一种半连续发酵生产生物丁醇的方法

摘要

一种半连续发酵生产生物丁醇的方法，属于生物工程技术领域。本发明涉及半连续发酵方法，以糖丁酸梭菌（Clostridiumsaccharobutylicum）DSM13864发酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木质纤维素水解糖浆等糖质原料制备生物丁醇过程中的应用。本发明方法可获得较高的溶剂产量和溶剂生产强度；只需一次灭菌和接种，节约了反复洗罐、灭菌等非发酵时间，缩短了生产周期，大大提高了设备的利用率；且发酵设备简单，易于自动化控制，适用于工业化。

权利要求

1.一种半连续发酵生产生物丁醇的方法，其特征在于先经种子培养，然后整个发酵过程为二级半连续发酵：一级罐提供菌体，二级罐发酵生产生物丁醇溶剂；步骤为：（1）种子培养：

以糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum） DSM 13864为发酵生产生物丁醇的菌种；

种子培养基RCM，每L中含：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖

5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg，pH 6.5；

将菌种孢子液转接于种子培养基中，置于真空干燥器中抽真空0.065MPa，种子培养条件为37℃，培养时间12-18 h；

（2）半连续发酵

半连续发酵过程分为二级：一级罐1-2个提供菌体，二级罐3-5个发酵生产生物丁醇溶剂；

一级补料培养基SSM1，每L中含：总糖2 %，CaCO3 3.2 g，(NH4)2SO4 2 g，K2HPO4 0.5 g，玉米浆干粉20g，MnSO4·H2O 0.01g，pH 6.7；

二级补料培养基SSM2，每L中含：总糖8 %，CaCO3 3.2 g，(NH4)2SO4 2 g，K2HPO4 0.5g，玉米浆干粉10g，MnSO4·H2O 0.01g，pH 6.4；

培养温度为37℃；一级罐与二级罐之间为串联，二级罐之间为并联；

(a) 在一级罐中培养获得菌体：培养基即为一级补料培养基SSM1，将种子液按1%-20%的接种量接种于一级发酵罐中，发酵温度为37℃，当菌体浓度达OD660为7.54-8.18时，将

10%-90%体积的发酵液转移至其中一个二级发酵罐中，立即向这个二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基SSM2；同时在一级发酵罐中补加SSM1，使液体体积达未转移前相同；

继续重复发酵；

当一级发酵罐中菌体浓度再次达OD660为7.54-8.18时，将10%-90%体积的发酵液转移至另一个二级发酵罐中，立即向这第二个二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基SSM2；同时在一级发酵罐中补加一级补料培养基SSM1，使液体体积达未转移前相同，在相同发酵条件下进行新一轮的发酵； (b) 当一级罐培养至菌体浓度达OD660为7.54-8.18时，将一级罐中10%-90%的菌液转移至二级罐中；向二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基SSM2，一级和二级发酵温度均为37℃；

(c) 在一级罐和二级罐中分别补入与转移菌液等体积的新鲜一级补料培养基SSM1、二级补料培养基SSM2，继续培养；

(d) 当二级发酵罐中总溶剂：丙酮、乙醇和丁醇为14.00-19.20 g/L时，放出二级发酵罐中的全部发酵液；

(e)以上述(b)－(d) 操作步骤重复进行，半连续发酵稳定循环达26次；

半连续发酵中所用总糖为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或木质纤维素水解糖浆，作为半连续发酵生产生物丁醇的主要碳源。

说明书

一种半连续发酵生产生物丁醇的方法

技术领域

[0001] 本发明提供了一种半连续发酵生产生物丁醇的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及半连续发酵方法在糖丁酸梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864发酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木质纤维素水解糖浆等糖质原料制备生物丁醇过程中的应用。

背景技术

[0002] 正丁醇（butanol）习惯上简称丁醇，化学式为C4H10O，无色透明液体，具有强烈的气味，稍溶于水，有毒、易燃，属二级易燃危险品。丁醇是一种重要的C4平台化合物，也是一种战略性产品，用途非常广泛，可用于邻苯二甲酸正丁酯、脂肪二元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等的合成；可经过氧化生产丁醛或丁酸；还可用作油脂、医药和香料的提取溶剂以及醇酸树脂的添加剂等。此外，可用作有机染料和印刷油墨的溶剂、脱蜡剂。我国丁醇主要用于生产醋酸丁酯、丙烯酸丁酯、邻苯二甲酸二丁酯及医药中间体等。

[0003] 丁醇还是一种重要的具有极大潜力的新型生物燃料，无论是燃烧值还是辛烷值丁醇都与汽油接近。同时，丁醇可按高比例与汽油进行混合作为燃料，而不需要对汽车进行改装；比使用汽油与乙醇的混合燃料更实惠。丁醇的低蒸汽压力和疏水性，使得丁醇的运输依靠现有的汽油输送管道及分销渠道成为可能，这充分表明丁醇是理想的汽油替代燃料。

[0004] 国内外丁醇的生产主要通过石油化工合成获得。近年来，随着石油化工方法生产丁醇的成本大幅提高，给发酵法生产生物丁醇带来了新的机遇。在中国，传统工业化发酵生产丙酮丁醇主要是以玉米等粮食类淀粉质原料为底物(Appl Microbiol Biotechnol2009, 83:415-423)，这不仅提高了发酵成本而且危及国家粮食安全。为了解决这一难题，近年来许多高校和研究机构开始用糖蜜(J Mol Microbiol Biotechnol 2000,
2:115-124,)、木质纤维素水解液(Biomass Bioenergy 2010, 34:559-565)等价廉的糖质原料来代替粮食淀粉质原料发酵生产丙酮丁醇。糖蜜是制糖工业的副产品，其中主要含有大量可发酵糖(主要是蔗糖)，因而是发酵工业中较廉价的碳源原料。目前，用糖蜜来发酵生产丙酮丁醇的方法主要以分批发酵为主，也有补料分批的研究。Qureshi等人在
80g/L的糖蜜中加入25.3 g/L葡萄糖，用C. beijerinckii BA101进行分批发酵，分批总溶剂为22.8 g/L(J Ind Microbiol Biotechnol 2001, 26:290-295)；Syed等人用诱变菌C. acetobutylicum MEMS-7发酵6%的糖蜜，丁醇分批产量达18.3 g/L (Turk J Biochem
2008, 33:25-30,)；裴建新等人从土壤中筛选出两株C. beijerinckii，用糖蜜进行分批发酵，最高总溶剂为11.33 g/L (酿酒科技 2010, 5(191):32-35)。范俊辉等人从土壤中分离出1株适合利用甜菜糖蜜发酵生产丁醇的丙酮丁醇梭菌 C. acetobutylicum 2N，以补料分批发酵方式降低底物抑制，33℃发酵48 h后，丁醇和总溶剂的浓度分别为14.15 g/L和
19.65 g/L，丁醇质量分数超过70％(生物加工过程 2010, 8(6):6-9)。

[0005] 目前，工业上还没有关于发酵甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木质纤维素水解糖浆等糖质原料糖蜜半连续发酵生产生物丁醇的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种半连续发酵生产生物丁醇的方法，为工业化发酵生产生物丁醇提供一种运行成本低、能源消耗低、生产强度高、易于自动化操作的半连续发酵生产新方法。

[0007] 本发明的技术方案：一种半连续发酵生产生物丁醇的方法，先经种子培养，然后整个发酵过程为二级半连续发酵：一级罐提供菌体，二级罐发酵生产生物丁醇溶剂；步骤为：

[0008] （1）种子培养：

[0009] 以糖丁酸梭菌（Clostridium saccharobutylicum ）DSM 13864为发酵生产生物丁醇的菌种，Clostridium saccharobutylicum DSM 13864购自德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）。

[0010] 种子培养基为RCM培养基(/L)：酵母膏0.5-5g，牛肉膏5-30g，蛋白胨2-20g，可溶性淀粉0-5g，葡萄糖2-10g，半胱氨酸盐酸盐0-5g，NaCl 2-10g，NaAc 2-10g，刃天青0.5-5mg，pH 5.5-7.5。

[0011] 将菌种孢子液转接于种子培养基中，置于真空干燥器中抽真空(0.065MPa)，种子培养条件为20-40℃，培养时间5-20 h。

[0012] （2）半连续发酵

[0013] 半连续发酵过程分为二级：一级罐（1-2个）提供菌体，二级罐（1-5个）发酵生产生物丁醇溶剂。

[0014] 一级补料培养基(SSM1)(/L)：总糖0.5%-5%，CaCO3 2-10 g，(NH4)2SO4 0.5-5 g，K2HPO4 0.2-2 g，玉米浆干粉5-30g，MnSO4·H2O 0-0.5g，pH 5.5-7.5。

[0015] 二级补料培养基(SSM2)(/L)：总糖4%-20%，CaCO3 2-10 g，(NH4)2SO4 0.5-5 g，K2HPO4 0.2-2 g，玉米浆干粉5-30g，MnSO4·H2O 0-0.5g，pH 5.5-7.5。

[0016] 一级罐为1-2个，二级罐为1-5个，一级罐培养时间为5-15 h，二级罐培养时间为8-30 h，培养温度为20-40℃。

[0017] 一级罐与二级罐之间为串联，二级罐之间为并联。

[0018] (a) 在一级罐中培养获得菌体：培养基即为一级补料培养基SSM1，将20-40℃培养5-20 h的种子液按1%-20%的接种量接种于一级发酵罐中，发酵温度为20-40℃，当菌体浓度达5.0-10.0（OD660）时，将10%-90%体积的发酵液转移至其中一个二级发酵罐中，立即向这个二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基(SSM2)，同时在一级发酵罐中补加一级补料培养基(SSM1)使液体体积达未转移前相同，开始发酵，一级和二级发酵温度均为20-40℃。

[0019] 当一级发酵罐中菌体浓度再次达5.0-10.0（OD660）时，将10%-90%体积的发酵液转移至另一个二级发酵罐中，立即向这个二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基(SSM2)，同时在一级发酵罐中补加一级补料培养基(SSM1)使液体体积达未转移前相同，在相同发酵条件下进行新一轮的发酵。

[0020] (b) 将一级罐中10%-90%的菌液转移至二级罐中；向二级发酵罐补加同等体积的二级补料培养基SSM2，一级和二级发酵温度均为20-40℃。

[0021] (c) 在一级罐和二级罐中分别补入与转移菌液等体积的新鲜一级补料培养基SSM1、二级补料培养基SSM2，继续培养。

[0022] (d)当二级发酵罐中总溶剂（丙酮、乙醇、丁醇）为14.00-19.20 g/L时，放出二级发酵罐中的全部发酵液。

[0023] (e) 待一级罐中菌体再次达到所需浓度，以上述(b)－(d) 操作步骤重复进行，半连续发酵稳定循环达26次。

[0024] 发酵所用糖为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或木质纤维素水解糖浆等作为半连续发酵生产生物丁醇的主要碳源。

[0025] 本发明的有益效果：本发明所使用的半连续发酵装置结构示意图如下：详见图1，该发酵装置包括1（或2）个一级罐、3（或1-5）个二级罐、1个一级补料罐和1个二级补料罐。一级罐与二级罐之间串联，3个二级罐之间为并联。与分批发酵相比，本发明的明显优势在于：可获得较高的溶剂产量和溶剂生产强度；只需一次灭菌和接种，节约了反复洗罐、灭菌等非发酵时间，缩短了生产周期，大大的提高了设备的利用率；且发酵设备简单，易于自动化控制，适用于工业化。

[0026] 以糖丁酸梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864半连续发酵生产生物丁醇，发酵原料为甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及木质纤维素水解糖浆等糖质糖蜜原料。半连续发酵可稳定进行26个循环，一级罐发酵时间为7 h，细胞浓度（OD660）维持在7.54至8.18。二级罐分批发酵时间为14-18 h，发酵可稳定持续205 h，平均总溶剂为15.27 g/L，14 h时的平均生产强度为1.05 g/L/h，糖平均消耗率达99.22%。在15和17个循环时，总溶剂最高分别达到18.50g/L和19.11 g/L。

附图说明

[0027] 图1 半连续发酵装置结构示意图。1、一级补料罐；2、二级补料罐；3、泵；4、止水夹；5、取样口；6、一级罐；7、二级罐。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] 以糖丁酸梭菌Clostridium saccharobutylicum DSM 13864为发酵生产生物丁醇菌种，以甘蔗糖蜜为发酵原料。

[0030] 种子培养基为RCM培养基(/L)：酵母膏3g，牛肉膏10g，蛋白胨10g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAC 3g，刃天青3mg，pH 6.5。10 mL试管种子培养基中转接1 mL菌种孢子液，置于真空干燥器中抽真空至压力为0.065 MPa，37℃培养12-18 h。

[0031] 一级补料培养基(SSM1)(/L)：总糖2%，CaCO3 3.2 g，(NH4)2SO4 2 g，K2HPO4 0.5 g，玉米浆干粉20g，MnSO4·H2O 0.01g，pH 6.7。

[0032] 二级补料培养基(SSM2)(/L)：总糖8%，CaCO3 3.2 g，（NH4）2SO4 2 g，K2HPO4 0.5 g，玉米浆干粉10g，MnSO4·H2O 0.01g，pH 6.4，121 ℃ 20 min灭菌。

[0033] 一级罐250 mL，装液量为200 mL；二级罐500 mL，装液量为300 mL；补料瓶均为4 L。

[0034] 一级罐为1个，二级罐为3个，3个二级罐之间为并联。

[0035] 以8%的接种量将培养好的种子液转移至一级罐中，立即补加新鲜一级补料培养基(SSM1)使发酵液体积为200 mL，于37℃培养12 h（菌浓为7.75 OD660）后，将150 mL一级发酵液泵至其中一个二级罐中，立即向这个二级罐中补加150 mL新鲜二级补料培养基(SSM2)，同时向一级罐中补加150 mL新鲜一级补料培养基(SSM1)，开始培养，一级和二级的发酵温度都为37℃。

[0036] 一级罐培养7 h（菌浓为7.59 OD660）后，再次将150 mL一级发酵液泵至二级罐中（另一个），立即向这个二级罐中补加150 mL新鲜二级补料培养基(SSM2)，同时向一级罐中补加150 mL新鲜一级补料培养基(SSM1)，开始新一轮的发酵，发酵条件同上。

[0037] 二级罐培养18 h后，抽出罐中全部发酵液，气相检测发酵液中的溶剂（丙酮、乙醇、丁醇）含量。

[0038] 由表１看出，以上操作重复进行，可稳定循环26次。一级罐发酵时间为7 h，细胞浓度（OD660）维持在7.54至8.18。二级罐分批发酵时间为14-18 h，发酵可稳定持续205 h，平均总溶剂为15.27 g/L，14 h时的平均生产强度为1.05 g/L/h，糖平均消耗率达99.22%。在15和17个循环时，总溶剂最高分别达到18.50g/L和19.11 g/L。

[0039] 表1. 半连续发酵生产生物丁醇

[0040]