一种总香豆素的提取方法及所提取的总香豆素的应用

摘要

本发明属于中药有效成分提取技术领域从千金子种皮中提取总香豆素的提取方法：将千金子种皮粉碎成粗粉使用石油醚脱脂得残渣；残渣用乙醇或甲醇提取，得到总香豆素粗品；加入氢氧化钾，调pH7～8，过滤，加入盐酸，调pH2～3，3～5℃冷藏12-16小时，抽滤，弃去滤液，真空干燥得总香豆素。得到的总香豆素用于制备治疗高血尿酸症的药物。从千金子种皮中提取总香豆素，可以充分利用资源，提高千金子的利用率，增加收益；提取方法简单，成本低，易操作，重复性良好，得到的总香豆素纯度高，纯度可达80%以上；得到的总香豆素对高尿酸血症具有很好的治疗效果，有效成分含量高、药物稳定性好、降尿酸效果显著、应用范围广泛、毒副作用小。

权利要求

1.一种总香豆素在制备治疗高血尿酸症的药物中的应用，所述总香豆素是通过以下的提取方法得到的：（1）脱脂：将千金子种皮粉碎成粗粉使用石油醚脱脂得残渣；

（2）提取：残渣用乙醇或甲醇提取，滤液减压回收乙醇或甲醇，得到总香豆素粗品；

（3）纯化：向得到的总香豆素粗提物中加入氢氧化钾，边加边搅拌，调pH为7～8，过滤，向滤液中加入盐酸，边加边搅拌，调pH为2～3，3～5℃冷藏12-16小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体真空干燥，即得总香豆素。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（1）中所用石油醚为30～60℃或者

60～90℃沸程规格的，残渣挥去石油醚。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（2）中乙醇体积百分比浓度为70～

95%，每克粗粉加10mL乙醇或甲醇。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于使用乙醇或甲醇加热回流提取或超声提取

2～3次，每次1～2小时。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于使用70%乙醇加热回流提取3次，每次2h。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（3）中氢氧化钾或盐酸的浓度为

1-2wt%。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（3）中真空干燥条件为在60～70℃、

0.07～0.09MP压力下干燥4小时。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（1）中使用石油醚脱脂为使用石油醚进行索式脱脂。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤（1）中千金子种皮去除杂质后使用高速粉碎机粉碎成20～40目的粗粉，然后使用石油醚索式脱脂至石油醚提取液无色。

说明书

一种总香豆素的提取方法及所提取的总香豆素的应用

[0001] 技术领域

[0002] 本发明属于中药有效成分提取技术领域，特别涉及一种从千金子种皮中提取总香豆素的提取方法，还涉及所提取的总香豆素的应用。

[0003] 背景技术

[0004] 香豆素类化合物是自然界中普遍存在的次生代谢产物，主要含有秦皮乙素、秦皮甲素、瑞香素等成分，秦皮甲素能降低高尿酸血症动物体内血清尿酸水平，对角叉菜胶、右旋糖酐、5-HT及组胺引起的大鼠关节炎有抑制作用，又能抑制豚鼠紫外线照射背部引起的红斑反应、大鼠肉芽肿得形成(棉球法)，组胺引起的毛细血管通透性增加。秦皮乙素能显著抑制组织胺引起的毛细血管通透性增加。瑞香素具有抗炎镇痛作用。

[0005] 千金子为大戟科植物续随子EupHorbia lathyris L.的种子，有逐水消肿，破血散结的功效，种仁中含有脂肪油、香豆素类成分如秦皮乙素、秦皮甲素、瑞香素等成分，但含量较低，在0.04％～0.36％。而千金子外面黑褐色的种皮(重量占种子的60％左右)过去一直是做为杂质部分去除的，我们在研究过程中发现种皮中总香豆素含量较高，一般在1.7％～3.8％，是一种潜在的提取香豆素类成分的植物资源。

[0006] 高尿酸血症表现为血或尿中尿酸浓度过高，其产生的主要原因有两个方面，一方面由于黄嘌呤氧化酶代谢异常导致尿酸生产过多，另一方面由于肾脏疾病导致尿酸排泄减少。尿酸盐沉积于关节、软组织及肾处，导致关节炎、尿路结石及肾疾病，导致痛风反复发作。另外，高尿酸血症与心血管等疾病的发病率和死亡率也密切相关，是一种严重影响公共健康的疾病。随着生活水平的迅速提高，我国高尿酸血症的发病率呈持续上升趋势，对高尿酸血症的基础及药物研究也日益成为热点之一。目前，高尿酸血症和痛风的治疗需要抗炎药来缓解疾病的红、肿、热、痛等症状，并在疾病发展不同阶段上选择排尿酸药物、黄嘌呤氧化酶抑制剂以缓解高尿酸血症，控制病情发展。目前，临床常用的药物有别嘌醇(维洛林)、苯溴马隆(立加利仙)等。别嘌醇在预防和治疗痛风时有一定的局限性，只有当积累的尿酸在循环中较明显时别嘌醇阻碍尿酸生物合成作用才能得到体现，并且会产生毒副作用如皮肤过敏、肝炎、威胁生命的变态反应综合征等。苯溴马隆长期使用对肾脏有毒副作用，在一定程度上限制了其安全使用。因此，从天然资源中寻找新型抗高尿酸血症和痛风药物依然是药学研究的热点。

[0007] 发明内容

[0008] 为了解决以上问题，本发明提供了一种从千金子种皮中提取总香豆素的提取方法，该提取方法简单、重复性好、提取物纯度高。

[0009] 本发明还提供了所提取的总香豆素的应用。

[0010] 本发明是通过以下方式实现的：

[0011] 一种总香豆素的提取方法，包括以下步骤：

[0012] (1)脱脂：将千金子种皮粉碎成粗粉，使用石油醚脱脂得残渣；

[0013] (2)提取：残渣用乙醇或甲醇提取，滤液减压回收乙醇或甲醇，得到总香豆素粗品。

[0014] (3)纯化：向得到的总香豆素粗提物中加入氢氧化钾，边加边搅拌，调pH为7～8，过滤，向滤液中加入盐酸，边加边搅拌，调pH为2～3，3～5℃冷藏12-16小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体真空干燥，即得总香豆素。

[0015] 步骤(1)中所用石油醚为30～60℃或者60～90℃沸程规格的，残渣挥去石油醚。

[0016] 步骤(2)中乙醇体积百分比浓度为70～95％，每克粗粉加10mL乙醇或甲醇。

[0017] 使用乙醇或甲醇加热回流提取或超声提取2～3次，每次1～2小时。

[0018] 使用70％乙醇加热回流提取3次，每次2h。

[0019] 步骤(3)中氢氧化钾或盐酸的浓度为1-2wt％。

[0020] 步骤(3)中真空干燥条件为在60～70℃、0.07～0.09MP压力下干燥4小时。

[0021] 步骤(1)中使用石油醚脱脂为使用石油醚进行索式脱脂。

[0022] 步骤(1)中千金子种皮去除杂质后使用高速粉碎机粉碎成20～40目的粗粉，然后使用石油醚索式脱脂至石油醚提取液无色。

[0023] 所述的提取方法得到的总香豆素用于制备治疗高血尿酸症的药物。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 1、从千金子种皮中提取总香豆素，可以充分利用资源，提高千金子的利用率，增加收益；

[0026] 2、提取方法简单，成本低，易操作，重复性良好，得到的总香豆素纯度高，纯度可达80％以上；

[0027] 3、得到的总香豆素对高尿酸血症具有很好的治疗效果，有效成分含量高、药物稳定性好、降尿酸效果显著、应用范围广泛、毒副作用小。

[0028] 附图说明

[0029] 附图1为本发明测定从千金子种皮中提取的总香豆素含量所用秦皮乙素对照品标准曲线图

[0030] 附图2为本发明从千金子种皮中提取的总香豆素TLC鉴别在日光下的检视图，[0031] 附图3为本发明从千金子种皮中提取的总香豆素TLC鉴别在紫外光灯(365nm)下的检视图，

[0032] 图中：1为瑞香素对照品，2为秦皮乙素对照品，3为秦皮甲素对照品，4～7为本发明方法提取的总香豆素。

具体实施方式

[0033] 以下实施例中所提到的乙醇浓度，都是指体积百分比浓度，其它浓度都是指重量百分比浓度。

[0034] 实施例1

[0035] 本实施例所用提取溶媒为70％乙醇，采用热回流提取，提取3次，每次2小时。

[0036] 其制备方法为：

[0037] a)、将千金子种皮去除杂质后，粉碎成20～40目的粗粉。取100g粉末，置索式提取器中，以30～60℃沸程规格的石油醚进行索式脱脂3小时至石油醚提取液无色，，弃去石油醚提取液，残渣挥去石油醚。

[0038] b)、残渣加70％乙醇1000mL加热回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液减压回收乙醇，得到总香豆素粗品。

[0039] c)、得到的总香豆素粗提物加1％的氢氧化钾溶液，边加边搅拌，调pH＝7，过滤，弃去不溶物，滤液再加1％盐酸，边加边搅拌，调pH＝3，3～5℃冷藏12小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体在0.09MP，60℃真空干燥4小时，即得总香豆素。

[0040] 实施例2

[0041] 本实施例所用提取溶媒为80％乙醇，采用热回流提取，提取2次，每次2小时。

[0042] 其制备方法为：

[0043] a)、将千金子种皮去除杂质后，粉碎成20～40目的粗粉。取100g粉末，置索式提取器中，以60～90℃沸程规格的石油醚进行索式脱脂3小时至石油醚提取液无色，弃去石油醚提取液，残渣挥去石油醚。

[0044] b)、残渣加80％乙醇1000mL加热回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液减压回收乙醇，得到总香豆素粗品。

[0045] c)、得到的粗提物加2％的氢氧化钾，边加边搅拌，调pH＝8，过滤，弃去不溶物，滤液再加2％盐酸，边加边搅拌，调pH＝2，3～5℃冷藏16小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体在0.07MP，70℃真空干燥4小时，即得总香豆素。

[0046] 实施例3

[0047] 本实施例所用提取溶媒为95％乙醇，采用热回流提取，提取3次，每次2小时。

[0048] 其制备方法为：

[0049] a)、将千金子种皮去除杂质后，粉碎成20～40目的粗粉。取100g粉末，置索式提取器中，以30～60℃沸程规格的石油醚索式脱脂3小时至石油醚提取液无色，弃去石油醚提取液，残渣挥去石油醚。

[0050] b)、脱脂后的残渣加95％乙醇1000mL加热回流提取3次，每次2小时，过滤，滤液减压回收乙醇，得到总香豆素粗品。

[0051] c)、得到的粗提物加1％的氢氧化钾，边加边搅拌，调pH＝7，过滤，弃去不溶物，滤液再加1％盐酸，边加边搅拌，调pH＝3，3～5℃冷藏12小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体在0.09MP，60℃真空干燥4小时，即得总香豆素。

[0052] 实施例4

[0053] 本实施例所用提取溶媒为95％乙醇，采用超声法提取，提取3次，每次1小时。

[0054] 其制备方法为：

[0055] a)、将千金子种皮去除杂质后，粉碎成20～40目的粗粉。取100g粉末，置索式提取器中，以30～60℃沸程规格的石油醚索式脱脂3小时至石油醚提取液无色，弃去石油醚提取液，残渣挥去石油醚。

[0056] b)、残渣加95％乙醇1000mL超声提取3次，每次1小时，过滤，滤液减压回收乙醇，得到总香豆素粗品。

[0057] c)、得到的粗提物加1％的氢氧化钾，边加边搅拌，调pH＝7，过滤，弃去不溶物，滤液再加1％盐酸，边加边搅拌，调pH＝3，3～5℃冷藏16小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体在0.07MP，70℃真空干燥4小时，即得总香豆素。

[0058] 一、提取工艺条件的选择

[0059] 1.1确定提取方法的理论依据：依据千金子有关文献及香豆素类成分的化学性质，经反复试验确定了其提取工艺。

[0060] 1.2正交实验优选提取工艺

[0061] 经预试，乙醇回流法比超声法提取测得的总香豆素含量高，故我们采用乙醇回流法提取。选择主要影响提取效率的乙醇浓度(A)，提取时间(B)，提取次数(C)为考察因素，4
以提取物中总香豆素含量为考察指标，采用L9(3)正交表进行试验，因素水平表见表1。

[0062] 表1因素水平表

[0063]

[0064] 操作方法：

[0065] 将千金子种皮粉碎成20～40目的粗粉，精密称取4份，每份0.1g，分别放入滤纸筒中，加30～60℃沸程规格的石油醚于索式提取器中，脱脂3h，弃去石油醚液。残渣挥去溶媒，再按照正交试验表中计划，加入不同浓度的乙醇10mL，水浴回流提取不同时间和不同次数，放冷，过滤，滤液蒸干，以甲醇溶解定容于10mL量瓶中，摇匀，取0.5mL于10mL量瓶中，加甲醇定容，以秦皮乙素为对照品，采用紫外分光光度法于350nm测定吸光度，计算样品中总香豆素含量，结果见表2。

[0066] 表2L9(34)正交试验计划表及结果

[0067]

[0068] 直观分析显示，各因素极差RA＞RC＞RB，影响千金子种皮中总香豆素提取率的因素依次为乙醇浓度＞提取次数＞提取时间，乙醇浓度为最主要因素，提取次数和提取时间为次要影响因素。总香豆素含量越高越好，对于A因素，选择水平2，即乙醇浓度为70％。对于B因素，选择水平2，即每次提取2小时。对于C因素，选择水平2，即提取3次。优选出的最佳提取工艺组合为A2B2C2，即种皮脱脂后，以70％乙醇提取3次，每次2h。

[0069] 1.3验证试验

[0070] 按优选出的最佳工艺进行3批千金子种皮的提取，按紫外分光光度法于350nm处测定其吸光度，计算总香豆素含量。结果三批样品总香豆素含量分别为3.83％、3.79％和3.82％，相对标准偏差RSD％为0.75％，说明该提取工艺重复性良好。

[0071] 1.4纯化工艺

[0072] 总香豆素粗提物还含有其它杂质，利用香豆素类化合物含有酚羟基的特性，采用与碱反应生成可溶性盐，再加酸酸化又析出香豆素的性质可达到纯化的目的。

[0073] 取1.2中得到的乙醇提取物，减压回收乙醇后，加1％的氢氧化钾，边加边搅拌，调pH＝7，过滤，弃去不溶物，滤液再加1％盐酸，边加边搅拌，调pH＝3，3～5℃冷藏12-16小时，抽滤，弃去滤液，将得到的黄色固体在0.09MP，60℃真空干燥4小时，即得总香豆素。

[0074] 1.5三批提取物中总香豆素含量测定

[0075] 供试品溶液的制备：分别取三批提取的总香豆素5.5mg，5.3mg，5.5mg，溶解于10ml甲醇中，取0.2ml总香豆素溶液置10ml中，分别以甲醇稀释至刻度即得。

[0076] 秦皮乙素对照品溶液的制备：取秦皮乙素对照品溶液(0.48mg/ml)200μl，置10ml量瓶中，以甲醇稀释成浓度为0.0096mg/ml的对照品溶液。

[0077] 线性关系的考察：取秦皮乙素对照品约12mg，精密称定，置25ml量瓶中，加乙醇适量微热使溶解，并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.48mg/ml。精密量取对照品溶液100μl、150μl、200μl、250μl、300μl，分别置于10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，于350nm测定，以样品浓度和吸光度进行回归计算，得回归方程A＝0.0162C-0.0009，r＝0.9998，表明秦皮乙素在4.80μg/ml-14.4μg/ml范围内线性关系良好，测定结果见附图1。

[0078] 测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液适量，采用紫外分光光度法，于350nm测定吸光度，计算样品中总香豆素含量，结果见表3。

[0079] 表3三批提取物中总香豆素含量测定结果

[0080]

[0081] 1.6总香豆素提取物中化学成分薄层色谱(TLC)鉴别

[0082] 文献报道千金子种仁中含有秦皮乙素(七叶内酯)、秦皮甲素(七叶树苷)、双七叶内酯、异双七叶内酯、瑞香素等。根据以上文献，参考《中国药典》2010年版一部千金子【鉴别】项下方法，对千金子种皮总香豆素提取物中可能含有的化学成分进行了TLC鉴别。

[0083] 瑞香素对照品溶液的配制：取瑞香素对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号0900-200001，供含量测定用)适量，加甲醇溶解，配成浓度为1mg/mL的对照品溶液。点样量1m L。

[0084] 秦皮乙素对照品溶液的配制：取秦皮乙素对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号110741-200506，供含量测定用)适量，加甲醇溶解，配成浓度为1mg/mL的对照品溶液。点样量1mL。

[0085] 秦皮甲素对照品溶液的配制：取秦皮甲素对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号110740-200104，供含量测定用)适量，加甲醇溶解，配成浓度为1mg/mL的对照品溶液。点样量1mL。

[0086] 供试品溶液的配制：取本发明提取的总香豆素适量，加甲醇溶解，配成浓度为1.2mg/mL的供试品溶液。点样量分别为2、4、8、10mL。

[0087] 薄层板：硅胶G-0.5％羧甲基纤维素钠薄层板，厚度0.4mm，105℃活化0.5h。

[0088] 展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)，

[0089] 展距：10cm，

[0090] 检视：日光下和紫外光灯(365nm)下检视，结果见附图2和附图3。

[0091] 从图2、图3结果可见，日光下检视，瑞香素、秦皮乙素对照品在日光下均显淡黄色斑点，秦皮甲素对照品斑点无色，不同点样量的香豆素提取物TLC色谱中出现了与秦皮乙素对照品相对应的相同颜色的斑点。紫外光灯(365nm)下检视，秦皮乙素和秦皮甲素对照品出现明显的蓝色荧光斑点，而瑞香素对照品显暗黄色斑点，不同点样量的香豆素提取物TLC色谱中出现了与秦皮乙素对照品相对应的相同颜色的斑点，均未出现与瑞香素和秦皮甲素对照品相对应的斑点，初步说明提取物中几乎不含秦皮甲素和瑞香素或二者含量很低。

[0092] 2.本发明的药物药效学试验结果

[0093] 对高尿酸血症小鼠模型的抑制作用：

[0094] 小鼠60只，雌性，体重20±2g，随机分为6组：空白对照组、模型对照组、阳性对照别嘌醇片组、本发明提取的总香豆素低剂量组、本发明提取的总香豆素中剂量组、本发明提取的总香豆素高剂量组，每组10只。按组给药，空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水；本发明提取的总香豆素低剂量组、本发明提取的总香豆素中剂量组、本发明提取的总香豆素高剂量组灌胃给予本发明提取的总香豆素300mg/kg、2100mg/kg和3000mg/kg，每天1次。第4天，阳性对照组灌胃别嘌醇片混悬液520mg/kg，其余各组继续给药，第5天给药1h后，除空白对照组外，其余各组腹腔注射次黄嘌呤1000mg/kg造成高血尿酸模型，注射1h后各组摘眼球取血，3000r/min离心10min，取血清，用全自动生化分析仪检测血清尿酸含量。结果见表4。

[0095] 由表4结果可见，与空白对照组比较，模型对照组小鼠血清尿酸含量明显升高，提示造模成功。本发明提取的总香豆素高、中剂量组与模型对照组比较，小鼠血清尿酸含量明显降低(P＜0.001，P＜0.05)，表明本发明提取的总香豆素能明显降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平，中剂量组的尿酸抑制率达到了48.21％，高剂量组的尿酸抑制率达到了60.73％。

[0096] 表4不同组别对高尿酸血症小鼠血清尿酸含量影响表(n＝10，±s)

[0097]△ △△△

[0098] 与空白对照组比较*P＜0.05；与模型对照组比较 P＜0.05， P＜0.001。

[0099] 公开号为CN101181262A的中国发明专利申请，公开了秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素四种化合物在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用，但本发明提取方法得到的是多种香豆素类成分的混合物，除了上述实验中验证含有秦皮乙素外，还含有其他一些成分，并且有超过15％的组分不属于总香豆素，这些组分在降低血尿酸药效方面也可能会发挥一定作用的。虽然本发明的名称为一种总香豆素的提取方法，但本发明的主要发明点在于从千金子种皮中使用本发明的提取方法进行提取得到的组分在制备治疗高尿酸血症药物中的应用，并不是能够通过上述专利申请公开的内容就能显而易见得出的。