强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法

摘要

强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法，在反应体系中添加共溶剂或表面活性剂改变反应介质的理化性质，提高底物在反应介质中的溶解度，提高酶的热稳定性及其对底物的立体选择性。该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，有利于工业化生产高纯度异槲皮苷。

权利要求

1.一种强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法，其特征在于步骤为：以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配置pH=7的0.3g/L的芦丁母液；在芦丁母液中按体积比

5%加入10g/Lα-L-鼠李糖苷酶液，加入四氢呋喃至体积浓度为2.5%，在40℃条件下120r/min振荡反应20h。

说明书

强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法

技术领域

[0001] 本发明属于酶法合成食品添加剂领域，具体涉及一种强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法。

背景技术

[0002] 现有技术：异槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose)，是自然界中非常罕见的一种具有显著的抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类化合物，是国际上各大医药食品公司竞相开发的高级食品添加剂、辅助药物或药物有效成分，也是国际上新型多功能食品添加剂EMIQ(Enzymatically Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology，2010，268(3)：213-218)。

[0003] 专利CN 101985639A介绍了异槲皮苷的制备方法主要有提取法和水解法两种：(1)异槲皮苷在自然界中的分布较少，其含量仅有几万分之一甚至是十万分之几，直接从自然界植物中提取难以制备异槲皮苷；(2)酸催化水解法的水解温度较高，使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，且芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得异槲皮苷(African Journal of Biotechnology，2011，
10(8)：1460-1466)。因此，以酶促水解芦丁公认是制备异槲皮苷的有效途径。即，以自然界分布广泛、来源丰富的芦丁为原料，经糖苷酶催化水解反应制备异槲皮苷，建立生物转化芦丁定向合成异槲皮苷的酶促水解工艺是今后规模化制备异槲皮苷的唯一选择。

[0004] 令人遗憾的是，生物合成异槲皮苷目前尚未实现工业化大规模应用，原因在于芦丁等大多天然糖苷底物溶解性差和α-L-鼠李糖苷酶活力较低等产业化难题。传统以水为溶剂的中糖苷酶催化的活力十分有限，而非水相介质具有显著增强酶催化效率的能力(Bioprocess and Biosystems Engineering.2009，32(6)：765-772)，如在水为介质的糖苷酶催化反应体系中添加共溶剂(Cosolvent)、表面活性剂(Surfactant)等改变反应介质理化性质的途径来增强酶促合成异槲皮苷的效率，即介质工程(Medium Engineering)手段改变反应介质与优化反应参数来强化异槲皮苷的生物合成过程。

[0005] 在糖苷酶催化反应中，一般只有与酶分子紧密结合的一层左右的必需水(Essential Water)分子对酶的催化活性是至关重要的。不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不相同的，并且对产物产生一些影响。有些情况下，在反应体系中加入适当的添加剂代替必需水，也有助于提高酶的柔性(Flexibility)，从而提高酶的立体选择性。特别是，添加适当的共溶剂或(和)表面活性剂的方法改变反应介质的理化性质，从而对酶促反应过程进行调控和强化。合适的共溶剂、表面活性剂添加到酶促反应体系，可以提高底物在反应体系中的溶解度，也可以促使酶具有更加严密的构型，具体表现在热稳定性的提高和对底物选择性的增强(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1996，3-6(1)：201-211；Bioresource Technology，2011，102(3)：2890-2896)。

[0006] 因此，本专利在酶促合成异槲皮苷的体系中添加共溶剂或表面活性剂来强化合成效率，该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷，为推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

[0007] 技术问题：针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法。该方法在酶促合成异槲皮苷的体系中添加共溶剂或表面活性剂，可大大强化合成效率。

[0008] 技术方案：

[0009] 一种强化酶法合成异槲皮苷的介质工程方法，包括酶促合成异槲皮苷的体系，该体系包括溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的芦丁母液，芦丁母液中含有α-L-鼠李糖苷酶液，上述体系中添加有共溶剂或表面活性剂，其中共溶剂的体积浓度为1～20％，表面活性剂的体积浓度为0.01～10％。

[0010] 配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度为0.01～1mol/L。

[0011] 配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH值为5～9。

[0012] 所述芦丁母液的浓度为0.01～1g/L。

[0013] 所述芦丁母液中按体积比1～50％加入α-L-鼠李糖苷酶液。

[0014] 所述芦丁母液中加入α-L-鼠李糖苷酶液的浓度为0.1～100g/L。

[0015] 所述共溶剂包括醇类、酯类、酮类、卤代烃和杂环化物，所述醇类为甲醇、乙醇或正丁醇，所述酯类为乙酸乙酯、乙酸丁酯或丙酸乙酯，所述酮类为丙酮或丁酮，所述卤代烃为一氯甲烷、二氯甲烷或氯仿，所述杂环化物为四氢呋喃、二甲基亚砜、吡啶或呋喃。

[0016] 所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂，所述阴离子表面活性剂为硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠，所述阳离子表面活性剂为季铵化物，所述两性离子表面活性剂为卵磷脂、氨基酸型或甜菜碱型，所述非离子表面活性剂为脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯或对聚十(氧乙烯)特-辛基酚。

[0017] 所述芦丁酶促反应温度范围为10～60℃，振荡转速范围为50～200r/min，反应时间范围为1～48h。

[0018] (1)在酶促合成异槲皮苷的体系中添加共溶剂

[0019] 以0.01～1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5～9的0.01～1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1～50％加入0.1～100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入共溶剂至体积浓度为1～20％，在10～60℃、50～200r/min条件下振荡反应1～48h。反应结束后，HPLC检测结果表明共溶剂可大大强化酶活及产物转化率。

[0020] (2)在酶促合成异槲皮苷的体系中添加表面活性剂

[0021] 以0.01～1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5～9的0.01～1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1～50％加入0.1～100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入表面活性剂至浓度为0.01～10％，在10～60℃、50～200r/min条件下振荡反应1～48h。反应结束后，HPLC检测结果表明表面活性剂可大大强化酶活及产物转化率。

[0022] 有益效果：

[0023] 在酶促合成异槲皮苷的体系中添加共溶剂或表面活性剂来强化合成效率，该方法反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业和日化工业的需要。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0025] 本发明实施例中使用同时检测芦丁和异槲皮苷的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件：Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：0.02％磷酸-乙腈(80∶20，v/v)；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

[0026] 其中，产物异槲皮苷的转化率计算方法为：

[0027]

[0028] α-L-鼠李糖苷酶液的制备参见专利CN 101985639A。

[0029] 实施例1

[0030] 以0.01mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.01g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1％加入0.1g/Lα-L-鼠李糖苷酶液，加入甲醇至体积浓度为1％，在10℃条件下50r/min振荡反应1h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了0.4％。

[0031] 实施例2

[0032] 以1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝9的1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比50％加入100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入DMSO至体积浓度为20％，在60℃、200r/min条件下振荡反应48h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了0.6％。

[0033] 实施例3

[0034] 以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入四氢呋喃至体积浓度为2.5％，在40℃条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了31％。

[0035] 实施例4

[0036] 以0.01mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.01g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1％加入0.1g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入Triton X-100至浓度为
0.01％，在10℃条件下50r/min振荡反应1h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了0.2％。

[0037] 实施例5