家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法转让专利
申请号 : CN201110123583.3
文献号 : CN102286529B
文献日 : 2012-11-14
发明人 : 钟伯雄 , 周继勇 , 庄兰芳 , 阮系真 , 危浩 , 颜焰
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明公开了一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。是先构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白RVGP的载体pBSer1RVGP-A3EGFP质粒和pBFibLRVGP-A3EGFP质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这2种质粒分别与能够提供转座酶的辅助质粒一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因导入到家蚕的基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，育成家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞或两部分丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。
权利要求 :
1.一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
（1）采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的载体
pBSer1RVGP-A3EGFP质粒和pBFibLRVGP-A3EGFP质粒；
所述的pBSer1RVGP-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含 piggyBac转座子的2个转座臂PBL和PBR，包含 2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及狂犬病病毒糖蛋白基因的表达框Ser1 Promoter +His+ RVGP +SV40，依靠家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter具有中部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕中部丝腺细胞生物反应器，实现在中部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白；
所述的pBFibLRVGP-A3EGFP质粒是以pBSer1RVGP-A3EGFP质粒为基础，用家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter替换家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter构建而成，依靠家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter具有后部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕后部丝腺细胞生物反应器，实现在后部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白；
（2）采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒或pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为G1代，在G1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为G2代，G2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经1-3代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕中部丝腺生物反应器和后部丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种；
（3）在中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，在后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，受精卵孵化后饲养至成虫，自交续代为GG1代，在GG1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为GG2代，G G2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种； （4）将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种杂交为F1代，在F1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为F2代，F2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。
2.根据权利要求1所述的一种家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法，其特征在于：所述的辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶trans基因表达框A3 Promoter+ trans，以提供转座酶。
说明书 :
家蚕丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种利用转基因技术构建家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，使家蚕中部、后部、或中后两部分丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。
背景技术
[0002] 狂犬病是当今世界公共卫生中有严重威胁的传染病之一。狂犬病是由狂犬病病毒感染恒温动物或人引起，导致动物或者人急性致死性脑脊髓炎，临床特征主要表现为狂燥不安、行为反常、攻击性、进行性麻痹和最终死亡，是一种人兽共患传染病。其特点是潜伏期长，致死率高，几乎100%死亡。
[0003] 狂犬病病毒属于弹状病毒科弹状病毒属，是单链不分节负链RNA病毒，病毒外形呈弹状，一端纯圆，一端平凹，有囊膜，内含衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。
[0004] 狂犬病病毒的基因组全长约12kb，基因组的3’端至5’端排列着N、P、M、G、L 5个结构基因，各基因序列的长度分别为1424、991、805、1675和6475bp，它们分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L或RNA依赖的 RNA转录酶蛋白)。
[0005] 狂犬病病毒有两种主要抗原：一种是病毒外膜上的糖蛋白抗原，它能与乙酰胆碱受体结合，表现出神经毒性，能使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体；另一种为内层的核蛋白抗原，它使体内产生补体结合抗体和沉淀素。
[0006] G蛋白是狂犬病病毒表面蛋白，可介导病毒的入侵，决定病毒的致病性和组织嗜性。G蛋白识别的宿主细胞表面受体包括烟碱型乙酰胆碱受体、神经细胞黏附因子和p75神经营养因子受体等。无G基因的狂犬病病毒不能经过突触传播。G蛋白分布到宿主细胞的表面可能导致离子通道紊乱，进而影响神经的生理功能，导致神经功能性损伤，是病毒引起机体病理变化的基础。G蛋白由524个氨基酸残基组成，相对分子质量为 67Da，分为信号肽、膜外区、跨膜区和膜内区。G蛋白基因转录翻译后，在内质网上进行糖基化修饰，并切去N端19个氨基酸残基信号肽后成为成熟的G蛋白，成熟后的糖蛋白具有505个氨基酸残基，分为3个区域：膜外区即抗原区(第1-439位)，位于病毒颗粒包膜的表面；穿膜区即跨膜区(第440-461位)，功能为把糖蛋白固定在病毒双脂膜上；膜内区(第462-505位)，位于病毒包膜内表面，提供M蛋白和N蛋白相互作用的位点。糖基化对于G蛋白正确的空间折叠、稳定性、加工运输、抗原性、免疫原性、致病性和毒力都有极其重要影响。不同毒株糖基化的数目、效率和位点不同，第319位Asn糖基化位点广泛存在于所有已知的多种狂犬病病毒，而第247位 Asn的N糖苷能加强第319位Asn的糖基化，产生更多的寡甘露糖或高甘露糖型糖链，提高糖基化程度，提高了病毒对细胞的识别能力，进而影响到病毒的致病力。 [0007] 转基因家蚕中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器是在家蚕中部丝腺、后部丝腺中特异表达外源基因的转基因动物表达系统。家蚕生长周期短，50天左右可完成一个世代，每个雌蛾可产卵约400粒；家蚕经过长达四千多年的人工驯养、选育，性情温顺，已完成丧失飞翔逃逸能力，而在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力；合成的蛋白可以随蚕丝蛋白一起分泌到体外，蚕丝蛋白主要由3种丝素蛋白和3种丝胶蛋白构成，成分简单。所以，转基因家蚕丝腺生物反应器构建容易，运行安全，表达外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白纯化方便，只需要通过饲养转基因家蚕，就可以非常方便地维持表达系统的延续，是一种非常有价值的表达系统,具有广阔的实用前景。
[0008] 本发明是利用转基因家蚕技术将狂犬病病毒糖蛋白基因导入家蚕基因组内，并在家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞、或两部分的丝腺细胞中特异表达，开发出合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的家蚕，为利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、经济和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基础。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种利用转基因技术构建中部丝腺生物反应器、后部丝腺生物反应器、以及丝腺生物反应器三种生物反应器，使家蚕中部丝腺细胞、后部丝腺细胞或两部分丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的方法。培育成功的生产狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种，可以提高蚕农养蚕经济效益，为利用狂犬病病毒糖蛋白研制更加安全、高效、经济和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基础。
[0010] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下：
[0011] （1）采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的载体pBSer1RVGP-A3EGFP质粒和pBFibLRVGP-A3EGFP质粒。
[0012] （2）采 用 显 微 注 射 转 基 因 家 蚕 方 法 将pBSer1RVGP-A3EGFP质 粒 或pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为G1代，在G1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为G2代，G2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经1-3代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕中部丝腺生物反应器和后部丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。
[0013] （3）在中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，在后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种的基础上，采用显微注射转基因家蚕方法将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒与能够提供转座酶trans的辅助质粒一起导入该家蚕品种受精卵内，受精卵孵化后饲养至成虫，自交续代为GG1代，在GG1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为GG2代，GG2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。
[0014] （4）将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种杂交为F1代，在F1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为F2代，F2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种。
[0015] 所述的pBSer1RVGP-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含 piggyBac转座子的2个转座臂PBL和PBR，包含 2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40，以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及狂犬病病毒糖蛋白基因的表达框Ser1 Promoter +His+ RVGP +SV40，依靠家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter具有中部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕中部丝腺细胞生物反应器，实现在中部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白。
[0016] 所述的pBFibLRVGP-A3EGFP质粒是以pBSer1RVGP-A3EGFP质粒为基础，用家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter替换家蚕丝胶蛋白1启动子Ser1 Promoter构建而成，依靠家蚕丝素蛋白轻链启动子Fib-L Promoter具有后部丝腺细胞组织特异性启动基因表达的功能，创制家蚕后部丝腺细胞生物反应器，实现在后部丝腺细胞表达狂犬病病毒糖蛋白。
[0017] 所述的辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶trans基因表达框A3 Promoter+ trans，以提供转座酶。
[0018] 本发明具有的有益效果是：
[0019] 可以借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕中部丝腺细胞特异地合成分泌狂犬病病毒糖蛋白，为提高狂犬病病毒糖蛋白的生产效率、降低生产成本、并研制更加安全、高效、经济和使用方便的人用狂犬病新型疫苗奠定基础。
附图说明
[0020] 图1是家蚕中部丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的pBSer1RVGP-A3EGFP载体结构图。
[0021] 图2是家蚕后部丝腺细胞合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的pBFibLRVGP-A3EGFP载体结构图。
[0022] 图3是能够提供转座酶的辅助质粒结构图。
具体实施方式
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0024] 实施例1：
[0025] 将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒（图1）及能够提供转座酶的辅助质粒（图3）按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.5µg/µl，质粒溶解在0.5mM、pH7.0含有5mM氯化钾的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后8小时以内的受精卵内，导入总体积为15nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85%湿度、12h光照条件下饲养至成虫，自交续代（G1代）。
在转基因实验的G1代小蚕期，通过荧光显微镜（Olympus，SZX12，日本）观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕2蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。将蚕饲养至成虫自交产卵续代（G2）。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，经自交3代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕。经此创制家蚕中部丝腺细胞生物反应器，育成中部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，定名为SG2、SG3。
在转基因实验的G1代小蚕期，通过荧光显微镜（Olympus，SZX12，日本）观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕2蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。将蚕饲养至成虫自交产卵续代（G2）。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，经自交3代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕。经此创制家蚕中部丝腺细胞生物反应器，育成中部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种，定名为SG2、SG3。
[0026] 取SG2、SG3品种的基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增RVGP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示如下：
[0027] 狂犬病病毒糖蛋白基因在家蚕基因组中的插入位点鉴定
[0028]品系染色体 序列片段 基因或间隔区 左侧基因组序列 载体 右侧基因组序列SG2 Chr.22 Bm_scaf69 间隔区 AAAAGCATTACTTTAA piggyBac TTAAAGAATCACGTAGSG3 Chr.17 Bm_scaf33 间隔区 TAAGTTTTAATTTTAA piggyBac TTAACTGTACGTAGC[0029] 提取蚕丝蛋白为材料，采用Western blot分析转基因家蚕狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。经鼠抗狂犬病病毒糖蛋白MAb作一抗的分析，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
[0030] 研究结果证明RVGP基因已插入到家蚕基因组第22染色体和第7染色体的基因间隔区，并获得了稳定的遗传和表达，已育成中部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。
[0031] 实施例2：
[0032] 将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒（图2）及能够提供转座酶的辅助质粒（图3）按2:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.4µg/µl，质粒溶解在0.5mM、pH7.0含有5mM氯化钾的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入丝胶蚕产卵后8小时以内的受精卵内，导入总体积为20nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85%湿度、12h光照条件下饲养至成虫，自交续代（G1代）。在转基因实验的G1代小蚕期，通过荧光显微镜（Olympus，SZX12，日本）观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。将蚕饲养至成虫自交产卵续代（G2）。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，自交续代，经自交1代选择留种，在小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕。经此创制家蚕后部丝腺细胞生物反应器，育成后部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、且狂犬病病毒糖蛋白含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种，定名为FG1。
[0033] 取FG1家蚕基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增RVGP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示如下：
[0034] 狂犬病病毒糖蛋白基因在家蚕基因组中的插入位点鉴定
[0035]品系染色体 序列片段 基因或间隔区 左侧基因组序列 载体 右侧基因组序列FG1 Chr.22 Bm_scaf69 间隔区 AAAACTAATTTAA piggyBac TTAAAGTAATGCTTCT[0036] 提取FG1蚕丝蛋白为材料，采用Western blot分析转基因家蚕狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。经鼠抗狂犬病病毒糖蛋白MAb作一抗的分析，结果得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。
[0037] 研究结果证明RVGP基因已插入到FG1家蚕基因组第22染色体的基因间隔区中，并获得了稳定的遗传和表达，已育成后部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。
[0038] 实施例3：
[0039] 将pBSer1RVGP-A3EGFP质粒（图1）及能够提供转座酶的辅助质粒（图3）按2:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.5µg/µl，质粒溶解在0.5mM、pH7.0含有5mM氯化钾的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入上述后部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、且狂犬病病毒糖蛋白含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种FG1产卵后8小时以内的受精卵内，导入总体积为25nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85%湿度、12h光照条件下饲养至成虫，自交续代为（GG1代）。在转基因实验的GG1代小蚕期，通过荧光显微镜（Olympus，SZX12，日本）观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。将蚕饲养至成虫自交产卵续代（GG2）。自第GG2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，经自交2代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕。经此创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部和后部丝腺细胞都能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、且狂犬病病毒糖蛋白含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种，定名为SFG1。
[0040] 取SFG1家蚕基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增RVGP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示如下：
[0041] 狂犬病病毒糖蛋白基因在家蚕基因组中的插入位点鉴定
[0042]品系 染色体 序列片段 基因或间隔区 左侧基因组序列 载体 右侧基因组序列原FG1Chr.22 Bm_scaf69 间隔区 AAAACTAATTTAA piggyBac TTAAAGTAATGCTTCT新 chr11 Bm_scaf42 间隔区 CGAATCTTAAATTTAA piggyBac TTAAATTTAAAATGTA[0043] 研究结果证明在FG1原有的染色体22的插入位点的基础上，增加了1个新的RVGP基因插入位点，此为新导入的pBSer1RVGP-A3EGFP质粒的插入位点，位于FG1家蚕基因组第
11染色体的基因间隔区中，并获得了稳定的遗传。
11染色体的基因间隔区中，并获得了稳定的遗传。
[0044] 提取SFG1家蚕的丝胶蛋白和丝素蛋白为材料，分别采用Western blot分析SFG1转基因家蚕狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。经鼠抗狂犬病病毒糖蛋白MAb作一抗的分析，结果都得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。研究结果证明RVGP基因获得了稳定的遗传和表达，已育成中部丝腺细胞和后部丝腺细胞都能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。
[0045] 实施例4：
[0046] 将pBFibLRVGP-A3EGFP质粒（图2）及能够提供转座酶的辅助质粒（图3）按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为0.45µg/µl，质粒溶解在0.5mM、pH7.0含有5mM氯化钾的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入上述中部丝腺细胞能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、且狂犬病病毒糖蛋白含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种SG2产卵后8小时以内的受精卵内，导入总体积为15nl。将显微注射的蚕卵在25℃、85%湿度、12h光照条件下饲养至成虫，自交续代为（GG1代）。在转基因实验的GG1代小蚕期，通过荧光显微镜（Olympus，SZX12，日本）观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm～490nm，发射波长为510 nm～550 nm。将蚕饲养至成虫自交产卵续代（GG2）。自第GG2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，经自交2代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕。经此创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部和后部丝腺细胞都能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、且狂犬病病毒糖蛋白含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种，定名为SFG2。
[0047] 取SFG2家蚕基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增RVGP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示如下：
[0048] 狂犬病病毒糖蛋白基因在家蚕基因组中的插入位点鉴定
[0049]品系 染色体 序列片段 基因或间隔区 左侧基因组序列 载体 右侧基因组序列原SG2Chr.22 Bm_scaf69 间隔区 AAAAGCATTACTTTAA piggyBac TTAAAGAATCACGTAG新 Chr.23 Bm_scaf22 间隔区 ATCTTTCTAGGGTTAA piggyBac TTAATAGAACACATTC[0050] 研究结果证明在SG2原有的染色体22的插入位点的基础上，增加了1个新的RVGP基因插入位点，此为新导入的pBFibLRVGP-A3EGFP质粒的插入位点，位于SG2家蚕基因组第
23染色体的基因间隔区中，并获得了稳定的遗传。
23染色体的基因间隔区中，并获得了稳定的遗传。
[0051] 提取SFG2家蚕的丝胶蛋白和丝素蛋白为材料，分别采用Western blot分析SFG2转基因家蚕狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。经鼠抗狂犬病病毒糖蛋白MAb作一抗的分析，结果都得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。研究结果证明RVGP基因获得了稳定的遗传和表达，已育成中部丝腺细胞和后部丝腺细胞都能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。
[0052] 实施例5：
[0053] 将中部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种SG3，与后部丝腺细胞能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种FG1杂交，获得F1代，在F1代转基因家蚕的小蚕期，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫自交续代为F2代，F2代以后均采用蛾区育，成虫自交续代，再经2代选种，每代在小蚕期采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法，以表达EGFP标志基因为留种筛选标志，创制家蚕丝腺生物反应器，育成中部丝腺细胞、后部丝腺两部分细胞都能够特异性合成分泌狂犬病病毒糖蛋白、基因纯合的转基因家蚕新品种SFG3。
[0054] 取SFG3品种的基因组DNA为模板，采用Inverse PCR扩增RVGP基因在家蚕基因组中的插入片段，对扩增片段进行克隆、测序和染色体定位分析，结果显示如下：
[0055] 狂犬病病毒糖蛋白基因在家蚕基因组中的插入位点鉴定
[0056]品系 染色体 序列片段 基因或间隔区 左侧基因组序列 载体 右侧基因组序列原SG3Chr.17 Bm_scaf33 间隔区 TAAGTTTTAATTTTAA piggyBac TTAACTGTACGTAGC原FG1Chr.22 Bm_scaf69 间隔区 AAAACTAATTTAA piggyBac TTAAAGTAATGCTTCT[0057] 研究结果证明，原来的SG3在染色体17的插入位点及FG1在染色体22的插入位点都已共同存在于新品种SFG3品种中，并获得了稳定的遗传。
[0058] 提取SFG3家蚕的丝胶蛋白和丝素蛋白为材料，分别采用Western blot分析SFG3转基因家蚕狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。经鼠抗狂犬病病毒糖蛋白MAb作一抗的分析，结果都得到与预期分子量大小相符的特异性蛋白条带。研究结果证明RVGP基因获得了稳定的遗传和表达，已育成中部丝腺细胞和后部丝腺细胞都能够合成分泌狂犬病病毒糖蛋白的转基因家蚕新品种。