外植体接种后污染和褐化现象严重的问题。

[0021] 2、通过对孢子囊或孢子培养，比较容易获得原叶体，原叶体在人工培养基上很容易实现增殖，从而克服了传统千层塔组织培养中出现的外植体不能生长、分化和增殖等问题。

[0022] 3、通过控制光照强度很容易控制原叶体的增殖倍数，为通过原叶体进行千层塔大规模繁殖建立重要的技术基础。

具体实施方式

[0023] 以下通过发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

[0024] 实施例1：

[0025] （1）外植体的选择

[0026] 从野外采集千层塔[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]的孢子囊，经自来水冲洗干净；

[0027] （2）外植体的表面灭菌

[0028] 将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s；接着置于质量浓度0.1%的升汞（HgCl2）溶液中浸泡5-8min，再用无菌水冲洗3-5次，作为千层塔原叶体诱导的外植体；

[0029] （3）原叶体的诱导培养

[0030] 将所述外植体接种在原叶体诱导培养基上，原叶体诱导培养基组成为：在常规的MS培养基中加入3-吲哚丁酸0.2mg/L~2mg/L。在培养温度为22±2℃、光照强度为300 Lx、光照时间12h/d~16h/d条件下进行培养10-12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织，原叶体的诱导频率为70%；

[0031] （4）原叶体的增殖

[0032] 将步骤（3）中获得的原叶体组织切割成0.2-0.5cm2的小片，然后转入原叶体增殖培养基上继续培养，原叶体增殖培养基组成为：在常规的MS培养基中加入2，4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L~1mg/L和6-苄氨基嘌呤0.5mg/L~2 mg/L。培养条件与步骤（3）中相同。培养6周后，可获得大量的新增殖的原叶体，增殖倍数平均为3.5倍。

[0033] 实施例2：

[0034] （1）外植体的选择

[0035] 从野外采集千层塔[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]的孢子囊，经自来水冲洗干净；

[0036] （2）外植体的表面杀菌

[0037] 将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s；接着置于质量浓度0.1%的升汞（HgCl2）溶液中浸泡5-8min，再用无菌水冲洗3-5次，作为千层塔原叶体诱导的外植体；

[0038] （3）原叶体的诱导培养

[0039] 将外植体接种在原叶体诱导培养基上（原叶体诱导培养基的组成与实施例1相同），培养温度为22±2℃、光照强度为1500 Lx、光照时间12h/d~16h/d条件下进行培养10-12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织，原叶体的诱导频率为15%；

[0040] （4）原叶体的增殖

[0041] 将步骤（3）中获得的原叶体组织切割成0.2-0.5cm2的小片，然后转入原叶体增殖培养基上（原叶体增殖培养基的组成与实施例1相同）继续培养，培养条件与步骤（3）中相同。培养6周后，可获得大量的新增殖的原叶体，增殖倍数平均为5倍。

[0042] 实施例3：

[0043] （1） 外植体的选择

[0044] 从野外采集千层塔[Huperzia serrata（Thunb.）Trev.]的孢子囊，经自来水冲洗干净；

[0045] （2） 外植体的表面杀菌

[0046] 将洗干净的孢子囊在超净工作台中先浸在质量分数70%的乙醇溶液中30-60s；接着置于质量浓度0.1%的升汞（HgCl2）溶液中浸泡5-8min，再用无菌水冲洗3-5次。

[0047] 将灭过菌的孢子囊挤压，使孢子从孢子囊中散出，然后采用离心的方法收集孢子，作为千层塔原叶体诱导的外植体；

[0048] （3）原叶体的诱导培养

[0049] 取步骤（2）中的孢子，先用常规的MS液体培养基将孢子稀释成100个/ml悬液，将1ml孢子悬液均匀接种于原叶体诱导培养基上（原叶体诱导培养基的组成与实施例1相同），在培养温度为22±2℃、光照强度为1500 Lx、光照时间12h/d -16h/d条件下进行培养10-12周，从外植体上长出绿色的原叶体组织，原叶体的诱导频率为10%；

[0050] （4）原叶体的增殖