固定化漆酶及其制备方法

摘要

本发明公开了一种固定化漆酶，其以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，固定化漆酶的酶活性回收率为60％～95％；本发明相应公开了该固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，漆酶溶液的浓度为0.3～1.0mg/ml，漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对该溶液振荡3h以上；经过后续处理得到固定化漆酶；本发明的固定化漆酶基于磁性介孔碳固定漆酶，使得漆酶具有优异酶学性能；本发明的固定化漆酶的制备方法，操作简单，成本低廉。

权利要求

1.一种固定化漆酶，其特征在于：所述固定化漆酶以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60%～

95%；所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为 1∶（1～2.5）；所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构；所述有序双峰介孔结构是指孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和

18nm附近区域；

所述磁性介孔碳通过以下方法制得：

（1）先将嵌段共聚物与正硅酸乙酯在30℃～35℃的温度下混合搅拌20h～24h，再将混合液转移至135℃～140℃下水热反应22h～24h，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；

（2）将上述得到的白色粉末在500℃～550℃的温度下煅烧4h～5h后得到介孔硅模板；

（3）利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70℃～80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h～12h，干燥后得到复合物；所述金属硝酸盐是指摩尔比为1∶（1～1.1）的Fe(NO3)3与Ni(NO3)2的混合物；

（4）将所述步骤（3）得到的复合物在N2中于800℃～900℃的温度下热处理1h～2h，然后用加热至80℃～90℃的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再经过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。

2.一种如权利要求1所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.3mg/ml～1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对该溶液振荡3h以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后，得到固定化漆酶。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述振荡的转速为100rpm～

120rpm，所述振荡的时间为3h～7h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述漆酶溶液是由漆酶与柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液配制而成，所述柠檬酸缓冲液的pH值为3.5～4.0，所述磷酸缓冲液的pH值为4.5～5.5；所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.4mg/ml或1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4.0，所述振荡的转速为100rpm，所述振荡的时间为3h。

说明书

固定化漆酶及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及酶的固定化领域，具体涉及一种固定化漆酶及其制备方法。

背景技术

[0002] 漆酶(laccase，E.C.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于真菌、细菌和植物中。漆酶具有较广泛的底物专一性和较强的稳定性，能催化许多酚类和芳香胺类物质，如苯酚、对氯苯酚、苯胺以及多酚和多胺类物质，因而在生物传感器、生物燃料电池、生物转化及废水处理等领域具有广泛应用。但由于漆酶易溶于水，在水中游离的漆酶不可回收也不能长期保存，且在高温或其他极端环境下漆酶的稳定性不易保持，因而限制了漆酶的实际应用。固定化技术在保持游离漆酶的专一、高效的催化活性的同时，更是提高漆酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段，常用的固定化载体包括活性炭、壳聚糖、多孔硅胶以及微滤膜等多种材料，但现有的固定化材料存在固定化效率低、加工工艺复杂、分离困难以及操作性不高等缺陷。

[0003] 新型介孔材料由于具有纳米规整的有序孔道结构、巨大的比表面积及孔容等特征，在生物催化和分离领域，尤其是在作为酶固定化载体的研究和应用上显示了极大潜力。有文献报道，用大孔径的磁性介孔硅固定漆酶，固定化酶的活性回收率较高，且提高了漆酶的pH稳定性和热稳定性(Yufang Zhu et al，Chemistry of Materials，2007，6408-6413)，但该类介孔材料具有制备过程繁琐、难以分离等缺点。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种具有大比表面积和二级介孔结构的磁性介孔碳材料固定的且具有优异酶学性能的固定化漆酶，以及相应提供该固定化漆酶的制备方法。

[0005] 为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：一种固定化漆酶，其以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于所述磁性介孔碳上，所述磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒，所述磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，所述固定化漆酶的酶活性回收率为60％～95％(优选的技术方案可达75％～95％)。

[0006] 作为对上述的固定化漆酶的优化，所述的磁性介孔碳与漆酶的质量配比为1∶(1～2.5)。

[0007] 作为对上述的固定化漆酶的优化，所述磁性介孔碳含有有序双峰介孔结构。优选的，该有序双峰介孔结构是指磁性介孔碳孔径分布的两个峰值分别出现在4nm附近区域和18nm附近区域。4nm附近区域特别是指孔径主要集中分布在4nm～5nm的孔径范围内，18nm附近区域特别是指孔径主要集中分布在14nm～18nm的孔径范围内。

[0008] 作为一个总的发明构思，本发明还提供上述的固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：先准备磁性介孔碳和漆酶溶液，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.3mg/ml～1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为3.0～6.0；然后将磁性介孔碳加入至所述漆酶溶液中，在25℃～30℃的温度下对混合溶液振荡3h以上；再经过洗涤、磁性分离、冷冻和真空干燥后，得到固定化漆酶。

[0009] 上述的制备方法中，优选地，所述漆酶溶液是由漆酶与柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液配制而成，所述柠檬酸缓冲液的pH值为3.5～4.0，所述磷酸缓冲液的pH值为4.5～5.5。

[0010] 作为对上述的制备方法的优化，所述振荡的转速为100rpm～120rpm，所述振荡的时间为3h～7h。

[0011] 作为对上述的制备方法的优化，所述磁性介孔碳通过以下方法制得：

[0012] (1)先将嵌段共聚物(模板剂)与正硅酸乙酯在30℃～35℃的温度下混合搅拌20h～24h，再将混合液转移至135℃～140℃下水热反应22h～24h，得到白色沉淀，将所述白色沉淀洗涤至中性后过滤、干燥，得到白色粉末；

[0013] (2)将上述得到的白色粉末在500℃～550℃的温度下煅烧4h～5h后(模板剂嵌段共聚物被脱除)得到介孔硅模板；

[0014] (3)利用初湿浸渍法将由金属硝酸盐、乙醇和糠醇组成的多元溶液渗透到所述介孔硅模板中，然后在70℃～80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h～12h，干燥后得到复合物；

[0015] (4)将所述步骤(3)得到的复合物在N2中于800℃～900℃的温度下热处理1h～2h，然后用加热至80℃～90℃的氢氧化钠溶液洗涤移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗和干燥，得到磁性介孔碳。

[0016] 上述的制备方法中，优选地，所述金属硝酸盐是指摩尔比为1∶(1～11)的Fe(NO3)3与Ni(NO3)2的混合物。

[0017] 上述的制备方法中，优选地，所述漆酶溶液中漆酶的初始浓度为0.4mg/ml或1.0mg/ml，所述漆酶溶液的pH值为4.0，所述振荡的转速为100rpm，所述振荡的时间为3h。

[0018] 本发明的固定化漆酶的制备方法中，漆酶的固定化时间，漆酶溶液的pH值，以及漆酶溶液中的漆酶初始浓度对固定化漆酶的制备有着重要的影响，我们以不同固定化条件下的载体吸附酶量和固定化酶活性作为确定标准，通过以下实验得到本发明的固定化漆酶的制备方法中的工艺参数。

[0019] 1.固定化时间范围的确定

[0020] 取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有40mg漆酶的磷酸缓冲液中(浓度为50mM，pH值为4.0)，于30℃下以100rpm的速度振荡15min～420min，磁性分离后用缓冲液清洗数次；用福林酚试剂法(lowry法)分别测定固定前缓冲溶液中漆酶量及固定后缓冲液中剩余的漆酶量，计算不同时间内单位载体吸附的漆酶量，得到的结果如表1所示；由表1可知，单位载体吸附漆酶量随时间增长不断增高，但在3h后吸附漆酶量达到平衡，因此，适宜的固定化时间范围为3h以上；考虑到随着时间延长，漆酶活损失增加，因此，上述技术方案中确定的优选振荡固化时间为3h～7h，最佳的固定化时间为3h。

[0021] 表1：不同振荡时间下载体吸附漆酶量

[0022]时间(min) 15 30 60 120 180 300 420
吸附漆酶量(mg/g) 56.7 116.7 163.3 183.3 216.7 220 223.3[0023] 2.pH值范围的确定

[0024] 调节柠檬酸缓冲液pH值为3.0～4.0，磷酸缓冲液pH值为5.0～8.0；取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有40mg漆酶的不同pH值的缓冲液中(浓度50mM)，于30℃下以100rpm的速度振荡3h，磁性分离后用缓冲液清洗数次；用紫外分光光度计测定固定化漆酶氧化2，2-连氮-二(3-乙基并噻-6-磺酸)(ABTS)吸光度在420nm处的变化，得到的固定化漆酶的相对活性情况如表2所示；由表2可知，固定化漆酶的相对活性在pH值为3.0～6.0时较高。因此，上述技术方案中优选的pH值范围为3.0～6.0，最佳pH值为
4.0，此时相对活性最高。

[0025] 表2：不同pH值条件下制得的固定化漆酶的相对活性

[0026]pH值 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
相对活性(％) 58.9 100 69.8 62.5 39.2 32.9

[0027] 3.初始漆酶浓度范围的确定

[0028] 取40mg磁性介孔碳作为载体，加入100mL装有10mg～400mg漆酶的磷酸缓冲液中(浓度为50mM，pH值为4.0)，于30℃下以100rpm的速度振荡3h，磁性分离后用缓冲液清洗数次；分别测定不同漆酶初始浓度的条件下，载体吸附漆酶量、固定化漆酶的相对活性以及固定化漆酶的酶活性回收率(即活性恢复R，活性恢复R按以下公式计算得来：R(％)＝(Ai/Af)×100)；其中，Ai表示固定化漆酶的活性，Af表示同等质量的游离漆酶的活性)，测得的结果如表3所示，由表3可知，载体吸附漆酶量随着初始漆酶浓度增加而不断增长，而在0.4mg/ml～2.0mg/ml初始漆酶浓度条件下制备的固定化漆酶的相对活性较高，但在0.1mg/ml～1.0mg/ml初始漆酶浓度范围内，固定化漆酶的活性恢复较高；因此，适宜的初始酶浓度范围为0.3mg/ml～1.0mg/ml，最佳初始漆酶浓度为0.4mg/ml左右或1.0mg/ml，此时漆酶吸附量和酶活性回收率均相对较高，且相对活性也维持在一个较高水平。

[0029] 表3：不同初始漆酶浓度下制得的固定化漆酶性质

[0030]

[0031] 与现有技术相比，本发明的优点是：

[0032] 1、作为本发明的固定化漆酶载体的磁性介孔碳材料，生物相容性好，其孔径主要集中分布在4nm和18nm两个峰值附近，这使得磁性介孔碳材料非常适用于漆酶等生物物质的固定，且用于环境污染物降解不会造成二次污染；

[0033] 2、作为本发明的固定化漆酶的载体的磁性介孔碳材料，其表面积大且吸附容量高，同时，该材料含有有序双峰介孔结构，这极大地提升了载体固定化容量，优化条件下固-1定化漆酶量可达491.67mg·g ；

[0034] 3、本发明采用物理吸附制备固定化漆酶，使得漆酶的活性恢复高，活性损失小，可重复使用，固定化后pH值的适应范围和温度的适应范围扩大，而且热稳定性也有较大提高；

[0035] 4、本发明的固定化漆酶，由于采用磁性介孔碳材料固定，因而易于分离操作，提高了稳定性和操控性，避免了过滤、抽滤等复杂步骤。

附图说明

[0036] 图1为实施例制得的磁性介孔碳的透射电镜图；

[0037] 图2为实施例制得的磁性介孔碳的氮气吸附-解吸曲线图；

[0038] 图3为实施例制得的磁性介孔碳的孔径分布曲线图；

[0039] 图4为实施例中的固定化漆酶和对照样(游离漆酶)在60℃下不同时间段的活性变化曲线图。

具体实施方式

[0040] 下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步地说明。

[0041] 实施例1：

[0042] 一种本发明的固定化漆酶，该固定化漆酶包括质量比为1∶2.5的磁性介孔碳和漆酶，固定化漆酶以磁性介孔碳为载体，漆酶通过物理吸附作用固定于载体磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道内嵌入有磁性纳米颗粒；本实施例中的磁性介孔碳为有序双峰介孔结构，其孔径分布的两个峰值分别出现在4nm和18nm。

[0043] 一种上述固定化漆酶的制备方法，包括以下步骤：

[0044] (1)制备磁性介孔碳：(a)先将4.0g嵌段共聚物Pluronic P123(Sigma公司生产，分子量为5800)置于160ml浓度为1.54M的HCl中，置于35℃水浴中搅拌直至溶解，然后逐滴加入8.5g正硅酸乙酯(TEOs)，将得到的混合物在35℃下搅拌20h，再将混合液转移至反应釜中，在140℃下水热反应24h，得到白色沉淀，将白色沉淀洗涤至中性后过滤、室温下风干，干燥后得到白色粉末；(b)为了去除多余的模板剂(即嵌段共聚物Pluronic P123)，将上述得到的白色粉末放入箱式炉中，控制升温速率为1℃/min，在550℃空气中煅烧4h，模板剂被脱除后，经研磨即得介孔硅模板(SBA-15白色粉末)；(c)将1.5mmol金属硝酸盐(0.75mmolFe(NO3)3·9H2O及0.75mmol Ni(NO3)2·6H2O)溶解于0.5ml乙醇中，在搅拌下加入1ml糠醇，形成多元溶液，抽取1.4ml多元溶液，用初湿浸渍法逐滴渗透到1.2g的SBA-15中，通过搅拌使溶液与颗粒混合均匀，然后在80℃的空气中对渗透有多元溶液的介孔硅模板固化10h以使糠醇转化为聚合糠醇，常温下干燥后得到复合物；(d)将步骤(c)得到的复合物在N2中于900℃的温度下热处理2h以碳化糠醇，控制升温速率为2℃/min，同时将金属氧化物还原成合金，然后用加热至80℃～90℃的浓度为2M的NaOH溶液洗涤两次，移除复合物中的硅模板，再对移除硅模板后的复合物过滤、清洗至中性，70℃下干燥，得到磁性介孔碳。

[0045] 将制得的磁性介孔碳进行透射电镜成像，得到如图1所示的透射电镜图，由图1可知，图中有序条带清晰可见，表明磁性介孔碳的有序介孔结构未经破坏，同时，大范围分散在孔道内部、表面的黑点则为磁性介孔碳的磁性纳米颗粒；将制得的磁性介孔碳进行N2吸附-解析实验，在ASAP2020M+C全自动比表面积分析仪上进行，得到如图2所示的吸附-解吸等温线，图中的两个滞回环表明了磁性介孔碳中两种介孔结构的存在；用BET方法计算2
磁性介孔碳的比表面积，得出磁性介孔碳的比表面积为1058.7m/g；用BJH模型估测磁性介孔碳的总粒径分布，得到如图3所示的粒径分布图，由图3可知，磁性介孔碳的孔径分布峰值主要出现为4nm附近和18nm附近，这表明本实施例的磁性介孔碳非常适宜于漆酶的固定；测得磁性介孔碳的饱和磁化值为4.1emu/g，表明磁性介孔碳的磁性可应用于磁性分离；

[0046] (2)固定漆酶：将4mg步骤(1)得到的磁性介孔碳加入含漆酶的柠檬酸缓冲液中，其中，漆酶初始浓度为1.0mg/ml，含漆酶的柠檬酸缓冲液pH值为4.0，使磁性介孔碳分散于含漆酶的柠檬酸缓冲液中，将混合液置于摇床中于25℃温度下以100rpm速度振荡3h以达到吸附平衡，然后用pH值为4.0的柠檬酸缓冲液洗涤数次，磁性分离后，经-40℃冷冻真空干燥，得到固定化漆酶(制得的固定化漆酶在-4℃下保存)。

[0047] 以游离漆酶作为对照样，对上述制得的固定化漆酶和游离漆酶分别进行pH值的适应范围，温度的适应范围和热稳定性进行对比实验。

[0048] 对比实验以对照样游离漆酶和固定化漆酶的酶活力作为标准，其中，游离漆酶活力的测定采取ABTS为底物，取2.9ml以0.1M柠檬酸缓冲液为介质的ABTS(0.5mM)，加入0.1ml稀释后的漆酶液启动反应，用紫外分光光度计(UV-2250，SHIMADZU Corporation，日本)测定反应体系3min内420nm处的吸光度变化，每分钟转化1μmol的ABTS所需的酶量为一个酶活单位(U)；固定化漆酶活力的测定则是将1mg固定化酶加入4.8ml柠檬酸缓冲液及0.2ml的ABTS(12.5mM)的混合溶液中启动反应，30s后加入19％的硫酸溶液终止反应，磁性分离后测定上清液在420nm处的吸光度。

[0049] 1、pH值的适应范围

[0050] 分别测定不同pH条件下游离漆酶和固定化漆酶的活性，得到的相对活性变化情况如表4所示，由表4可知，固定化漆酶的最适pH值相对游离漆酶略有上升，表明固定化漆酶中的固定化载体改变了漆酶所处的微环境；游离漆酶在pH值为2.2～4时活性较高，但pH值较高时，尤其是pH值为7和8时，游离漆酶几乎失去活性；固定化漆酶的适宜pH值较游离漆酶广泛，在pH值为2～6间均能保持较高活性，在较高pH值时仍保持一定活性；因此，与游离漆酶相比，本实施例制得的固定化漆酶受溶液pH值的影响不显著，具有较好的pH值适应范围。

[0051] 表4：游离漆酶和固定化漆酶在不同pH条件下的相对活性

[0052]

[0053] 2、温度的适应范围

[0054] 分别测定不同温度下游离漆酶和固定化漆酶的活性，得到的相对活性变化情况如表5所示，由表5可知，游离漆酶与固定化漆酶具有相同的最适温度，但固定化漆酶较游离酶固定化酶在较高温度下具有更高活性，表明固定化漆酶具有更广泛的温度适应范围；因此，与游离漆酶相比，本实施例制得的固定化漆酶更有利于适应于实际应用时温度变化的复杂环境。

[0055] 表5：游离漆酶和固定化漆酶不同温度条件下的相对活性

[0056]

[0057] 3、热稳定性

[0058] 将游离漆酶和固定化漆酶分别置于pH为4.0的柠檬酸缓冲溶液中，于60℃下保温；然后每隔30min，取出一定量的固定化漆酶及游离漆酶，检测其氧化ABTS的活性，得到的不同时间段固定化漆酶及游离漆酶的相对活性如图4所示，由图4可知，固定化漆酶的失活速度明显远低于游离漆酶的失活速度；保温2h时，固定化漆酶的相对活性仍能维持75％左右，而游离漆酶的相对活性不足20％；保温4h后，两者相对活性相差约60％；由此可见，本实施例制得的固定化漆酶热稳定性显著增长，表明固定化漆酶中的载体磁性介孔碳能提供更适宜环境抵抗热变化，因此，固定化漆酶中的载体磁性介孔碳有利于增强热稳定性。

[0059] 最后，对本实施例制得的固定化漆酶进行重复利用性实验：将固定化漆酶在25℃下与0.5mMABTS反应，再用柠檬酸缓冲溶液(0.1M，pH4.0)冲洗分离出的固定化漆酶，固定化漆酶再次与0.5mMABTS反应，测试固定化漆酶的重复使用性；当反应循环进行10批次后，固定化漆酶的酶活仍能超过50％，可见本实施例制得的固定化漆酶具有一定的重复利用性。

[0060] 由以上可见，本实施例制得的固定化漆酶具有较宽的pH值的适应范围和温度的适应范围，并具有良好的热稳定性，同时也有一定的重复利用性。

[0061] 利用实施例制得的固定化漆酶去除水体中的苯酚的方法，包括以下步骤：先调节待处理的含酚水体的pH值为6.0和酚类初始浓度为2.0mM，再将含酚水体放入往复振荡培养箱中，进行充分振荡，使溶液中的溶解氧饱和，然后在含酚水体中加入上述制得的固定化漆酶，每毫升含酚水体中加入的固定化漆酶为0.6mg，将往复振荡培养箱中的温度控制在30℃，以100rpm的速度对混合液进行振荡反应12h，充分反应后再通过磁性分离器将固定化漆酶与水体磁性分离，将分离后的水体调节至中性后排放，完成对水中酚类污染物的去除。

[0062] 按照相同的步骤，对含对氯苯酚水体中的对氯苯酚进行去除。

[0063] 对上述经固定化漆酶处理的含酚水体中的酚类污染物浓度进行检测，测定结果表明，振荡反应12h时，含苯酚水体中约78.0％的苯酚被去除，含对氯苯酚水体中约85.0％的对氯苯酚被去除，可见，利用基于磁性介孔碳固定的漆酶对水体中的酚类污染物有很好的去除效果。