一种假单胞菌及其用途和去除环境中镉污染的方法

摘要

本发明涉及一种假单胞菌及其用途和去除环境中镉污染的方法。假单胞菌分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）HN103，保藏中心保藏编号为：CCTCCNO:M2011184；恶臭假单胞菌HN103形态及特征包括：1）在培养基上，菌落起初无色透明，后变成白色，光滑，凸透镜状，边缘不规则；2）菌体镜检结果为短杆状菌，革兰氏阴性菌。该菌用途为用作去除镉污染的生物修复材料；去除环境中镉污染的步骤包括：1）将污水中镉离子浓度调整至恶臭假单胞能正常生长的范围；2）投放恶臭假单胞菌；3）使恶臭假单胞菌在污水中保持一定时间；4）移除吸附了镉离子的菌体。本发明优点是：投资少，成本低，适应性强，对镉有高效的去除能力，能快速显著降低环境中镉离子的浓度，适于镉污染环境的生物修复。

权利要求

1.一种假单胞菌， 其特征在于，分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）HN103 ， 保藏日期为： 2011年5月26日，保藏单位为： CCTCC，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M2011184；该恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）HN103，以下称为：恶臭假单胞菌HN103，其形态及生理生化特征包括：1）在培养基上，菌落起初无色透明，后变成白色，光滑，凸透镜状，边缘不规则；2）菌体镜检结果为短杆状菌，革兰氏阴性菌。

2.根据权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于，恶臭假单胞菌HN103细菌淀粉分解能力的试验呈阴性，具有过氧化氢酶活性，无代谢色氨酸产吲哚的能力，具有运动性，属于兼性厌氧菌。

3.根据权利要求1所述的假单胞菌，其特征在于，恶臭假单胞菌HN103在镉离子污水中正常生长的镉离子浓度为小于等于1000mg/L。

4.权利要求1或2或3所述的假单胞菌作为去除镉污染的生物修复材料的应用。

5.一种用权利要求1所述的假单胞菌去除环境中镉污染的方法，其特征在于，用作去除镉污染的生物修复材料是恶臭假单胞菌HN103，方法包括下述步骤：

1）测定污水中镉离子浓度，将污水中镉离子浓度调整至恶臭假单胞菌HN103能正常生长的范围；

2）向适宜于恶臭假单胞菌HN103正常生长的镉离子的污水中投放恶臭假单胞菌HN103；

3）使恶臭假单胞菌HN103在污水中保持一定时间；

4）移除菌体，即移除吸附了镉离子的菌体，移除方法为沉降法，或过滤法，或固定化细胞技术。

6.根据权利要求5所述去除环境中镉污染的方法，其特征在于，污水中镉离子浓度调整至小于等于1000mg/L；恶臭假单胞菌HN103在污水中保持时间为40小时至240小时。

说明书

一种假单胞菌及其用途和去除环境中镉污染的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种假单胞菌及其用途和去除环境中镉污染的方法，适用于镉污染，也适用于多种重金属污染环境的生物修复，属于重金属污染物处理和微生物技术领域。

背景技术

[0002] 镉金属一般以天然浓度广泛存在与自然界中，但随着各种重金属开采、冶炼、加工和电子工业等应用制造业的发展，镉等重金属元素随之大量进入大气、水、土壤中，引起严重的污染，严重威胁着人类和生物的生存和生态环境的安全性。

[0003] 镉元素具有很强的生物毒性，化学性质类似于锌，在多种生化过程中，镉通过与酶类巯基的结合与替代作用，置换出酶的结合重金属，使机体抗氧化活性降低，引起细胞氧化损伤；镉离子还干扰细胞钙代谢，可使DNA链断裂，损坏DNA修复系统，引起细胞凋亡。镉类化合物具有脂溶性、生物富集性和强毒性。镉也是土壤中最具运动性的重金属之一，长期、大量含镉肥料的施用，会对作物的生长和作物的品质造成不良影响；镉在土壤中极易被作物吸收，进入食物链，最终在动物和人体内积累，可对肾脏、骨骼、肺部、心血管等多种器官和系统造成严重危害；镉常和腐殖质形成络合物和螯合物，对土壤的腐殖质造成毁灭性的影响。

[0004] 在自然界中，微生物(细菌、藻类和酵母等)参与了重金属的转化，或者将重金属转化为无毒性或低毒的形式，或者通过吸附作用，将其固定于生物细胞内，从而达到自然净化的结果。微生物种类多，生长快，代谢快，对环境适应性强，所以利用微生物技术治理环境中的镉污染是目前环境污染治理研究的热点。但与此同时，微生物对重金属的去除能力相对有限，需要的作用时间长，而且微生物容易中毒。

发明内容

[0005] 本发明第一个目的是，克服现有技术的缺点，提供一种新的假单胞菌株。

[0006] 本发明第二个目的是，将本发明恶臭假单胞菌HN103作为去除镉污染的生物修复材料的用途。

[0007] 本发明还有一个目的是：用本发明恶臭假单胞菌HN103作为去除镉污染的生物修复材料快速有效去除环境中镉污染的方法。

[0008] 综合目的是：提供一种投资少，成本低，适应性强，对镉有高效的去除能力，能快速显著降低环境中镉离子的浓度的恶臭假单胞菌及去除环境中镉污染的方法，达到污染环境的生物修复目的。

[0009] 本发明假单胞菌的技术方案是：一种假单胞菌，分类命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）HN103 ， 保藏日期为： 2011年5月26日，保藏单位为：CCTCC，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M2011184；该恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）HN103，以下称为：恶臭假单胞菌HN103，其形态及生理生化特征包括：1）在培养基上，菌落起初无色透明，后变成白色，光滑，凸透镜状；2）菌体镜检结果为杆菌，革兰氏阴性菌。

[0010] 所述的假单胞菌，恶臭假单胞菌HN103细菌淀粉分解能力的试验呈阴性，具有过氧化氢酶活性，发酵葡萄糖不产酸，不还原硝酸盐，具有运动性，属于兼性厌氧菌。

[0011] 所述的假单胞菌，恶臭假单胞菌HN103在重金属离子污水中正常生长的镉离子浓度为小于等于1000mg/L。

[0012] 一种假单胞菌作为去除镉污染的生物修复材料的应用。

[0013] 一种用假单胞菌去除环境中镉污染的方法，其用作去除镉污染的生物修复材料是恶臭假单胞菌HN103，方法包括下述步骤：

[0014] 1）测定污水中镉离子浓度，将污水中镉离子浓度调整至恶臭假单胞菌HN103能正常生长的范围；

[0015] 2）向适宜于恶臭假单胞菌HN103正常生长的镉离子的污水中投放恶臭假单胞菌HN103；

[0016] 3）使恶臭假单胞菌HN103在污水中保持一定时间；

[0017] 4）移除菌体，即移除吸附了镉离子的菌体，移除方法为沉降法，或过滤法，或固定化细胞技术。

[0018] 在上述用假单胞菌去除环境中镉污染的方法方案基础上，进一步的较优化方案是：所述假单胞菌去除环境中镉污染的方法，其污水中镉离子浓度调整至小于等于1000mg/L；恶臭假单胞菌HN103在污水中保持时间为40小时至240小时。

[0019] 本发明的积极效果是： 1) 本发明恶臭假单胞菌HN103的应用，解决了人们长期渴望解决而未能很好解决的重金属污染问题；由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少镉等强生物毒性的重金属进入地表水和土壤中，引起严重的环境污染。2)本发明微生物修复技术投资少，成本低，适应性强。3)本发明所述的恶臭假单胞菌HN103菌体生长快，由于该菌可以耐受高浓度的重金属离子，可在1000mg/L的镉离子污水中正常生长，所以菌体不易中毒失效；具有将镉离子吸附到细胞壁的特性，然后通过沉降、过滤或者固定化细胞等技术移除菌体，可以快速降低水中镉离子的浓度。4) 本发明恶臭假单胞菌HN103吸附重金属离子作用快，吸附后，通过沉降、过滤或者固定化细胞等技术移除菌体，能够避免二次污染；在42小时使得镉离子浓度50mg/L的水体中镉离子浓度降低60%，该菌可以快速降低水中镉离子的浓度，在42小时使得镉离子浓度10mg/L的水体中镉离子浓度降低90%。5)此外，恶臭假单胞菌HN103菌体对其它重金属离子，如铜、锌、铬、镍、锰离子其中一种或多种也均有吸附作用，应用面广。6)受重金属污染的土壤以及水体环境均可治理和修复，因此，应用价值高。

附图说明

[0020] 图1：恶臭假单胞菌HN103菌落形态；

[0021] 图2：恶臭假单胞菌HN103革兰氏染色后显微镜下图片；

[0022] 图3：恶臭假单胞菌HN103菌体在不同Cd2+浓度下的生长曲线；

[0023] 图4：恶臭假单胞菌HN103菌体吸附Cd2+的曲线。

具体实施方式

[0024] 实施例1：一种假单胞菌，其分类命名为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida HN103，保藏日期为： 2011年5月26日，保藏单位为： CCTCC，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO: M2011184；该恶臭假单胞菌Pseudomonas putida HN103，以下称为：恶臭假单胞菌HN103，其形态及生理生化特征包括：1）在培养基上，菌落起初无色透明，后变成白色，光滑，凸透镜状，边缘不规则；2）菌体镜检结果为短杆状菌，革兰氏阴性菌。

[0025] 实施例2：与上述实施例不同的是，恶臭假单胞菌HN103其形态及生理生化特征还包括：恶臭假单胞菌HN103细菌淀粉分解能力的试验呈阴性，具有过氧化氢酶活性，无代谢色氨酸产吲哚的能力，具有运动性，属于兼性厌氧菌。

[0026] 实施例3：与上述实施例不同的是，恶臭假单胞菌HN103其形态及生理生化特征还包括：在镉离子污水中正常生长的镉离子浓度为小于等于1000mg/L。

[0027] 实施例4：一种假单胞菌作为去除镉污染的生物修复材料的应用，镉污染是水体或土壤环境中镉离子污染。

[0028] 实施例5：一种用假单胞菌去除环境中镉污染的方法，其用作去除镉污染的生物修复材料是恶臭假单胞菌HN103，方法步骤如下：

[0029] 1）测定污水中镉离子浓度，将污水中镉离子浓度调整至恶臭假单胞菌HN103能正常生长的范围；本实施例其污水中镉离子浓度调整至小于等于1000mg/L；

[0030] 2）向上述适宜于恶臭假单胞菌HN103正常生长的镉离子的污水中投放恶臭假单胞菌HN103；

[0031] 3）使恶臭假单胞菌HN103在污水中保持一定时间；本实施例恶臭假单胞菌HN103在污水中保持时间为50小时，可选范围为40小时至70小时。

[0032] 4）移除菌体，即移除吸附了镉离子的菌体，移除方法为沉降法，或过滤法，或固定化细胞技术。

[0033] 实施例6：图1为恶臭假单胞菌HN103菌落形态，图2为恶臭假单胞菌HN103革兰氏染色后显微镜下图片。对本发明恶臭假单胞菌HN103的菌株性质，以鉴定步骤作进一步举例说明：

[0034] 1、 形态学鉴定，包括菌落形态的观察和描述和革兰氏染色后的镜检记录，其中镜检是在100倍的油镜下进行的，并拍下照片，特征如下：在培养基上菌落起初无色透明，后变成白色，光滑，凸透镜状，边缘不规则；菌体镜检结果为短杆状菌，革兰氏阴性菌，适宜生长温度20－37℃，适宜pH7.0－7.5；

[0035] 2、 16SrRNA分子鉴定，即采用原核生物16SrDNA通用引物27F和1492R（27F序列：-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-，1492R序列：-GGTTACCTTGTTACGACTT-）进行PCR。在PCR扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，然后对其序列进行测定，将测序结果与国际NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库上的信息比对，确定其种属，鉴定为恶臭假单胞菌，核苷酸同源性为100％；

[0036] 其中，革兰氏细菌染色步骤为：

[0037] a.涂片：取干净载玻片一块，在载玻片左、右各滴加一滴菌液，接种环涂片；

[0038] b.晾干：在酒精灯火焰上方用文火烘干；

[0039] c.固定：手执载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2－3次固定；

[0040] d.结晶紫染色：将载玻片至于废液缸上，加适量结晶紫染色液染色1min；

[0041] e.水洗：倾去染色液，用水小心冲洗；

[0042] f.媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min；

[0043] g.脱色：将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇通过涂面10s，立即水洗；

[0044] h.复染：滴加番红复染35min；

[0045] i.水洗：用水洗去涂片上的番红染色液；

[0046] j.晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干；

[0047] k.镜检。

[0048] 具体方法：

[0049] PCR反应体系（25μL）

[0050] 10×EasyTaq buffer 2.5μL

[0051] 模板 1.0μL

[0052] dNTP 1.0μL

[0053] 引物R 1.0μL

[0054] 引物F 1.0μL

[0055] EasyTaq 0.5μL

[0056] ddH2O 18μL 。

[0057] 反应程序见Table1：

[0058]

[0059] 其中，第2、3、4步在进行一次之后，进入29次循环（即总共进行30次），循环完之后再进入第5步，第5步反应程序后冷却至25℃取出，准备进行琼脂糖凝胶电泳。

[0060] 电泳检测及切胶回收：

[0061] 将PCR扩增的产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳以DL2000 marker作相对分子质量参照，切胶回收使用Axyprep DNA切胶回收试剂盒，对PCR产物进行回收；

[0062] a、在紫外灯下切下中含有目的片段的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl）；

[0063] b、加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混匀后于75℃加热，间断混合（每2-3min），至凝胶块完全熔化；

[0064] c、加入0.5个Buffer DE-A体积de Buffer DE-B,混合均匀；

[0065] d、吸取c中的混合液，转移至DNA制备管（至于2ml离心管）中，12，000×g离心1min，弃滤液；

[0066] e、将制备管放回离心管，加入500μl Buffer W1，12，000×g离心1min，弃滤液；

[0067] f、将制备管放回离心管，加入700μl Buffer W2，12，000×g离心1min，弃滤液；

[0068] g、重复一次步骤f；

[0069] h、将制备管放回2ml离心管，12，000×g离心1min；

[0070] i、将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，室温下静置，至乙醇完全挥发，在DNA制备膜中央加入25μl Eluent，室温静置1min， 12，000×g离心1min洗脱DNA。

[0071] 3、 生理生化鉴定，包括通过淀粉水解实验、甲基红（M.R）实验、乙酰甲基甲醇（V.P）实验、过氧化氢酶实验、产吲哚实验和运动性实验对一些相关特性做的鉴定：

[0072] A、淀粉水解实验

[0073] a.培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中0.2%的可溶性淀粉，装于三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌30min，倒平板备用；

[0074] b.培养：取新鲜培养的菌液点接在培养基上，30℃培养过夜；

[0075] c.观察：取出平板，打开平皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，表示该细菌具有分解淀粉的能力；

[0076] d.结果记录：菌落周围无水解圈，呈阴性；

[0077] B、甲基红（M.R）实验

[0078] a.培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，水1000ml，pH7.0～7.2；

[0079] b.培养：将新鲜菌液接种于葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，至于37℃恒温箱培养24h；

[0080] c.观察：取出培养好的试管，沿管壁加入甲基红指示剂3～4滴，观察是否变色，若培养基由原来的橘黄色变为红色则为阳性反应；

[0081] d.结果记录：培养液不变色，呈阴性；

[0082] C、 乙酰甲基甲醇（V.P）实验

[0083] a.培养基：葡萄糖蛋白胨培养基（同M.R）。

[0084] b.培养：将新鲜菌液接种于葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，至于37℃恒温箱培养24h；

[0085] c.观察：取出培养好的试管，在培养基中加入40%的NaOH溶液10～20滴，再加入0.5～1.0mg的肌酸，猛烈振荡，2～10min内有红色出现即为V.P正反应；

[0086] d.结果记录：未出现红色，为阴性反应；

[0087] D、过氧化氢酶实验

[0088] a.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；

[0089] b.培养：取新鲜菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，30℃培养24h；

[0090] c.观察：打开平皿盖，滴加一滴的30%过氧化氢于单菌落上。如有气泡产生则为阳性；

[0091] d.结果记录：菌落上有大量气泡产生，呈阳性；

[0092] E、 葡萄糖发酵产酸实验

[0093] a. 培养基 葡萄糖发酵培养基试管3支(内装有倒置的德汉氏小试管)；

[0094] b.培养：将菌种接种于发酵培养基中，然后将接菌的试管放置在30℃恒温培养箱中培养24h；

[0095] c.观察：观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡；

[0096] d.结果记录：发酵葡萄糖产气，不产酸；

[0097] F、 运动性实验

[0098] a.培养基：0.6%的琼脂；

[0099] 培养：用接种针将新鲜菌液穿刺接种到含半固体琼脂培养基的试管中，30℃恒温培养箱培养24h；

[0100] b.观察：若生长物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌株无运动性；如生长物向四周扩散，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性；

[0101] c.结果记录：生长物向四周扩散，培养基表面有大量菌体生长，表明试验菌具有运动性，属于兼性厌氧菌（见图4）；

[0102] 生理生化鉴定结果总结于Table2：

[0103]

[0104] 注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

[0105] 本发明的恶臭假单胞菌HN103 的保藏方法：

[0106] 恶臭假单胞菌HN103可以在加入Cd2+的牛肉膏蛋白胨培养上30℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。使用甘油冷冻管和冷冻干燥管对菌株进行长期保藏；

[0107] 使用甘油冷冻管法时，取1ml 80%的灭菌甘油于2ml的灭菌的菌种保藏管中，再取1ml新培养的菌液加入 ，4℃下预冷一小时，然后在-20℃下保存菌种。

[0108] 以下是本发明假单胞菌HN103对高Cd2+浓度的耐受性效果的说明：

[0109] 通过对保藏菌种的复苏和培养，并定时的测定其菌液OD值，可以绘制其生长曲线，具体通过以下步骤实现：

[0110] 1)菌种复苏：取保藏菌种，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，30℃恒温培养箱2+
中培养24h，挑取单菌落在100mg/L Cd 的100ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养；

[0111] 2)曲线绘制：

[0112] a.在无菌超净台中取新鲜菌液接种到100ml Cd2+浓度分别为0、200mg/L、1000mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃,200r/min的旋转振荡器中培养；

[0113] b.每间隔一段时间在无菌超净台中分别采集样品，在DU800紫外分光光度计上测定OD600，以相应的不接种的培养基为空白对照；

[0114] c.整理数据，制作菌体的生长曲线。所得的曲线见图3；

[0115] 从图中可以看出低浓度的Cd2+对菌体生长无影响，高浓度的Cd2+会使菌株生长的延迟期增长，且生物量降低。

[0116] 以下是对本发明恶臭假单胞菌HN103吸附Cd2+的曲线效果的说明：

[0117] 在菌体生长对数期时，分别接种1ml新鲜菌液到100ml Cd2+浓度为10mg/L、50mg/L牛肉膏蛋白胨培养基中，在37℃，200r/min的旋转振荡器上培养。样品处理步骤如下：（1）每隔6小时，在无菌操作台中分别从各种浓度的镉的培养基中取出菌液，12000r/min离心2+ 2+
5min，上清液用0.2μm的滤膜过滤，滤液中Cd ，为菌体吸附后培养基中剩余的Cd 。（2）
2+
滤液中Cd 使用精密度与灵敏度高，测定结果稳定的火焰原子吸收法来测定。所得数据见Table3：

[0118]2+ 2+

[0119] 各滤液中Cd 的含量，绘制恶臭假单胞菌HN103的吸附Cd 的曲线见图4。

[0120] 本发明权利要求保护范围不限于上述实施例。