四氢吡啶并吡喃衍生物、其制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种四氢吡啶并吡喃衍生物及其制备方法。该方法是将取代胺(a)与丙烯酸甲酯经过Michael加成反应制成N，N-双(β-丙酸甲酯)取代胺(b)，(b)在醇钠作用下发生Dieckmann缩合，和酸作用下水解脱羧得到N-取代哌啶-4-酮(d)，(d)的两个活泼亚甲基与两分子芳香醛进行反应脱去两分子水得到N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)；(e)和丙二氰在正丁醇中回流加热即得通式为(I)的最终产物。本发明工艺简单、便于规模生产，所得产物对白血病K562、卵巢癌HO-8910及肝癌SMMC-7721细胞的增殖有很好的抑制作用。

权利要求

1.式（Ⅰ）所示四氢吡啶并吡喃衍生物：

其中，R1为甲基、甲氧基、氟、溴中的一种；

R2为4位单取代的苯基，所述取代基为甲基、氟中的一种。

2.权利要求1所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：基本步骤如下：（1）将取代胺(a)与丙烯酸甲酯经过Michael加成反应制成N,N-双（β-丙酸甲酯）取代胺(b)；

（2）将步骤（1）产物N,N-双（β-丙酸甲酯）取代胺（b），在醇钠作用下发生Dieckmann缩合，和酸作用下水解脱羧得到N-取代哌啶-4-酮(d)；

（3）N-取代哌啶-4-酮(d)的两个活泼亚甲基与两分子芳香醛进行反应脱去两分子水得到N-取代-3,5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)；

（4）将N-取代-3,5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)和丙二氰在正丁醇中回流加热即得通式为（Ⅰ）的最终产物。

3.根据权利要求2所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）反应中的溶剂为C1-C4的醇。

4.根据权利要求3所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇。

5.根据权利要求2所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述醇钠选自甲醇钠或乙醇钠中的一种。

6.根据权利要求2所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述醇钠为甲醇钠。

7.根据权利要求2所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）还加入氢氧化钠或氢氧化钾做碱。

8.根据权利要求7所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：所述氢氧化钠为8-15%质量浓度的氢氧化钠。

9.根据权利要求2所述的四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中回流时间为5h-6h。

10.权利要求1所述化合物在制备用于抑制白血病K562、卵巢癌HO-8910及肝癌SMMC-7721细胞的增殖活性的药物中的应用。

说明书

四氢吡啶并吡喃衍生物、其制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种吡啶并吡喃衍生物，具体涉及一类能有效抑制白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞增殖的四氢吡啶并吡喃衍生物及其制备方法。

背景技术

[0002] 白血病、卵巢癌及肝癌是发病率很高的三大常见恶性肿瘤，因此，设计研发能够有效地抑制白血病、卵巢癌及肝癌细胞增殖，使其迅速凋亡的药物具有重大的意义。

[0003] 白血病是一类造血干细胞克隆性疾病。好发于青少年，其发病率排在青少年肿瘤的第一位，所以对人类的危害更为明显和突出。慢性白血病，是临床上起病及发展相对缓慢的白血病，分为慢性髓细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病。慢性髓细胞性白血病中的细胞系K562，因为其自身凋亡的抵抗力比其他细胞系强，因此在白血病的治疗过程中，抑制K562细胞的增殖是非常重要的手段。由于现有技术没有理想的高效抑制K562细胞增殖的药物，慢性髓细胞性白血病难以治愈。因此发明一种具有高效抑制白血病K562细胞增殖活性的新药先导化合物是十分必要的。

[0004] 卵巢癌是女性最常见的肿瘤之一，卵巢癌发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。因此研发有效治疗卵巢癌细胞增殖的药物已成为药物创制和研发领域中研究的热点之一。

[0005] 肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤。肝癌中的细胞系SMMC-7721，其抵抗凋亡的能力比其他肝癌细胞系强，因此发明一种具有高效抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖活性的新药先导化合物是治愈肝癌的关键所在。

发明内容

[0006] 因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种可以同时抑制白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖的四氢吡啶并吡喃衍生物。同时提供该衍生物的制备方法以及应用。

[0007] 本发明的技术方案是：式(I)所示四氢吡啶并吡喃衍生物：

[0008]

[0009] 其中，R1为甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、等烃基或烃氧基、氟氯、溴中的一种；

[0010] R2为2，3，4位单取代或二取代的苯基，所述取代基为甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、氟、溴、氯、硝基、羧基、氰基、酯基中的一种。

[0011] 本发明还提供了上述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，基本步骤如下：

[0012] (1)将取代胺(a)与丙烯酸甲酯经过Michael加成反应制成N，N-双(β-丙酸甲酯)取代胺(b)；

[0013]

[0014] (2)将步骤(1)产物N，N-双(β-丙酸甲酯)取代胺(b)，在醇钠作用下发生Dieckmann缩合，和酸作用下水解脱羧得到N-取代哌啶-4-酮(d)；

[0015] (3)N-取代哌啶-4-酮(d)的两个活泼亚甲基与两分子芳香醛进行反应脱去两分子水得到N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)；

[0016]

[0017] (4)将N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)和丙二氰在正丁醇中回流加热即得通式为(I)的最终产物。

[0018] 上述N，N-双(β-丙酸甲酯)取代胺(b)和N-取代哌啶-4-酮(d)都为黄色油状物。

[0019] 根据本发明所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，较好的是，步骤(1)所述反应中的溶剂为C1-C4的醇。

[0020] 进一步地，步骤(1)所述溶剂更优选的为甲醇。

[0021] 优选的是，步骤(2)所述醇钠选自甲醇钠或乙醇钠中的一种。在水解脱羧反应中，可以优选采用质量分数25％的盐酸溶液水解脱羧。

[0022] 更优选的是，步骤(2)所述醇钠为甲醇钠。

[0023] 根据本发明所述四氢吡啶并吡喃衍生物的制备方法，较好的是，步骤(3)所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾。步骤(3)可以采用甲醇或无水乙醇为溶剂。

[0024] 进一步地，所述氢氧化钠质量浓度为8-15％。更优选地是，质量浓度为10％。

[0025] 优选的NaOH溶液浓度可以使合成N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)的反应条件得到优化，不仅降低了成本，使后处理方便，而且起到了缩短反应时间的作用。采用无水乙醇为溶剂，常温搅拌下0.5h～2h即得。

[0026] 优选的是，步骤(4)中回流时间为5h-6h。步骤(4)中采用正丁醇为溶剂，在正丁醇中回流加热，反应温度为一般120℃。该反应温度与正丁醇的沸点有关，温度略有浮动。

[0027] 上述制备过程的反应式为：

[0028]

[0029] 本发明还提供了上述化合物在抑制白血病K562、卵巢癌HO-8910及肝癌SMMC-7721细胞的增殖活性中的应用。

[0030] 本发明制备的四氢吡啶并吡喃衍生物，经测定能有效抑制白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖。IC50均值低于抗癌药5-氟尿嘧啶，具有潜在的实用性。

[0031] 本发明的技术要点在于：

[0032] 本发明制备方法步骤(1)中合成N，N-双(β-丙酸甲酯)取代胺(b)采用甲醇作为溶剂，通过搅拌使反应在均相体系中进行，由于回流温度低，减少了高温副反应的发生，大大加快了反应进程。

[0033] 本发明制备方法步骤(2)中合成N-取代-4-哌啶酮(d)采用甲醇钠作为缩合剂，用质量分数为25％的盐酸溶液将环合产物提取，令其进入水相后水解脱羧。

[0034] 本发明制备方法步骤(3)合成N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮(e)用NaOH溶液作催化剂，采用无水乙醇为溶剂，常温搅拌下0.5h～2h得到。

[0035] 本发明步骤(4)中采用正丁醇为溶剂，120℃条件下回流5h-6h制得产物(I)。

[0036] 本发明以取代胺和丙烯酸甲酯为原料，经过Michael加成，Dieckmann缩合，水解脱羧等反应合成中间体N-取代哌啶-4-酮(d)，再将N-取代哌啶-4-酮(d)与两分子芳香醛发生反应脱去两分子水得相应N-取代-3，5-双苄叉基哌啶-4-酮类化合物(e)，然后与丙二氰反应得到最终产物四氢吡啶并吡喃衍生物(I)。本发明测定了该新药先导化合物对白血病K562癌细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的抑制活性，在现代医药生产中具有显著的实用性。

[0037] 本发明的有益效果是：

[0038] 1、本发明四氢吡啶并吡喃衍生物(I)对白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有较高的抑制活性。

[0039] 2、本发明方法工艺简单，生产容易。

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。

[0041] 四氢吡啶并吡喃衍生物(I)，能有效抑制白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞的增殖，通式为：

[0042]

[0043] 其中：R1为甲基、甲氧基、乙基、乙氧基、等烃基或烃氧基、氟氯、溴中的一种；

[0044] R2为2，3，4位单取代或二取代的苯基，取代基为甲基、乙基等烷基，甲氧基、乙氧基等烷氧基，氟、溴、氯、硝基、羧基、氰基、酯基等中的一种。

[0045] 本发明实施例制备的四氢吡啶并吡喃衍生物(I)，具有高效抑制白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞增殖的医药先导化合物是：

[0046] (Ia)6-(4-甲苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0047] (Ib)6-(4-甲苄基)-4-(2-氯苯基)-8-(2-氯苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0048] (Ic)6-(4-氟苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0049] (Id)6-(4-氟苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0050] (Ie)6-(4-甲氧苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0051] (If)6-(4-甲氧苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0052] (Ig)6-(4-溴苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0053] (Ih)6-(4-溴苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃

[0054] 实施例1：制备6-(4-甲苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ia)

[0055] 室温下，向100mL三颈瓶中加入0.16mol丙烯酸甲酯和7mL甲醇，搅拌下将0.04mol对甲基苄胺(1a)和4mL甲醇的混合液慢慢加入三颈瓶中，温度自然上升，混合液的滴加速度控制在4mL/min以内，使反应体系温度不超过50℃。滴加完毕后，室温下搅拌
20min，再加热回流8h，回流温度为63℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，回收甲醇和未反应的丙烯酸甲酯，减压蒸馏，得到浅黄色油状液体N，N-双(β-丙酸甲酯)对甲苄胺(2a)。

[0056] 向250mL干燥的三颈瓶中加入15mL无水甲苯、0.122mol金属钠搅拌加热回流。待钠熔融后加入0.2mL无水甲醇，然后慢慢滴加0.04mol N，N-双(β-丙酸甲酯))对甲苄胺(2a)和20mL无水甲苯混合液。待滴加完毕后，回流6h。回流过程中，反应体系逐渐变得粘稠，需加大搅拌速度，并将20mL无水甲苯分批加入到反应容器中。反应结束后冷却至室温，加入10ml甲醇除去未反应完的Na，将混合物用120mL 25％(质量分数)的盐酸溶液提取，油浴回流6h。冷却反应混合物，搅拌下加入浓NaOH溶液中和至pH＝8.5，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，蒸馏回收乙酸乙酯，减压蒸馏剩余物质，得到淡黄色油状液体N-对甲基苄基哌啶-4-酮(4a)。

[0057] 在50ml的圆底烧瓶中加入N-对甲基苄基哌啶-4-酮(4a)(0.005mol)和对氟苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对甲基苄基-3，5-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5a)。向25ml圆底瓶加入N-对甲基苄基-双苄叉基-4-哌啶酮(5a)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)，正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ia)。

[0058] Yield：82 ％；white solid，mp 85-87 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ7.122-7.226(m，J，4H)，7.001-7.061(m，8H)，6.870(s，1H)，4.571(s，2H)，3.97(s，1H)，3.46-3.52(m，4H)，2.32(s，3H)，1.58(s，2H)；IR(KBr)：3500，3400，3085，3030，3020，2970，
2865，2245，1670，1450，960，985，1050，850，630cm-1；Anal.calcd.for C30H25F2N3O C ％
74.83，H％5.32，N％8.73；Found：C％74.65，H％5.43，N％8.67。

[0059] 实施例2：制备6-(4-甲苄基)-4-(2-氯苯基)-8-(2-氯苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ib)

[0060] 同实施例1的制备方法，在相同条件下得到N-对甲苄基哌啶-4-酮(4a)。

[0061] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对甲苄基哌啶-4-酮(4a)(0.005mol)和邻氯苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对甲苄基-3，5-双邻氯苄叉基-4-哌啶酮(5b)。向25ml圆底瓶加入N-对甲基苄基-双邻氯苄叉基-4-哌啶酮(5b)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ib)。

[0062] Yield：80 ％；light yellow solid，mp 96-98 ℃；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.30-7.45(m，4H)，7.19-7.25(m，2H)，7.13(s，2H)，6.94(s，2H)，4.64(s，2H)3.55-3.59(m，1H)3.18-3.44(m，4H)2.30(s，3H)，1.51(dJ ＝ 1.60HZ，2H)；IR(KBr)：
3510，3420，3085，3015，2960，2850，2250，1685，1450，960，990，840，650cm-1；Anal.calcd.ForC30H25Cl2N3O C％ 70.04，H％ 4.90，N％ 8.17；Found：C％69.98，H％4.79，N％8.23。

[0063] 实施例3：制备6-(4-氟苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ic)

[0064] 同实施例1的制备方法，把对甲基苄胺换成对氟苄胺(1c)，在相同条件下得到N-对氟苄基哌啶-4-酮(4c)。

[0065] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对氟苄基哌啶-4-酮(4c)(0.005mol)和对氟苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对氟苄基-3，5-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5c)。向25ml圆底瓶加入N-对氟苄基-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5c)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ic)。

[0066] Yield：85 ％；white solid，mp 89-91 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ7.30-7.32(d，J＝8.34Hz，2H)，7.14-7.18(m，2H)，7.06-7.10(m，2H)，6.92-6.98(m，6H)，6.85(s，1H)4.57(s，2H)，3.93(s，1H)，3.35-3.43(m，4H)，1.20-1.23(t，J ＝ 7.30Hz2H)；
IR(KBr)：3520，3465，3080，3030，3015，2950，2850，2245，1675，1400，1050，950，925，
630cm-1；Anal.calcd.for C29H22F3N3OC％71.74，H％4.57，N％8.66；Found：C％71.67，H％4.43，N％8.77。

[0067] 实施例4：制备6-(4-氟苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Id)

[0068] 同实施例1的制备方法，把对甲基苄胺换成对氟苄胺(1c)，在相同条件下得到N-对氟苄基哌啶-4-酮(4c)。

[0069] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对氟苄基哌啶-4-酮(4c)(0.005mol)和对甲基苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对氟苄基-3，5-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5d)。向25ml圆底瓶加入N-对氟苄基-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5d)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Id)[0070] Yield：78 ％；white solid，mp 110-112 ℃；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.29-7.31(m，2H)7.03-7.12(m，8H)，6.93-6.95(m，2H)6.84(s，1H)，4.52(s，2H)，3.87(s，1H)，3.13-3.32(m，4H)，2.34(s，6H)，1.22(d，J＝9.20Hz，2H)；IR(KBr)：3450，3300，3085，
3020，2960，2870，2245，1650，1450，1050，970，950，640cm-1；Anal.calcd.for C31H29FN3O C％77.96，H％5.91，N％8.80；Found：C％77.81，H％5.84，N％8.99。

[0071] 实施例5：制备6-(4-甲氧苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ie)

[0072] 同实施例1的制备方法，把对甲苄胺换成对甲氧苄胺(1e)，在相同条件下得到N-对甲氧基苄基哌啶-4-酮(4e)。

[0073] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对甲氧苄基哌啶-4-酮(4e)(0.005mol)和对氟苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对甲氧基苄基-3，5-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5e)。向25ml圆底瓶加入N-对甲氧基苄基-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5e)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ie)。

[0074] Yield：72％；white solid，mp 97-99℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ7.19-7.22(m，2H)7.13-7.16(m，2H)7.01-7.06(m，6H)6.87(s，1H)6.75-6.77(d，J ＝ 8.60Hz，2H)4.58(s，
2H)3.97(s，1H)3.79(s，3H)3.40-3.49(m，4H)，1.25-1.28(m，2H)；IR(KBr)：3650，3450，
3020，3015，2975，2875，2230，1650，1450，1070，960，920，650cm-1；Anal.calcd.for C30H25F2N3O2C％ 72.42，H％5.06，N％8.45；Found：C％72.24，H％5.14，N％8.40。

[0075] 实施例6：制备6-(4-甲氧苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(If)

[0076] 由实施例5的制备方法得到的N-对甲氧苄基哌啶-4-酮(4e)。

[0077] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对甲氧苄基哌啶-4-酮(4e)(0.005mol)和对甲基苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对甲氧基苄基-3，5-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5f)。向25ml圆底瓶加入N-对甲氧基苄基-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5f)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(If)。

[0078] Yield：84％；white solid，mp 83-85℃；1H NMR (400MHz，CDCl3)δ7.02-7.14(m，10H)，6.88(s，1H)6.74-6.76(d，J ＝ 6.90Hz，2H)4.54(s，2H)3.92(s，1H)，3.78(s，
3H)3.37-3.51(m，4H)2.37(s，6H)1.50(d，J ＝ 78.0Hz2H)；IR(KBr)：3600，3450，3080，
3045，3020，2975，2865，2245，1670，1420，1050，950，920，640cm-1；Anal.calcd.for C32H31N3O2C％78.50，H％6.38，N％8.58；Found：C％78.23，H％6.21，N％8.49。

[0079] 实施例7：制备6-(4-溴苄基)-4-(4-氟苯基)-8-(4-氟苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ig)

[0080] 同实施例1的制备方法，把对甲基苄胺换成对溴苄胺(1g)，在相同条件下得到N-对溴苄基哌啶-4-酮(4g)。

[0081] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对溴苄基哌啶-4-酮(4g)(0.005mol)和对氟苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对溴基苄基-3，5-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5g)。向25ml圆底瓶加入N-对溴基苄基-双对氟苄叉基-4-哌啶酮(5g)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ig)。

[0082] Yield：78 ％；white solid，mp 103-105 ℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ7.34-7.36(d，J ＝ 8.30Hz，2H)7.18-7.22(m，2H)7.11-7.15(m，2H)6.70-7.06(m，6H)6.88(s，1H)4.61(s，2H)3.96(s，1H)3.39-3.49(m，4H)1.24-1.28(t，J ＝ 7.0Hz，2H)；
IR(KBr)：3500，3450，3070，3040，3025，2950，2870，2245，1620，1430，1050，960，920，
640cm-1；Anal.calcd.for C29H22BrF2N3O C％63.75，H％4.06，N％7.69；Found：C％
63.50，H％4.15，N％7.56。

[0083] 实施例8：制备6-(4-溴苄基)-4-(4-甲苯基)-8-(4-甲苄叉基)-3-氰基-2-氨基-1，2，5，6-四氢吡啶并[4，3-b]吡喃(Ih)

[0084] 由实施例7的制备方法得到的N-对溴苄基哌啶-4-酮(4g)。

[0085] 50ml的圆底烧瓶中加入N-对溴苄基哌啶-4-酮(4g)(0.005mol)和对甲基苯甲醛(0.01mol)，15ml无水乙醇以及10％(质量分数)氢氧化钠1ml。室温搅拌0.5-2h，有固体析出，抽滤，再用无水乙醇洗涤产物，既得到N-对溴基苄基-3，5-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5h)。向25ml圆底瓶加入N-对溴基苄基-双对甲苄叉基-4-哌啶酮(5h)(1mmol)，丙二氰(1.5mmol，99mg)正丁醇(4ml)回流加热5小时，回流温度为120℃，薄层色谱(TLC)跟踪反应进程。待反应结束后，冷却，有固体析出。抽滤，固体用乙醇重结晶，既得最终产物(Ih)。

[0086] Yield：75％；light green solid，mp 92-94℃；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ7.31-7.32(m，2H)7.06-7.16(m，8H)6.96-6.99(m，2H)6.89(s，1H)4.56(s，2H)3.92(s，1H)3.37-3.51(m，4H)2.37(s，6H)1.27(d，J＝9.50Hz2H)；IR(KBr)：3500，3300，3065，3040，
3020，2950，2850，2245，1650，1450，1045，960，920，650cm-1；Anal.calcd.for C31H29BrN3O C％69.15，H％5.24，N％7.80；Found：C％69.35，H％5.32，N％7.66。

[0087] 目标化合物抑制白血病K562、卵巢癌HO-8910和肝癌SMMC-7721细胞增值活性的测试：

[0088] 1、测试药剂及设备：

[0089] 实验药品与试剂：自制化合物(I)，用DMSO配至所需浓度(DMSO浓度≤1‰)，灭菌4℃保存。MTT(四甲基偶氮唑蓝)试剂购自Sigma公司。人白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞均购于上海中科院细胞库。10％SDS试剂(Sino-American Biotechnology产品)，用含20％小牛血清(FBS)的RPMI-1640(美国GiBCo公司)培养液，其它试剂都是市售分析纯。在37℃、5％ CO2、饱和湿度的培养箱中进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。

[0090] 仪器设备：超净工作台，洁净＜3.5粒/L(＞0.5μm尘粒)，安泰技术有限公司；CO2细胞培养箱，Thermo公司Forma Scientific，Inc；倒置显微镜，日本尼康(Nikon)公司，型号810818；酶联免疫检测仪，Bio-RAD Model 680；96孔平板，美国Costar公司；SK2200H型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司。

[0091] 2、试验方法：

[0092] 实验在96孔板中进行，体系含1×105细胞及不同浓度的目标化合物全培养液。每孔总体积100μL，每组8个复孔，设置药物颜色对照孔(不含细胞)和含细胞与药物的培养孔，分别培养44h后，在各孔中加入MTT(5mg/mL，10μL)，继续培养4h，再加入10％SDS
100μL终止反应，37℃过夜，用酶联免疫检测各孔在570nm的吸光度A值。并依下式计算肿瘤生长抑制率：

[0093]

[0094] 3.结果调查

[0095] 用MTT法测四氢吡啶并吡喃衍生物(I)对白血病K562细胞系、卵巢癌MDR-MB-231细胞系及肝癌SMMC-7721细胞系增殖的影响，抑制率见表1。

[0096] 表1：标题化合物(I)在10ug/ml的浓度下对白血病K562细胞、卵巢癌MDR-MB-231细胞及肝癌SMMC-7721细胞增值的抑制率(％)

[0097]

[0098] 从表1初步抗白血病K562、卵巢癌MDR-MB-231及肝癌SMMC-7721活性测定显示：大部分标题化合物对白血病K562、卵巢癌MDR-MB-231及肝癌SMMC-7721癌细胞增殖具有较好的抑制作用。如表1所示，有些目标化合物在10μg/mL时对白血病K562癌细胞增值的抑制率达70％以上，Ic是系列化合物中最有抗白血病K562潜在活性的化合物，其对白血病K562癌细胞增值的抑制率达74.0％；Ia是系列化合物中最有抗卵巢癌MDR-MB-231潜在活性的化合物，其对卵巢癌MDR-MB-231癌细胞增值的抑制率达66％；Ia是系列化合物中最有抗肝癌SMMC-7721潜在活性的化合物，其对肝癌SMMC-7721癌细胞增值的抑制率达
75.2％。Ia和Ie是系列化合物中最有抗癌潜在活性的化合物，其对白血病K562细胞、卵巢