穗花杉双黄酮的应用

摘要

一种中药技术领域的穗花杉双黄酮的应用，通过乙醇对原药材进行提取后，依次经萃取、硅胶柱层析以及葡聚糖凝胶LH-20柱层析精制得到，该穗花杉双黄酮可用于制备治疗骨质疏松的药物和食品。

权利要求

1.一种纯度大于95%的穗花杉双黄酮的制备方法，其特征在于，通过乙醇对干燥的杉木枝叶或卷柏枝叶以75%乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩后用石油醚超声脱脂；

或采用70%乙醇在70℃加热回流提取1h，提取3次，合并提取液，减压浓缩后用石油醚超声脱脂，得到提取液，用乙酸乙酯进行萃取，然后将萃取液减压、浓缩、干燥后得粗提取物、采用乙酸乙酯粗提取物经硅胶柱层析并进行梯度洗脱，用TLC跟踪检测、合并后浓缩干燥，最后将硅胶柱层析得到的产物用甲醇溶解，加入以Sephadex LH-20为吸附剂的层析柱吸附，用甲醇洗脱，收集黄色色带并浓缩干燥得到。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的硅胶的粒度为200-300目。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的梯度洗脱是指：采用体积比为

50:1～30:1的二氯甲烷与甲醇的混合液、采用体积比为45:1～25:1的三氯甲烷-甲醇的混合液或采用体积比为55:1～35:1乙酸乙酯-甲醇的混合液进行梯度洗脱。

4.一种根据权利要求1-3中任一所述方法制备得到的穗花杉双黄酮的应用，其特征在于，用于制备防治骨质疏松的药物和食品。

说明书

穗花杉双黄酮的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及的是一种中药应用技术领域的方法，具体是一种穗花杉双黄酮的应用。

背景技术

[0002] 骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构的破坏为特征，导致骨脆性增加和易于发生骨折的代谢性骨病。该病多发于老人和绝经后妇女，随着老龄化社会的到来，该病发病率逐年上升，我国的骨质疏松患者约有9000万人，抗骨质疏松药物具有十分广阔的市场前景，该适应症药物的研发是新药研发的热点之一。

[0003] 现有研究表明，骨质疏松发病的机制在于骨的形成过程中，以清除受损碎片，形成骨洞为主要作用的破骨细胞和以沉积钙质，填充骨洞为主要作用的成骨细胞相互协调，使骨质的形成与溶解处于一种动态平衡，维持骨质的不断更新。当此动态平衡被打破，骨溶解超过骨形成时，即导致骨质疏松。因此，任何能够直接或间接作用于成骨细胞和或破骨细胞，有助于保持其动态平衡的物质，均可能有助于防治骨质疏松。现在市场上治疗骨质疏松的药物也都是通过这两个方面发挥作用的，如雌激素、钙制剂和双磷酸盐类等药物。

[0004] 穗花杉双黄酮(Amentoflavone)，其结构式如下：

[0005] 主要分布于裸子植物中，如卷柏(Selaginella tamariscina)、杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.]等，具有清除体内自由基的作用，对溶血性磷脂酰胆碱(LPC)引起的血管内皮细胞损伤有抑制作用，能抑制α-葡萄糖苷酶，降血糖和调血脂，对卵巢癌细胞、肠癌细胞、胃腺癌细胞和肝癌细胞有杀害作用。

发明内容

[0006] 本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种穗花杉双黄酮的应用，可从卷柏、杉木等多种植物中提取得到，也可应用现有技术中已公开的人工合成的方法获得；经系列体内和体外药理研究，为开拓穗花杉双黄酮防治骨质疏松的新用途提供依了科学依据。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0008] 本发明涉及一种纯度大于95％的穗花杉双黄酮的制备方法，粉碎后的原药材枝叶用乙醇提取后，提取液依次经溶剂萃取、硅胶柱层析，最后通过葡聚糖凝胶LH-20为吸附剂的层析柱精制得到。

[0009] 所述的原药材是指：干燥的杉木枝叶或卷柏枝叶；

[0010] 所述的提取是指：以75％乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩后用石油醚超声脱脂；或采用70％乙醇在70℃加热回流提取1h，提取3次，合并提取液，减压浓缩后用石油醚超声脱脂。

[0011] 所述的萃取是指：用乙酸乙酯进行萃取，然后将萃取液减压、浓缩、干燥后得粗提取物。

[0012] 所述的硅胶柱层析是指：采用乙酸乙酯粗提取物经硅胶柱层析并进行梯度洗脱，用TLC跟踪检测、合并后浓缩干燥。

[0013] 所述的硅胶的粒度为200-300目；

[0014] 所述的以葡聚糖凝胶LH-20为吸附剂的层析柱吸附是指：将硅胶柱层析得到的产物用甲醇溶解，加入以Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶LH-20)为吸附剂的层析柱吸附，将Sephadex LH-20层析柱用甲醇洗脱，收集黄色色带。

[0015] 所述的梯度洗脱是指：采用体积比为50∶1～30∶1的二氯甲烷与甲醇的混合液、采用体积比为45∶1～25∶1的三氯甲烷-甲醇的混合液或采用体积比为55∶1～35∶1乙酸乙酯-甲醇的混合液进行梯度洗脱。

[0016] 所述的收集洗脱流分回收溶剂是指：在用穗花杉双黄酮标准品进行比照的条件下采用TLC跟踪检查，合并相同的黄色斑点洗脱流分；然后将合并的相同黄色斑点洗脱流分回收溶剂，得黄色固体粉末，即纯度大于95％的穗花杉双黄酮。

[0017] 本发明涉及上述穗花杉双黄酮的应用，用于制备治疗骨质疏松的药物和食品。

[0018] 本发明的优势和积极效果在于通过体外、体内药理研究发现并证明穗花杉双黄酮具有雌激素样作用，可显著提高维甲酸造成的骨质疏松大鼠的体重、死亡率、股骨压碎值、骨钙含量及骨磷含量，对于骨质疏松具有显著的预防和治疗作用，有望将其开发成为防治骨质疏松的药物。穗花杉双黄酮制备简便，成本低廉，本发明随后的体内、体外药理实验证明，用其制备抗骨质疏松的药物或食品，市场前景广阔，蕴藏着巨大的社会和经济效益。

附图说明

[0019] 图1为实施例效果示意图。

具体实施方式

[0020] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0021] 实施例1(穗花杉双黄酮的制备)

[0022] 收集干燥杉木枝叶5kg，以75％乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩，用石油醚超声脱脂后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压，浓缩，干燥，得粗提取物。乙酸乙酯粗提取物经硅胶柱层析(粒度200-300目)，二氯甲烷-甲醇(50∶1～30∶1)梯度洗脱，用TLC跟踪检测、合并，浓缩干燥。干燥物甲醇溶解，加入以Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶LH-20)为吸附剂的层析柱吸附，将Sephadex LH-20层析柱用甲醇洗脱，收集LH-20的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查(用穗花杉双黄酮标准品进行比照)，合并相同的黄色斑点洗脱流分。将合并的相同黄色斑点洗脱流分回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮，经HPLC检测，纯度大于95％，用于随后的体内、体外药理实验。

[0023] 实施例2

[0024] 收集干燥杉木枝叶5kg，以50％乙醇超声提取3次，合并提取液，减压浓缩，用石油醚超声脱脂后，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压，浓缩，干燥，得粗提取物。乙酸乙酯粗提取物经硅胶柱层析(粒度200-300目)，三氯甲烷-甲醇(45∶1～25∶1)梯度洗脱，用TLC跟踪检测、合并，浓缩干燥。干燥物甲醇溶解，加入以Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶LH-20)为吸附剂的层析柱吸附，将Sephadex LH-20层析柱用甲醇洗脱，收集LH-20的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查(用穗花杉双黄酮标准品进行比照)，合并相同的黄色斑点洗脱流分。将合并的相同黄色斑点洗脱流分回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮，经HPLC检测，纯度大于95％，用于随后的体内、体外药理实验。

[0025] 实施例3

[0026] 收集干燥卷柏枝叶5kg，以70％乙醇35L，70℃加热回流提取1h，提取3次，合并提取液，减压浓缩，用石油醚超声脱脂后，再用乙酸乙酯萃取，液减压，浓缩，干燥，得粗提取物，乙酸乙酯粗提取物经硅胶柱层析(粒度200-300目)，乙酸乙酯-甲醇(55∶1～35∶1)梯度洗脱，用TLC跟踪检测、合并，浓缩干燥。干燥物甲醇溶解，加入以Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶LH-20)为吸附剂的层析柱吸附，将Sephadex LH-20层析柱用甲醇洗脱，收集LH-20的黄色色带，直至完全。采用TLC跟踪检查(用穗花杉双黄酮标准品进行比照)，合并相同的黄色斑点洗脱流分。将合并的相同黄色斑点洗脱流分回收溶剂，得黄色固体粉末，即穗花杉双黄酮，经HPLC检测，纯度大于95％，用于随后的体内、体外药理实验。

[0027] 实施例4(穗花杉双黄酮对成骨肉瘤细胞MG-63-PERE的作用)

[0028] 细胞：中国人民解放军第二军医大学药学院提供的稳定转染以雌激素反应原件为启动子以萤火虫荧光素酶为报告基因的成骨肉瘤细胞MG-63-PERE。

[0029] 实施过程：在96孔板上以5000个细胞每孔铺板，细胞贴壁后，加药(DMSO浓度＜2％)，在培养箱中培养6小时后去除上层液，冰冷PBS清洗，每孔加入20μl细胞裂解液待用。

[0030] 检测方法：在化学发光检测仪上测量，使用双报告基因检测系统，先测量萤火虫荧光素酶的发光量，接着淬灭，测量内标海肾荧光素酶的发光量。

[0031] 实施结果：结果以萤火虫荧光素酶量/海肾荧光素酶量的百分数来表示：效果(％)＝样品组发光量/本底发光量×100％。

[0032] 根据数据分析，结果＞150％可视为有雌激素样作用，即对抗骨质疏松的作用。

[0033] 表1 穗花杉双黄酮对成骨肉瘤细胞MG-63-PERE的影响

[0034]

[0035] 实施例5(穗花杉双黄酮对维甲酸造成的大鼠骨质疏松的防治作用)[0036] 1.实验材料

[0037] 1.1.动物

[0038] SD大鼠，上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司提供。

[0039] 1.2.药物

[0040] 依普黄酮，上海信谊康捷药业有限公司(批号：100101)，取依普黄酮片3片，研碎之后加入0.5％ CMC-Na溶液至30ml，备用；

[0041] 维甲酸，郑州荔诺生物科技有限公司(批号：100822)，精确称取维甲酸3.0g，加0.5％CMC-Na溶液至200ml，得15mg/ml溶液，备用；

[0042] 穗花杉双黄酮，由实施例1制备，精确称取150mg，加DMSO 2.25ml，再加入0.5％ CMC-Na溶液至22.5ml，备用。

[0043] CMC-Na，二甲基亚砜，国药集团上海化学试剂有限公司产品。

[0044] 1.3.仪器

[0045] 赛多利斯BSA223S电子天平，赛多利斯BS2202S电子天平，YLS-16A小动物骨骼强度测定仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)，752N型紫外可见分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)。

[0046] 2.方法与结果

[0047] 2.1.对实验性骨质疏松症的预防作用

[0048] 健康雌性SD大鼠32只，按体重分层后随机分为4组，分别为正常对照组(n＝5)，模型组(n＝10)，阳性对照依普黄酮组(100mg/kg，n＝11)，穗花杉双黄酮组(3mg/kg，n＝6)。实验开始后，每天上午灌胃给予维甲酸75mg/kg(5ml/kg)，正常组给予等体积维甲酸溶剂(0.5％CMC-Na)，下午给予受试样品(正常组和模型组给予受试样品溶剂)，连续2周。

[0049] 实施效果：取动物的左侧股骨使用小动物骨骼强度测定仪测定股骨的生物力学性能(最大载荷、骨结构强度测试)，每个样本放置在仪器上的位置及方向保持一致；测定完毕后收集残骨，用生理盐水浸泡的湿纱布包裹，密封后于-20°保存供测定骨钙和骨磷。测定前将股骨从冰箱中取出室温自然解冻，烘箱中120℃烘烤12h，称骨干重(W1)，再将骨置于600℃马福炉灰化3h，使骨呈白色块状，并称骨灰重(W2)。再将充分研磨的骨灰(0.1g)溶于过量(4ml)的3％ HNO3中，充分提取(放置2天并摇匀)，测定骨中钙、磷含量。右侧股骨以10％福尔马林溶液固定，保存，以备行病理学检查。

[0050] 表2 穗花杉双黄酮对骨质疏松大鼠生物力学性能及骨钙、骨磷的影响[0051]

[0052] #p＜0.1，##p＜0.05，###p＜0.01与正常组比较

[0053] ＊p＜0.1，＊＊p＜0.05，＊＊＊p＜0.01与模型组比较

[0054] 由表2和图1可见，穗花杉双黄酮组大鼠的体重、存活率、股骨压碎值、骨钙含量及骨磷含量均明显高于模型组，表明穗花杉双黄酮对骨质疏松症具有显著的预防作用。

[0055] 综上，穗花杉双黄酮的制备方法简单，成本低廉，防治骨质疏松症效果显著，无毒副作用，因而可用于制备防治骨质疏松症的药物或食品。