本发明涉及复合微生物酶制剂及其制备方法，属于微生物领域。本发明所要解决的技术问题是提供一种生产复合微生物酶制剂的方法，该复合微生物酶制剂可以用于酒糟的发酵生香，从而提高生产的白酒品质。本发明生产复合微生物酶制剂的方法包括如下步骤：a、己酸菌液的制备；b、窖泥富集菌液的制备；c、窖泥功能菌的制备：己酸菌液与窖泥富集菌液混合，接种于窖泥功能菌培养基中，32～36℃下培养22～27d，得到窖泥功能菌液，干燥，得到干制窖泥功能菌；d、干制窖泥功能菌以菌干重计、生香酵母、B类酶促物质、红曲酯化酶按重量配比1∶0.25～0.35∶1～2∶0.30～0.45混合，得到复合微生物酶制剂。
1.生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、己酸菌液的制备：己酸菌菌种经过复壮、扩大培养，得到己酸菌液；
b、窖泥富集菌液的制备：取窖泥中的菌种进行培养，得到窖泥富集菌液；
c、窖泥功能菌的制备：己酸菌液与窖泥富集菌液混合，接种于窖泥功能菌培养基中，
32～36℃下培养22～27d，得到窖泥功能菌液，干燥，得到干制窖泥功能菌；
其中，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1:1～5；所述窖泥功能菌培养基为：窖皮泥100～150重量份，糟醅700～800重量份，中温大曲100～200重量份，乙醇7.2～13.8重量份，硫酸铵0.27～0.69重量份，培养基含水量为30～60wt%，pH4～
d、干制窖泥功能菌以菌干重计、生香酵母、B类酶促物质、红曲酯化酶按重量配比
1:0.25～0.35:1～2:0.30～0.45混合，得到复合微生物酶制剂；
其中，所述的红曲酯化酶由产酯红曲霉经发酵培养而制得；
所述的B类酶促物质采用下述方法制备而成：以浓香型白酒生产的丢糟为基质，加入丢糟质量5～15%的高温大曲，和丢糟质量5～15%的黄水过滤后所得的滤渣，发酵5～15天，然后干燥、粉碎，制得水分≤15wt%的粗酶制剂。
2.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：a步骤中的己酸菌菌种采用下述方法进行复壮、扩大培养：将己酸菌菌种接入无菌水中，于75～85℃保温8～10min，然后接种于己酸菌种子培养基中32～36℃下培养7～8d，再于己酸菌扩大培养基中30～35℃下扩大培养5～7d；
其中，己酸菌种子培养基为：以蒸馏水1000mL计，乙酸钠0.5%，酵母膏0.1%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸铵0.05%，硫酸镁0.02%，碳酸钙1%，乙醇2%，121℃灭菌20min，pH6.5～7；
己酸菌扩大培养基为：以蒸馏水1000mL计，硫酸铵0.04%，糟醅浸提液40%，乙酸钠
0.7%，碳酸钙0.8%，乙醇0.5%，121℃灭菌20min，pH6-6.5；
其中，上述培养基中的乙醇含量为与蒸馏水相比的体积百分数，其余组分含量为与蒸馏水相比的质量百分数。
3.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：b步骤中窖泥富集菌液采用下述方法制备得到：以窖泥1g计，用无菌水稀释约100倍，于75～85℃回流热处理25～35min后，取10mL窖泥菌液接种入1000mL窖泥富集液培养基中，32～37℃恒温培养3～5d，培养结束后选择发酵旺盛的菌种作为原始菌种再进行扩大培养；
所述窖泥富集液培养基为：以蒸馏水1000mL计，葡萄糖3%，蛋白胨2%，牛肉膏1.5%，磷酸氢二钾0.05%，碳酸钙2%,乙酸钠0.5%，121℃灭菌20min，pH6～6.5；其中，上述培养基中的各组分含量为与蒸馏水相比的质量百分数。
4.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：c步骤中的pH值采用黄水进行调节。
5.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：c步骤中，接种时，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种总量为培养基质量的2～6%，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1:3～4；所述窖泥功能菌培养基为：窖皮泥120～130重量份，糟醅730～750重量份，中温大曲140～160重量份，乙醇9.9～11.44重量份，硫酸铵
0.396～0.52重量份，培养基含水量为40～50wt%，pH5～6。
6.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：c步骤所得窖泥功能菌液于40～60℃下干燥至含水量为5～25wt%，得到干制窖泥功能菌。
7.根据权利要求6所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：c步骤所得窖泥功能菌液于45～50℃下干燥至含水量为10～15wt%。
8.根据权利要求1所述的生产复合微生物酶制剂的方法，其特征在于：d步骤中所述的干制窖泥功能菌以菌干重计、生香酵母、B类酶促物质、红曲酯化酶的重量配比为1:0.25～
9.由权利要求1～8任一项的方法生产的复合微生物酶制剂。
复合微生物酶制剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及复合微生物酶制剂及其制备方法，属于微生物领域。
背景技术
[0002] 中国传统白酒以其独特的固态发酵工艺和产品风格，在世界六大蒸馏酒中占有重要的地位。泸型酒作为浓香型白酒的代表在中国白酒市场中占有巨大的市场份额，成为中国白酒中最有影响力的一个典范。
[0003] 浓香型曲酒独特的生产工艺特点是“泥窖固态发酵、续糟配料、混蒸混烧”。窖泥是浓香型曲酒酿造的基础，其质量的优劣直接影响着浓香型白酒的质量。窖泥中微生物区系极为复杂，栖息着大量的己酸菌、丁酸菌、乳酸菌等窖泥功能菌，对产生浓香型白酒的典型风格起着十分重要的作用。在泥窖中栖息着大量微生物，这些微生物是在白酒生产过程中收集、驯化而成，并形成了在泥窖环境下的微生物生态。这个微生物生态是动态平衡的，各种微生物在这一生态中发挥着独特的作用，加速这个生态的形成和维持这个生态的稳定是酿酒工作长期的任务。
[0004] 传统发酵技术和现在生物技术的结合使固态白酒的发酵得到了进一步的发展，但在白酒生香发酵中依然有很多未能攻克的难题，如：在发酵后期酯化力下降，上层糟醅和窖中间的糟醅由于长时间未与窖泥接触，糟醅发酵不充分、产酯率低等。
[0005] 针对上述问题，目前常用的解决办法有：
[0006] ①从工艺上改进，以延长发酵周期。一般采用翻沙和双轮底法，但翻沙工艺存在操作复杂，窖池利用率低，母糟活力会因翻沙而受损失等问题。而双轮底法发酵周期很长。
[0007] ②回泥发酵或者夹层窖泥发酵法。其操作比较烦琐，回泥量不好控制，长时间使用会导致泥浆渗入母糟中，使母糟板结对发酵和生香不利。
[0008] ③添加酯化酶促进产酯。此法在浓香型白酒生产中多应用于双轮底或翻沙的酯化(因其酸高、乙醇高)或者窖外酯化生香。但是在发酵糟或灌窖中应用效果不明显(与对照无甚差异)，具体原因可能是底物浓度初始不够，或受其他微生物的影响，或条件不适造成。
发明内容
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种生产复合微生物酶制剂的方法，该复合微生物酶制剂可以用于酒糟的发酵生香，从而提高生产的白酒品质。
[0010] 本发明生产复合微生物酶制剂的方法包括如下步骤：
[0011] a、己酸菌液的制备：己酸菌菌种经过复壮、扩大培养，得到己酸菌液；
[0012] b、窖泥富集菌液的制备：取窖泥(年代越久的老窖中的窖泥中的有益菌种越丰富，因此，优选10年以上的窖池的窖泥)中的菌种进行培养，得到窖泥富集菌液；
[0013] c、窖泥功能菌的制备：己酸菌液与窖泥富集菌液混合，接种(本发明中，均可以按常规的菌种接种方法接种)于窖泥功能菌培养基中，32～36℃下培养22～27d，得到窖泥功能菌液，干燥，得到干制窖泥功能菌；
[0014] 其中，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1∶1～5；所述窖泥功能菌培养基为：窖皮泥(窖皮泥即封窖泥，是用于封窖的粘土)100～150重量份，糟醅700～800重量份，中温大曲(在制曲过程中，最高品温控制在50～60℃而制成的大曲)100～200重量份，乙醇7.2～13.8重量份，硫酸铵0.27～0.69重量份，培养基含水量为30～60wt％，pH4～7；
[0015] d、干制窖泥功能菌以菌干重计、生香酵母(生香酵母又称产酯酵母，主要属于产膜酵母和假丝酵母，大多为异型汉逊酵母及少数小圆型酵母属)、B类酶促物质、红曲酯化酶按重量配比1∶0.25～0.35∶1～2∶0.30～0.45混合，得到复合微生物酶制剂；
[0016] 其中，所述的红曲酯化酶由产酯红曲霉(常规的产酯红曲霉或红曲酯化霉都适用于本发明)经发酵培养而制得；
[0017] 所述的B类酶促物质采用下述方法制备而成：以浓香型白酒生产的丢糟为基质，加入对丢糟质量5～15％的高温大曲(在制曲过程中，最高品温控制大于60℃而制成的大曲即为高温大曲)，和丢糟质量5～15％的黄水(白酒发酵过程，逐渐渗于窖池底部的棕黄色液体)过滤后所得的滤渣，发酵5～15天，然后干燥、粉碎，制得水分≤15wt％的粗酶制剂。
[0018] 其中，上述a步骤中的己酸菌菌种可以采用常规方法进行复壮、扩大培养，优选采用下述方法进行复壮、扩大培养：
[0019] 将己酸菌菌种接入无菌水中，于经过75～85℃保温8～10min，然后接种于己酸菌种子培养基中32～36℃下培养7～8d(培养至菌种处于旺盛代谢期)，再于己酸菌扩大培养基中30～35℃下扩大培养5～7d；
[0020] 其中，己酸菌种子培养基为：以蒸馏水1000mL计，乙酸钠0.5％，酵母膏0.1％，磷酸氢二钾0.04％，硫酸铵0.05％，硫酸镁0.02％，碳酸钙1％，乙醇2％(乙醇为与蒸馏水相比的体积百分数，其余为与蒸馏水相比的质量百分数，下同)，121℃灭菌20min，pH6.5～7；
[0021] 己酸菌扩大培养基为：以蒸馏水1000mL计，硫酸铵0.04％，糟醅浸提液40％，乙酸钠0.7％，碳酸钙0.8％，乙醇0.5％，121℃灭菌20min，pH6-6.5。
[0022] 其中，上述b步骤中窖泥富集菌液优选采用下述方法制备得到：
[0023] 以窖泥1g计，用无菌水稀释约100倍，于75～85℃回流热处理25～35min后，取10mL窖泥菌液接种入1000mL窖泥富集液培养基中，32～37℃恒温培养3～5d，培养结束后选择发酵旺盛的菌种作为原始菌种再进行扩大培养；
[0024] 所述窖泥富集液培养基为：以蒸馏水1000mL计，葡萄糖3％，蛋白胨2％，牛肉膏1.5％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙2％，乙酸钠0.5％，121℃灭菌20min，pH6～6.5。
[0025] 黄水是白酒酿造中产生的副产物，在发酵过程中渗于窖池底部，为黄色或棕黄色粘稠状液体，并有特殊的气味。黄水中含有丰富的淀粉、还原糖等物质，以及醇类、酸类、醛类、酯类等呈香呈味物质，还有经长期驯化的有益微生物等。进一步的，为了使窖泥功能菌培养的条件接近窖池环境，上述c步骤中的pH值优选采用黄水进行调节。
[0026] 其中，本发明人经过大量试验研究发现，c步骤中，接种时，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种总量为培养基质量的2～6％，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1∶3～4；所述窖泥功能菌培养基为：窖皮泥120～130重量份，糟醅730～750重量份，中温大曲140～160重量份，乙醇9.9～11.44重量份，硫酸铵0.396～0.52重量份，培养基含水量为40～50wt％，pH为5～6时，培养结束后其己酸含量和芽孢杆菌数量达到最大值。
[0027] 其中，本发明制备窖泥功能菌的方法，为了便于保存和运输，c步骤所得窖泥功能菌液优选于40～60℃下干燥至含水量为5～25wt％，得到干制窖泥功能菌。c步骤所得窖泥功能菌液更优选于45～50℃下干燥至含水量为10～15wt％。
[0028] 进一步的，为了使本发明方法生产的复合微生物酶制剂的生香效果更好，本发明方法的d步骤中所述的干制窖泥功能菌以菌干重计、生香酵母、B类酶促物质、红曲酯化酶的重量配比优选为1∶0.25～0.30∶1.5～1.7∶0.35～0.40。
[0029] 本发明还提供了由上述方法所生产的复合微生物酶制剂。
[0030] 本发明方法生产的复合微生物酶制剂，可解决传统固态白酒发酵中窖池中央的酒糟无法与窖壁泥功能菌充分接触的问题，提高了白酒质量。解决了以往在酒体中加入人工香料物质产生浮香的技术难题。本发明复合微生物酶制剂不仅可应用于人工窖泥的培养、窖池泥保养、翻沙材料、灌窖，也可作为发酵生香制剂用于酒糟中发酵生香，从而提高白酒质量。本发明方法为浓香型白酒质量的提高提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
[0031] 下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0032] 实施例1 采用本发明方法制备酿酒用复合微生物酶制剂
[0033] 1、己酸菌液的制备
[0034] 将己酸菌种接入无菌水中，比例为1∶4，经过80℃热水浴8-10min处理后，将己酸菌种子接种于己酸菌种子培养基中，培养条件为温度为34℃、pH值为6、培养时间为7-8天。待培养液变淡黄色并有小气泡上升时，保证菌种处于旺盛的代谢期时，进行扩大培养。
[0035] 生产用己酸菌液培养：将10L陶罐用水冲洗干净→糟醅滤液、乙酸钠和硫酸铵(加入量为容器的一半)→通入蒸汽加热至沸，保持30min→待坛温冷却至40℃，加入高温灭菌的碳酸钙和乙醇等、搅匀→调整pH为6→接入种子培养液接种量为发酵液体积的10％→塑料薄膜密封坛口(用乳胶管导气)→在温度为30-35℃下保温培养5-7天备用。
[0036] 2、窖泥富集液的制备
[0037] 从窖池底四周及中心五个点取样混合后，取1g混合样，用无菌水稀释100倍后，经80℃回流热处理30分钟后，取10mL窖泥菌液接种入1000mL窖泥富集液培养基中，35℃恒温培养3-5天，培养结束后选择发酵旺盛的作为原始菌种再进行扩大培养。
[0038] 3、窖泥功能菌的制备
[0039] 己酸菌液与窖泥富集菌液混合添加到窖泥功能菌培养基中，于1L发酵罐中，34℃下培养25d。
[0040] 其中，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种总量为培养基质量的3％，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1∶3。窖泥功能菌培养基为：窖皮泥120g，糟醅730g，大曲140g，乙醇9.9g，硫酸铵0.396g，pH为5，含水量在35％。
[0041] 4、干制窖泥功能菌
[0042] 在45℃下干燥至含水量为10％，得到干制窖泥功能菌。
[0043] 5、酿酒用复合微生物酶制剂的制备
[0044] 窖泥功能菌，生香酵母，B类酶促物质，红曲酯化酶混合，得到酿酒用复合微生物酶制剂。
[0045] 其中窖泥功能菌与B类酶促物质的质量比为1∶1.5，生香酵母用量为窖泥功能菌质量的25％，红曲酯化酶用量为窖泥功能菌质量的35％。
[0046] 测定其酯化力为1.15(g/g·96h)，比酯化大曲酯化力0.85(g/g·96h)高。
[0047] 实施例2 采用本发明方法制备窖泥功能菌
[0048] 1、己酸菌液的制备
[0049] 将己酸菌种接入无菌水中，比例为1∶4，经过80℃热水浴8-10min处理后，将己酸菌种子接种于己酸菌种子培养基中，培养条件为温度为34℃、pH值为6.5、培养时间为7-8天。待培养液变淡黄色并有小气泡上升时，保证菌种处于旺盛的代谢期时，进行扩大培养。
[0050] 生产用己酸菌液培养：将10L陶罐用水冲洗干净→糟醅滤液、乙酸钠和硫酸铵(加入量为容器的一半)→通入蒸汽加热至沸，保持30min→待坛温冷却至40℃，加入高温灭菌的碳酸钙和乙醇等、搅匀→调整pH为7→接入种子培养液接种量为发酵液体积的10％→塑料薄膜密封坛口(用乳胶管导气)→在温度为30-35℃下保温培养5-7天备用。
[0051] 2、窖泥富集液的制备
[0052] 从窖池底四周及中心五个点取样混合后，取1g混合样，用无菌水稀释100倍后，经80℃回流热处理30分钟后，取10mL窖泥菌液接种入1000mL窖泥富集液培养基中，35℃恒温培养3-5天，培养结束后选择发酵旺盛的作为原始菌种再进行扩大培养。
[0053] 3、窖泥功能菌的制备
[0054] 己酸菌液与窖泥富集菌液混合添加到窖泥功能菌培养基中，于1L发酵罐中，34℃下培养25d。
[0055] 其中，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种总量为培养基质量的4％，己酸菌液与窖泥富集菌液中的菌种干重重量之比为1∶3。窖泥功能菌培养基为：窖皮泥125g，糟醅740g，大曲150g，乙醇10.15g，硫酸铵0.406g，pH为5.5，含水量在40％。
[0056] 4、干制窖泥功能菌
[0057] 在45℃下干燥至含水量为12％，得到干制窖泥功能菌。
[0058] 5、酿酒用复合微生物酶制剂的制备
[0059] 窖泥功能菌，生香酵母，B类酶促物质，红曲酯化酶混合，得到酿酒用复合微生物酶制剂。
[0060] 其中窖泥功能菌与B类酶促物质的质量比为1∶1.5，生香酵母用量为窖泥功能菌质量的25％，红曲酯化酶用量为窖泥功能菌质量的35％。
[0061] 测定其酯化力为1.36(g/g·96h)，比酯化大曲酯化力0.85(g/g·96h)高。
[0062] 实施例3 采用本发明方法制备窖泥功能菌
[0063] 1、己酸菌液的制备
[0064] 将己酸菌种接入无菌水中，比例为1∶4，经过80℃热水浴8-10min处理后，将己酸菌种子接种于己酸菌种子培养基中，培养条件为温度为34℃、pH值为6、培养时间为7-8
