一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法

摘要

本发明涉及一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述的染色方法包括以下步骤：先收集细胞于离心管中，800g离心收集细胞，然后分别加入多聚甲醛固定、Triton-X100通透、1%BSA封闭，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用800g离心的方法进行洗涤，最后DAPI染色后，滴至载玻片上封片观察。本发明优点在于：本发明的一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，免疫荧光染色的过程均在离心管中进行，避开了悬浮细胞难于爬片及试验过程容易脱落的问题，染色结果较好，对于悬浮细胞及难于贴壁的细胞，此方法十分适用。

权利要求

1.一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，其特征在于，所述的染色方法包括以下步骤：

6 7

a、收集细胞总数为10-10 的细胞或大细胞团于2ml离心管中；

b、加入2ml PBS，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

c、重复b步骤，去除培养基中血清的影响；

d、加入2ml蒸馏水，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

e、加入1ml 4% 多聚甲醛，放置10min；其间每隔2min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

f、重复b、c、d步骤；

g、加入1ml 0.4% Triton-X-100通透细胞，放置10-20min；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

h、重复b、c、d步骤；

i、加入1ml 1% BSA或山羊血清，室温放置30min，以封闭细胞表面的非特异性抗原；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

j、加入一抗，室温放置2h或者4℃过夜；

k、重复b、c、d步骤；

l、避光加入荧光标记的二抗，室温放置1h；

m、重复b、c、d步骤；

n、加入DAPI和10μl蒸馏水，室温避光放置5min；

o、用移液器将细胞滴至载玻片上，晾干，加含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。

说明书

一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种细胞染色方法，具体地说，是一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法。

背景技术

[0002] 对于传统的细胞免疫荧光染色，通常采用细胞爬片或者直接涂片等方法来预处理细胞，再进行免疫荧光染色。而对于悬浮生长的细胞或细胞团，采用细胞爬片处理时，常会出现贴壁状态不佳或在玻片两面都同时生长的情况，影响后期的染色和观察；此外，在后续的染色过程中，附着于爬片的细胞经过多次冲洗后，容易脱落。

[0003] 中国专利文献CN101329230B公开了一种改进的免疫荧光细胞染色方法，包括固定/通透、通透、表面染色和核内染色、洗涤、重悬共5个步骤，是对eBioscience公司的Foxp3免疫荧光细胞染色方法的改进，将二步多重染色法改为一步多重染色法，同时进行细胞表面染色和核内染色。中国专利文献CN101226118公开了一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，涉及一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途。中国专利文献CN102043047A公开了一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法。但是关于一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法目前还未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法。

[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，所述的染色方法包括以下步骤：先收集细胞于离心管中，800g离心收集细胞，然后分别加入多聚甲醛（PFA）固定、Triton-X100通透、1% BSA封闭，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用800g离心的方法进行洗涤，最后DAPI染色后，滴至载玻片上封片观察。

[0006] 所述的染色方法包括以下步骤：

[0007] a、收集细胞或大细胞团（细胞总数为106-107）于2ml离心管中；

[0008] b、加入2ml PBS，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

[0009] c、重复b步骤，去除培养基中血清的影响；

[0010] d、加入2ml蒸馏水，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

[0011] e、加入1ml 4% 多聚甲醛，放置10min；其间每隔2min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0012] f、重复b、c、d步骤；

[0013] g、加入1ml 0.4% Triton-X-100通透细胞，放置10-20min；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0014] h、重复b、c、d步骤；

[0015] i、加入1ml 1% BSA或山羊血清，室温放置30min，以封闭细胞表面的非特异性抗原；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0016] j、加入一抗，室温放置2h或者4℃过夜；

[0017] k、重复b、c、d步骤；

[0018] l、避光加入荧光标记的二抗，室温放置1h；

[0019] m、重复b、c、d步骤；

[0020] n、加入DAPI和10ul蒸馏水，室温避光放置5min；

[0021] o、用移液器将细胞滴至载玻片上，晾干，加含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。

[0022] 所述的细胞为悬浮细胞。

[0023] 本发明优点在于：

[0024] 本发明的一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，免疫荧光染色的过程均在离心管中进行，避开了悬浮细胞难于爬片及试验过程容易脱落的问题，染色结果较好，对于悬浮细胞及难于贴壁的细胞，此方法十分适用。

附图说明

[0025] 附图1是RA诱导后的EB细胞DAPI染核的荧光图片。

[0026] 附图2是本身带有GFP的RA诱导后的EB细胞荧光图片。

[0027] 附图3是对RA诱导后的EB细胞进行VASA染色的荧光图片。

[0028] 附图4是图1、图2、图3的叠加。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0030] 附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：

[0031] 实施例1

[0032] 一、实验材料

[0033] 细胞：小鼠iPS细胞(induced pluripotent stem cells，诱导多能干细胞)，细菌培养皿悬浮培养5天形成的拟胚体（EB）后，添加2um的维甲酸（RA）培养2天后的诱导分化的EB细胞。

[0034] 试剂：4%多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(Hyclone)，1%BSA（Sigma），TritonX-100，一抗 VASA 兔抗鼠（Abcam），荧光二抗 A11072 羊抗兔（Invitrogen），DAPI，封片剂(DAKO)。

[0035] 设备：低速离心机（Thermo），低速摇床，普通冰箱（美的），激光共聚焦显微镜（Leica）。

[0036] 二、实验方法

[0037] 1. 收集RA诱导后EB细胞团于2ml离心管中；

[0038] 2. 加入2ml PBS，温和上下颠置数次后，800g离心5min，弃上清；

[0039] 3. 重复2步骤；

[0040] 4. 加入2ml蒸馏水，温和上下颠置数次后，800g离心5min，弃上清；

[0041] 5. 加入1ml 4%多聚甲醛（PFA），放置10min；其间每隔2min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0042] 6. 重复2、3、4步骤；

[0043] 7. 加入1ml 0.4% Triton-X-100通透细胞，放置10-20min；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0044] 8. 重复2、3、4步骤；

[0045] 9. 加入1ml 1% BSA，室温放置30min，其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

[0046] 10. 加入一抗（1:100-1:500稀释），室温放置2h或者4℃过夜；

[0047] 注：4℃过夜时放置低速摇床孵育更佳；

[0048] 11. 重复2、3、4步骤；

[0049] 12. 避光加入荧光标记的二抗（1:100-1:500稀释），室温放置1h；

[0050] 13. 重复2、3、4步骤；

[0051] 14. 加入DAPI和10ul蒸馏水，室温避光放置5min；

[0052] 15. 用移液器将细胞滴至载玻片上，稍晾干，加含抗荧光淬灭剂的封片剂封片；

[0053] 16. 激光共聚焦显微镜观察。

[0054] 需要说明的是，4% PFA、0.4% Triton/X-100、1% BSA加入的量均为1mL，加入的量既足够与细胞反应充分，又可避免试剂的浪费。PBS、蒸馏水加入的量均为2mL，满足对前一步骤残留的试剂彻底清洗，避免残余试剂的影响。选择离心5min，如果离心时间过长，将会对细胞造成损伤；如果时间过短，细胞不能完全沉淀。800g离心5min既对细胞的伤害较小，也能充分离心。

[0055] 三、实验结论

[0056] 请参照附图1-4，附图1是RA诱导后的EB细胞DAPI染核的荧光图片，附图2是本身带有GFP的RA诱导后的EB细胞荧光图片，附图3是对RA诱导后的EB细胞进行VASA染色的荧光图片，附图4是图1、图2、图3的叠加。为了检测生殖细胞标志物VASA在RA诱导分化的EB细胞中的表达，对EB细胞进行了VASA染色。激光共聚焦图片显示经RA诱导后的EB表达VASA，证明iPS细胞可以向生殖细胞分化。

[0057] 本发明采用低速离心法对悬浮细胞及难于贴壁的细胞进行免疫荧光染色。对于悬浮细胞及难于贴壁的细胞，现有技术是通过爬片或者涂片等适用于贴壁细胞的方法，而对于悬浮生长的细胞或细胞团，采用细胞爬片处理时，常会出现贴壁状态不佳或在玻片两面都同时生长的情况，影响后期的染色和观察；此外，在后续的染色过程中，附着于爬片的的细胞经过多次冲洗后，容易脱落。

[0058] 本发明先收集细胞于2ml离心管中，利用低速离心方法收集细胞，然后分别加入PFA固定、Triton-X100通透、1% BSA封闭，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用低速离心的方法进行洗涤。最后DAPI染色后，再滴至载玻片上封片观察。免疫荧光染色的过程均在离心管中进行，避开了悬浮细胞难于爬片及试验过程容易脱落的问题，染色结果较好。对于悬浮细胞及难于贴壁的细胞，此方法十分适用。

[0059] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。