狗肝菜多糖的应用

摘要

本发明公开了一种狗肝菜多糖的应用。本发明研究总结了不同分子量多糖的保肝降酶活性，具体包括将分子量小于6000多糖组与总多糖组应用于制备肝损伤造成的TP升高和/或SOD酶活性降低症的药物或保健品方面；将分子量6000～10000多糖组与总多糖组应用于制备肝损伤造成的GSH-Px酶活性降低症的药物或保健品方面，等等。本发明改善了粗多糖成分复杂、含量较低的现象，总结出了多糖分子量组成与功能之间的关系，狗肝菜多糖可应用于制备保肝降酶药物方面。本发明所得产品易于溶解，同时保留了狗肝菜多糖的保肝生理活性，且得率高、含量高，制备成本低。

权利要求

1.狗肝菜多糖在制备治疗保肝药物方面的应用，其特征在于是将分子量6000以下多糖组或分子量6000～10000多糖组应用于制备治疗CCl4所致急性肝损伤药物或保健品方面；

所述分子量6000以下多糖组或分子量6000～10000多糖组通过以下制备方法制备得到：将狗肝菜植物全草或任意部位，粉碎，脱脂，无水乙醇或体积比为95%的乙醇回流提取

1～2h进行除杂；将经除杂后的狗肝菜药渣挥发尽乙醇后用适量沸水提取2次，每次1～

2h，合并提取液，常规方法减压浓缩至稠膏状，得浓缩物；

采用体积比为4∶1的氯仿-正丁醇多次萃取将上述浓缩物除去蛋白质，加体积比浓度为95％的乙醇使萃取液的醇含量达到体积比含量为80％，将含醇萃取液置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，将洗涤后的滤渣40～60℃干燥4～6h，即得狗肝菜总多糖；

取狗肝菜总多糖用水溶解，将截流分子量为6000半透膜制成透析袋，将狗肝菜总多糖水溶解液装入透析袋中加水适量，25℃进行透析，每次3～6h，透析3次，然后将3次透析液合并浓缩，往浓缩物中加入体积比浓度为95％乙醇使浓缩物的醇含量达到80％，将含醇浓缩物置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣40～60℃干燥4～6h，即得分子量低于6000狗肝菜多糖；

将上述截流分子量为6000的透析袋内剩余溶解液转移至采用截流分子量为10000的半透膜制成透析袋，加水适量，于25℃进行透析，每次3～6h，透析3次，然后将3次透析液合并浓缩，加体积比浓度为95％乙醇使浓缩物的醇含量达到80％，置于4℃冰箱中醇沉8～

12h；抽滤，滤渣40～60℃干燥4～6h，即得分子量大于6000小于10000的狗肝菜多糖。

说明书

狗肝菜多糖的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及一种狗肝菜多糖的制备方法及其在制备治疗肝损伤药物方面的应用。

背景技术

[0002] 肝损伤是肝脏受到外界因素的入侵，从而引起的肝脏受损。肝炎病毒会导致肝脏的损伤，但不是所有的肝损伤就一定是肝炎。肝损伤主要有暴力性肝损伤、病理性肝损伤、化学性肝损伤等原因所致。暴力性肝损伤表现病症明显快速严重；病理性肝损伤和化学性肝损伤比较常见，但病理性和化学性肝损伤发展较为缓慢。

[0003] 因病原体、化学药物或过量饮酒等因素导致的肝损伤患者越来越多，在我国目前所属肝损伤患者已逾千万，现代医学在干预肝损伤的治疗方面并无特异性药物。

[0004] 肝损伤的临床治疗中，一般采用综合治疗法，即保肝药物、抗病毒药及免疫增强剂通常配合治疗，保肝药物着重于肝脏的恢复，抗病毒药、免疫增强剂着重于清除体内的病毒。目前真正有效的抗病毒药寥寥无几，象拉米呋啶、泛昔洛韦等世界上刚刚上市的抗乙肝病毒药物，也无法完全抑制病毒。目前公认的抗乙肝病毒有效的免疫增强剂为干扰素，但也无法克服病毒的反跳问题。因此在病毒性肝炎的治疗技术领域中，抗病毒药、免疫增强剂及保肝药的研究都十分重要，在甲肝或毒物损伤性肝炎的治疗中尤其需要保肝药物，保肝药物市场巨大。

[0005] 狗肝菜，爵床科(Acanthaceae)植物狗肝菜Dicliptera chinensis(L.)Juss.，具有清热解毒、凉血、生津、利尿作用的功效，用于肝损伤、热病斑疹、便血、溺血、小便不利、肿毒疔疮等，主要含有机酸、糖类、氨基酸成分。已经发现，狗肝菜多糖具有保肝作用，但现有技术研究报道基本集中在狗肝菜粗多糖的研究，由于狗肝菜粗多糖成分复杂，含量较低，而且多糖结构与功能之间的关系尚不清楚，多糖的体内过程、作用机制未知，质量难以控制，造成药效重复性差，难以进入国际市场。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有狗肝菜应用的技术不足，提供一种狗肝菜不同分子量多糖的应用。

[0007] 提供一种狗肝菜多糖的制备方法，包括以下步骤：

[0008] (1)将狗肝菜全草脱脂、除杂后用水提取得水提取物；水提取物去除蛋白质后经醇沉获得狗肝菜总多糖；

[0009] 所述脱脂的方法和工艺条件是：采用有机溶剂回流提取脱脂的方法；其[0010] 中有机溶剂可以是石油醚、乙醚等，优选石油醚，用量按照药材体积来确定(能浸泡药材即可)。

[0011] 所述除杂是采用无水乙醇或体积比浓度为95％的乙醇，乙醇用量优选按照与药材体积比为1∶1确定；

[0012] 脱脂除杂后用水提取，水的用量按照脱脂、除杂后的狗肝菜全草质量∶水(体积)为1g∶5～20mL；

[0013] 所述水提取物去除蛋白质的方法和工艺条件参照本技术领域常规。

[0014] 所述醇沉是采用体积比浓度为95％的乙醇，乙醇用量参照本技术领域常规。

[0015] (2)取步骤(1)制备得到的狗肝菜总多糖，用水溶解，采用截流不同分子量透析袋，获得狗肝菜不同分子量多糖组。

[0016] 步骤(2)采用狗肝菜总多糖：1g∶1～4mL的比例加水溶解狗肝菜总多糖，[0017] 具体地，本发明将狗肝菜植物全草或任意部位，粉碎，脱脂，无水乙醇或体积比为95％的乙醇回流提取1～2h进行除杂；将经除杂后的狗肝菜药渣挥发尽乙醇后用适量沸水提取2次，每次1～2h，合并提取液，常规方法减压浓缩至稠膏状，得浓缩物；

[0018] 采用氯仿-正丁醇(4∶1，体积比)多次萃取(参照Sevage法)将上述浓缩物除去蛋白质，加体积比浓度为95％的乙醇使萃取液的醇含量达到80％(体积比含量)，将含醇萃取液置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，将洗涤后的滤渣40～60℃干燥4～6h，即得狗肝菜总多糖；

[0019] 取狗肝菜总多糖用水溶解，将截流分子量为6000半透膜制成透析袋，将狗肝菜总多糖水溶解液装入透析袋中加水适量，25℃进行透析，每次3～6h，透析3次，然后将3次透析液合并浓缩，往浓缩物中加入体积比浓度为95％乙醇使浓缩物的醇含量达到80％，将含醇浓缩物置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣40～60℃干燥4～6h，即得分子量低于6000狗肝菜多糖；

[0020] 将上述截流分子量为6000的透析袋内剩余溶解液转移至采用截流分子量为10000的半透膜制成透析袋，加水适量，于25℃进行透析，每次3～6h，透析3次，然后将3次透析液合并浓缩，加体积比浓度为95％乙醇使浓缩物的醇含量达到80％，置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣40～60℃干燥4～6h，即得分子量大于6000小于10000的狗肝菜多糖；

[0021] 将上述截流分子量为10000的透析袋内剩余溶解液转移至截流分子量为10000半透膜制成透析袋，加水适量，于25℃进行透析，每次3～6h，透析3次，将截流分子量为10000的透析袋内剩余的溶解液加体积比浓度为95％的乙醇使醇含量达到80％，置于4℃冰箱中醇沉8～12h；抽滤，滤渣40～60℃干燥4～6h，即得分子量高于10000狗肝菜多糖。

[0022] 本发明上述技术方案分别制备得到不同分子量的狗肝菜多糖。

[0023] 本发明提供了狗肝菜不同分子量多糖组在制备治疗肝损伤药物方面具有良好地应用。

[0024] 本发明制备得到的狗肝菜多糖分子量小于6000多糖组、分子量6000～10000多糖组、大于10000多糖组具有抗氧化活性，可以应用于制备预防或减轻活性氧相关性疾病的药物方面；

[0025] 各多糖给药组大鼠血清ALT、AST活性与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，其中分子量小于6000组、分子量大于10000组效果显著；

[0026] 分子量小于6000多糖组与总多糖组可显著减少由于肝损伤造成的TP升高(P＜0.05)；总多糖组与分子量小于6000多糖组可显著增强由于肝损伤造成的SOD酶活性降低(P＜0.05)；

[0027] 总多糖组与分子量6000～10000多糖组显著增强由于肝损伤造成的GSH-Px酶活性降低(P＜0.01)；各多糖给药组大鼠肝组织MDA含量与模型对照组比较明显降低(P＜0.01)，其中总多糖组、分子量小于6000组与分子量大于10000组效果显著。

[0028] 本发明研究总结得到，狗肝菜多糖可减少CCl4所致急性肝损伤，其中，对于肝脏指数，分子量大于10000组效果最优(P＜0.05)；对于脾脏指数，总多糖组效果最优，但无显著性差异；对于肾脏指数，各给药组均无显著差异。狗肝菜不同分子量多糖组可应用于制备治疗肝损伤的药物方面。

[0029] 本发明狗肝菜不同分子量多糖组配制成目的组合物的方法是本领域已知的。根据不同的需要，本发明所属领域技术书人员可以选择适当的添加物、配制方法、剂型、单位剂量等。

[0030] 本发明组合物是药物组合物时，可以含有适当的药用赋形剂、载体或者稀释剂等。可以采用制药领域公知的技术进行制剂。

[0031] 本发明药物组合物可以采用多种剂型，这往往取决于给药途径。例如，本发明不同分子量狗肝菜多糖可用于制备治疗肝损伤的药品，包括口服药和肠胃外给药用的制剂，如注射剂。

[0032] 本发明的有益效果是：

[0033] 本发明克服本技术领域现有研究的思维惯性和技术局限性，经过长期大量的实验总结和分析，采用简单的方法，突破性地采用按不同分子量多糖组份作为研究对象，与粗多糖相比，改善了粗多糖成分复杂、含量较低的现象，总结出了多糖分子量组成与功能之间的关系，有利于进一步研究多糖的体内过程、作用机制，便于对多糖质量加以控制，提高狗肝菜多糖药物的药效重复性和质量稳定性。本发明所得产品易于溶解，同时保留了狗肝菜多糖的保肝生理活性，可以更为广泛地应用于药物、保健品、或者饮料等的生产。

[0034] 本发明采用膜分离技术，显著简化制备工艺，步骤简单，原料易得，降低制备成本。

附图说明

[0035] 图1分子量小于6000多糖组实验肝脏病理变化，H.E.染色，×400

[0036] 图2分子量大于10000多糖组实验肝脏病理变化，H.E.染色，×400

[0037] 图3联苯双脂组实验肝脏病理变化，H.E.染色，×400

[0038] 图4空白组实验肝脏病理变化，H.E.染色，×400

[0039] 图5狗肝菜总多糖透析操作示意图。

具体实施方式

[0040] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明实施例采用的试剂和材料均为常规市购，采用的方法均为本技术领域常规方法。

[0041] 实施例1

[0042] 称取干燥的狗肝菜全草粗粉1kg，加入适量石油醚脱脂，无水乙醇除杂，各回流提取2小时。药渣挥尽乙醇后沸水提取2次，每次2小时，合并提取液，浓缩至800mL，氯仿-正丁醇(4∶1，体积比)多次萃取(参照Sevage法)，除去蛋白质，加体积比浓度为95％的乙醇使醇含量达到80％(体积比浓度)，于4℃冰箱中醇沉12小时。抽滤，滤渣用无水乙醇洗涤，并经50℃真空干燥4小时，即得狗肝菜总多糖，得率9％左右。

[0043] 取狗肝菜总多糖70g，用150mL纯化水溶解，将截流分子量为6000半透膜制成透析袋，将溶解液装入透析袋中加1000mL纯化水25℃进行透析，每次3小时，透析3次，然后将三次透析液合并浓缩至300mL，加95％(体积比浓度，下同)乙醇使醇含量达到80％，于4℃冰箱中醇沉12h。抽滤，滤渣经50℃真空干燥4h，即得分子量低于6000狗肝菜多糖，得率为总多糖质量的48％。

[0044] 将透析袋内剩余溶解液转移至截流分子量为10000半透膜制成透析袋，加1000mL纯化水25℃进行透析，每次3h，透析3次，然后将三次透析液合并浓缩至300mL，加95％乙醇使醇含量达到80％，于4℃冰箱中醇沉12h。抽滤，滤渣经50℃真空干燥4h，即得分子量高于6000低于10000的狗肝菜多糖，得率为总多糖质量的15％。

[0045] 将截流分子量为10000的透析袋内剩余的溶解液加95％乙醇使醇含量达到80％，于4℃冰箱中醇沉12h。抽滤，滤渣经50℃真空干燥4h，即得分子量高于10000狗肝菜多糖，得率为总多糖质量的34％。

[0046] 实施例2本发明狗肝菜不同分子量多糖组的应用实验

[0047] 雄性SD大鼠(220±20g)，由广东省实验动物中心提供(合格证号：SCXK粤2008-0002)。大鼠随机分为7组(每组10只)，保持12小时昼夜节律，控制湿度和空气流通，自由饮水摄食，实验前适应性饲养7d。

[0048] 取70只雄性SD大鼠，随机分成7组，每组10只，分别为正常对照组、肝损伤模型组、联苯双酯组、狗肝菜总多糖组、分子量小于6000狗肝菜多糖组、分子量6000～10000狗肝菜多糖组和分子量大于10000狗肝菜多糖组。正常对照组和模型组每天灌胃给予注射用水，受试药和阳性对照组的动物每天根据剂量灌胃给药，剂量：联苯三酯：150mg/kg；分子量＜6000组：500mg/kg；分子量6000～10000组：150mg/kg；分子量＞10000组：300mg/kg。在给药的第7天，除正常对照组外，其余各组动物均灌胃0.1％CCl4花生油(0.01mL/g)，禁食不禁水16h，全部大鼠麻醉后腹主动脉取血，3000转离心15min，分离出血清，-20℃保存至分析ALT、AST、TP生化指标。采血后迅速取出肝脏、肾脏、脾脏，用冰冷的盐水立即删除尽可能多的血，称重，计算绝对和相对脏器指数(脏器指数＝脏器重量/体重(mg/g))，并在同一肝小叶上取1.00g肝组织匀浆，离心，取上清液，-20℃保存至分析。同时取同一肝小叶上取一小块做病理组织检查。实验结果见表1所示：

[0049] 表1狗肝菜多糖对血清ALT、AST及TP水平的影响(n＝10)

[0050]

[0051] p值：a p＜0.01，模型组与空白组比较；

[0052] b p＜0.05，模型组与空白组比较；

[0053] c p＜0.01，模型组与阳性药及给药组比较；

[0054] d p＜0.05，模型组与阳性药及给药组比较；

[0055] e p＜0.01，各组多糖组与阳性药组比较；

[0056] f p＜0.05各组多糖组与阳性药组比较

[0057] 表1所示的实验结果表明，肝损伤模型组与空白对照组比较差异显著，说明本实验模型成功。与模型组相比较，阳性对照组能非常明显的抑制ALT、AST活性(P＜0.01)，显著减少由于肝损伤造成的TP升高(P＜0.05)。各多糖给药组大鼠血清ALT、AST活性与模型对照组比较明显降低，相比较均有显著性差异(P＜0.01)，说明狗肝菜多糖各部位均可抑制四氯化碳所致急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST活性的升高，其中分子量＜6000多糖组效果最显著，其效果接近阳性药物联苯双酯滴丸，比总多糖效果好。

[0058] 各组对于肝损伤大鼠血清总蛋白TP的影响不尽相同。其中分子量＜6000多糖组与总多糖组可显著减少由于肝损伤造成的TP升高，且分子量＜6000多糖组效果(P＜0.01)优于总多糖组(P＜0.05)及阳性药物组(P＜0.05)。虽然效果不显著，分子量6000～10000多糖组与分子量＞10000多糖组也可减少由于肝损伤造成的TP升高。

[0059] 实施例3本发明狗肝菜不同分子量多糖组的应用实验

[0060] 实验方法同实施例2。实验结果见表2所示：

[0061] 表2狗肝菜多糖各部位对肝组织酶的影响(n＝10)

[0062]

[0063] p值：同实施例2。

[0064] 表2所示的实验结果表明，肝损伤模型组与空白对照组比较差异显著，说明实验模型成功。与模型组相比较，阳性对照药显著增强由于肝损伤造成的SOD、GSH-Px酶活性降低(P＜0.01)。

[0065] 对于SOD酶活性，总多糖组显著增强由于肝损伤造成的SOD酶活性降低(P＜0.01)，效果优于阳性药联苯双酯滴丸组；分子量＜6000多糖组也可显著增强由于肝损伤造成的SOD酶活性降低(P＜0.05)，但其效果不及阳性药组与总多糖组。分子量6000～10000多糖组与分子量＞10000多糖组效果与模型组比较则无显著性差异。

[0066] 对于GSH-Px酶活性，总多糖组与分子量6000～10000多糖组显著增强由于肝损伤造成的GSH-Px酶活性降低(P＜0.01)，效果可媲美阳性药联苯双酯滴丸组。分子量小于6000多糖组与分子量＞10000多糖组对此酶活性影响不显著。与模型组相比较，阳性对照药能非常明显的抑制MDA活性(P＜0.01)。各多糖给药组大鼠肝组织中MDA含量与模型对照组比较明显降低，相比较均有显著性差异，其中总多糖组、分子量＜6000多糖组与分子量＞10000多糖组效果优于阳性药联苯双酯滴丸组，总多糖组效果最优(P＜0.01)。

[0067] 实施例4本发明狗肝菜不同分子量多糖组的应用实验

[0068] 实验方法同实施例2。实验结果见附图1～4所示(H.E.染色，原始放大倍数为400)：

[0069] 经组织病理学检验发现CCl4引起了肝脏的严重损伤。主要表现为肝脏正常结构被破坏，肝窦和中央静脉淤血，中央静脉周围肝索排列紊乱，肝细胞脂肪变性和坏死，并血管周围炎性细胞浸润。故表明CCl4肝损伤模型造模成功。狗肝菜多糖对CCl4引起的肝脏损伤有不同程度的改善作用。主要表现在肝脏正常结构恢复，肝索排列整齐，肝细胞变性和坏死现象减少，而且炎性细胞浸润也减轻。不同分子量狗肝菜多糖对CCl4引起的肝损伤改善作用有所差异。而联苯双脂对CCl4引起的肝损伤的保护作用极微。不同分子量狗肝菜多糖及联苯双脂对CCl4引起的肝损伤保护作用从效果好到差依次为空白组＞分子量6000以下多糖组≥分子量6000～10000多糖组＞总多糖组≥分子量10000以上多糖组＞联苯双脂组＞模型组。