一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法

摘要

本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法，包括有制备初步纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白，rTPA38KDa包涵体蛋白的裂解，第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化，第二次阴离子交换层析方法进一步纯化，超滤后获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液。本发明采用“先复性后纯化”的方法，通过两次阴离子交换层析完成目的蛋白的复性和纯化，目的蛋白总得率达到30%以上，纯度达到95%以上,与现有技术相比，本发明采用的方法可工业放大，便于质量控制，其工艺步骤少、生产成本更低、效率更高。

权利要求

1. 一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法，其特征在于：所述方法包括有以下步骤：步骤a.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白将发酵培养的初始工程菌经破碎、收集沉淀、洗涤、离心后获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白；

步骤b.rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

将步骤a获得的rTPA38KDa 包涵体蛋白采用变性剂溶液溶解，过滤后获得含有裂解的rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液；

步骤c.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

将步骤b获得的变性液采用含有DEAE-Sepharose FF层析介质的阴离子交换层析方法进行复性和纯化，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲液；

步骤d.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

将步骤c获得的第一缓冲液采用含PEI-WP 硅胶层析介质的阴离子交换层析方法进一步纯化，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

步骤e：将步骤d获得的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa 包涵体蛋白原液；

其中：

所述步骤a中，所述洗涤包括以下步骤：

步骤a1：采用含1% Triton X100、pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮沉淀，300rpm室温搅拌20min，12000 rpm离心10min，收集沉淀；

步骤a2：重复步骤a1；

步骤a3：再以pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次；

所述步骤b中，所述变性剂溶液为含有8mmol/L尿素和1mmol/L DTT的pH8.0 的

20mmol/L Tris-Cl缓冲液；

所述步骤c中，所述第一次阴离子交换层析方法具体为：采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱，然后使用A液-B液梯度洗脱，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，上样及洗脱流速为150cm/hr；

所述A液为含6mmol/L尿素、1mmol/L DTT， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

所述B液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液；

所述C液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素、250 mmol/L NaCl，pH8.0的

20mmol/L Tris-Cl缓冲液；

所述第一次阴离子交换层析方法采用1.0mol/L的NaOH清洁层析柱；

所述步骤c之后，将收集的洗脱峰采用1.0mol/L的HCl调节 pH为7.0；

所述步骤d中，所述第二次阴离子交换层析方法为：

将所述含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱，上样后，使用D液平衡层析柱，然后使用D液-E液梯度洗脱，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的缓冲液，上样及洗脱流速为150cm/hr；

所述D液为pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

所述E液为含0.5 mmol/L氯化钠， pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液；

所述第二次阴离子交换层析方法采用含8mol/L尿素、0.5mol/L NaCl，pH6.5的

20mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

说明书

一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白复性与纯化方法。

背景技术

[0002] 结 核 病（tubeiculosis,TB）是 一 种 由 结 核 分 枝 杆 菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的人兽共患的慢性传染病，可累及全身多种组织器官，其中以肺结核（pulmonary tuberculosis）最为常见。由于MTB耐药株的出现，AIDS合并MTB感染以及全球范围的结核高危人群的流动，造成了TB的全球流行，目前结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。据世界卫生组织报道，全球有近1/3的人已感染MTB，全球有活动性肺结核病人约2000万，每年新发结核病人约800-1000万，每年约有300万人死于结核病。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位，且MTB的传布已从贫困的农村地区向城市扩展的趋势，因此，结核病的有效防治在我国尤其重要。

[0003] 结核 分枝杆 菌38KDa蛋白（tuberculosis protein antigen 38KDa，简 称TPA38KDa）是一种由Kadival等人于1987年分离鉴定的、大小约为38KDa的、在磷酸运转中起重要作用的脂蛋白，仅在结核分支杆菌中可检测到，具有强免疫原性，是MTB检测与诊断试剂以及疫苗研究的热门候选抗原之一，在结核病防治中具有广泛应用前景。由于TPA38KDa在MTB中的含量极低、且MTB为危险的致病菌，所以采用天然提取法制备该抗原无论在生产成本还是安全性方面均存在问题。而基因工程技术为大规模、高效、安全地制备TPA38KDa提供了可能。大肠杆菌表达系统因遗传背景清楚、基因操作简单、表达水平高、发酵成本低和易于工业规模放大等优点而成为药用重组TPA38KDa（recombinant TPA38KD, rTPA38KDa ）的理想宿主系统。因MTB与大肠杆菌在进化上近源，所以MTB来源的天然或经简单改造的TPA38KDa编码序列在强启动子（如T7启动子）的控制下很容易获得高效表达，表达水平一般能达到30%以上。与其它在大肠杆菌系统高效表达的目的蛋白一样，TPA38KDa的高效表达产物也是一种无活性的、水不溶的包涵体蛋白，必须采取适当的复性和纯化方法才能获得药用级的产品。

[0004] 包涵体蛋白的复性的方法主要是通过缓慢降低变性剂浓度来促使目的蛋白重折叠，主要分为稀释复性、透析复性、超滤复性和柱层析复性。其中，1）稀释复性是传统的复性方法，主要是直接通过稀释作用降低变性剂的浓度，并将蛋白浓度控制为10～100μg/ ml 或更低，以减轻聚沉效应，其缺陷在于：工业上采用此类复性方法需要很多的容器及大量的复性缓冲液蛋白浓度难于控制,同时复性蛋白回收困难；2）透析复性法主要通过透析的方法降低变性剂浓度，与稀释复性一样不能解决聚沉问题，且由于需要多次置换缓冲液，缺乏合适的工业规模透析装置等原因而不适合于工业化生产，该法只能用于实验室规模；3）超滤复性法是一种类似于透析复性的方法，主要通过超滤装置降低变性剂浓度，过程比透析法快速、且易于放大，但与稀释复性和透析复性一样，难以解决聚沉问题。由此，在复性过程中因变性剂浓度的降低而导致多肽链间的聚合沉淀和形成可溶的“二聚体”是导致复性操作失败或复性效率不高的最主要原因，而上述三种方法均不能有效解决聚沉问题，复性效率均不高。

[0005] 为解决上述问题，人们又采用了最有发展前景的柱层析复性技术，其主要通过柱层析方法逐步降低变性剂浓度，使目的蛋白在层析柱上得以复性。层析介质存在物理隔离作用，自由伸展的肽链间碰撞机会减少，从而大大降低了“聚沉效应”。但是，由于层析技术类型、层析介质种类、缓冲溶液种类、添加试剂种类、复性操作模式和样品前处理方式等众多因素均会影响蛋白质复性的成败与复性效率，特别是由于上述因素对不同的蛋白质具有不同的影响，因此，特定的柱层析复性方法只是针对特定的蛋白质，即不具备“通用性”。因此，包涵体蛋白的复性和纯化一直是大肠杆菌基因工程技术产业化最主要的技术瓶颈，目前尚无任何层析技术用于TPA38KDa复性的报道。

[0006] 由于临床用途的蛋白质药物对纯度要求高，相应的分离纯化方法既要能使包涵体蛋白复性，又要去除来自宿主细胞的杂质（如宿主蛋白、DNA和RNA、内毒素、脂类等）以及未正确复性的目的蛋白的“构象异构体”（如二聚体），使目的蛋白纯度达到95%（局部用药）或98%（系统用药）以上。现有技术中，一般采用柱层析或者特异性较强的亲和层析的分离纯化的方法。其中，柱层析方法通常需要3-4步柱层析，其缺陷在于：工艺步骤较多，效率低，质量难以控制；而亲和层析的方法主要是将目的蛋白与His6标签序列融合表达，再以金属螯合层析进行纯化。尽管该方法纯化效率较高，但其缺陷在于：1）必须在目的蛋白的末端引入异源的His6序列，所以纯化产物不能应用于人体；2）亲和层析介质使用寿命短，价格昂贵，不适宜于大规模工业化生产。

[0007] 因此，针对现有技术中的不足，亟需提供一种可工业化放大、便于质控、效率高、节约生产成本的药用级的结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于解决或克服现有技术中的不足之处而提供一种可工业化放大、便于质控、效率高、节约生产成本的药用级的结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法。

[0009] 本发明的目的通过以下技术措施实现：

[0010] 提供一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法，所述方法包括有以下步骤：

[0011] 步骤a.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白

[0012] 将发酵培养的初始工程菌经破碎、收集沉淀、洗涤、离心后获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白；

[0013] 步骤b.rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0014] 将步骤a获得的rTPA38KDa 包涵体蛋白采用变性剂溶液溶解，过滤后获得含有裂解的rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液；

[0015] 步骤c.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0016] 将步骤b获得的变性液采用含有DEAE-Sepharose FF层析介质的阴离子交换层析方法进行复性和纯化，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲液；

[0017] 步骤d.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0018] 将步骤c获得的第一缓冲液采用含PEI-WP 硅胶层析介质的阴离子交换层析方法进一步纯化，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0019] 步骤e：将步骤d获得的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa 包涵体蛋白原液。

[0020] 其中，所述步骤a中，所述洗涤包括以下步骤：

[0021] 步骤a1：采用含0.5～1.5% Triton X100、pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液按8～12%（W/V）比例悬浮沉淀，280～320rpm室温搅拌15～25min，11000～13000rpm离心8～12min，收集沉淀；

[0022] 步骤a2：重复步骤a1；

[0023] 步骤a3：再以pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0024] 具体的，步骤a中，所述洗涤包括以下步骤：

[0025] 步骤a1：采用含1% Triton X100、pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮沉淀，300rpm室温搅拌20min，12000 rpm离心10min，收集沉淀；

[0026] 步骤a2：重复步骤a1；

[0027] 步骤a3：再以pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0028] 其中，所述步骤b中，所述变性剂溶液为含有6～10mmol/L尿素和0.5～1.5mmol/L DTT的pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0029] 具体的，所述步骤b中，所述变性剂溶液为含有8mmol/L尿素和1mmol/L DTT的pH8.0 的20mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0030] 其中，所述步骤c中，所述第一次阴离子交换层析方法具体为：采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱，然后使用A液-B液梯度洗脱，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，上样及洗脱流速为135～165cm/hr；

[0031] 具体的，所述A液为含4～8mmol/L尿素、0.5～1.5mmol/L DTT， pH7.5～8.5的15～25 mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0032] 具体的，所述B液为含8～12 mmol/L磷酸氢二钠、1.5～2.5mmol/L尿素， pH7.5～8.5的15～25 mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0033] 具体的，所述C液为含8～12mmol/L磷酸氢二钠、1.5～2.5mmol/L尿素、220～280 mmol/L NaCl，pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0034] 更具体的，所述第一次阴离子交换层析方法的上样及洗脱流速为150cm/hr；

[0035] 更具体的，所述A液为含6mmol/L尿素、1mmol/L DTT， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0036] 更具体的，所述B液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0037] 更具体的，所述C液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素、250 mmol/L NaCl，pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0038] 优选的，所述第一次阴离子交换层析方法采用0.5～1.5mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0039] 更优选的，步骤c之后，将收集的洗脱峰采用0.5～1.5mol/L的HCl调节 pH为5.2～7.2。

[0040] 其中，所述步骤d中，所述第二次阴离子交换层析方法为：将所述含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱，上样后，使用D液平衡层析柱，然后使用D液-E液梯度洗脱，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的缓冲液，上样及洗脱流速为135～165cm/hr；

[0041] 具体的，所述D液为pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0042] 具体的，所述E液为含0.4～0.6mmol/L氯化钠， pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0043] 更具体的，所述第二次阴离子交换层析方法的上样及洗脱流速为150cm/hr；

[0044] 更具体的，所述D液为pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0045] 更具体的，所述E液为含0.5 mmol/L氯化钠， pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0046] 优选的，所述第二次阴离子交换层析方法采用含6～10mol/L尿素、0.4～0.6mol/L NaCl，pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0047] 更优选的，所述第二次阴离子交换层析方法采用含8mol/L尿素、0.5mol/L NaCl，pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0048] 本发明的有益效果：

[0049] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法，先通过第一次阴离子交换层析方法对目的蛋白进行复性和中度纯化，再通过第二次阴离子交换层析方法对目的蛋白进一步纯化，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。由于本发明采用“先复性后纯化”的方法，使得经第一次阴离子交换层析方法进行复性 的rTPA38KDa 包涵体蛋白中绝大部分非正确折叠的“异构体”在第二次阴离子交换层析方法中得到了有效去除，因此，本发明所采用的阴离子交换层析的复性方法相比传统的透析复性法和稀释复性法更适合于工业规模放大，便于质量控制。

[0050] 本发明利用TPA38KDa作为磷酸结合蛋白的特性，在第一次阴离子交换层析进行复性的过程中采用磷酸盐诱导rTPA38KDa 包涵体蛋白复性，使得第一次阴离子交换层析柱的复性效率从10%提高到60%以上，而且本发明仅仅通过第一次阴离子交换层析和第二次阴离子交换层析的两步阴离子交换层析即可完成rTPA38KDa 包涵体蛋白的复性和纯化，该纯化方法总得率达到30%以上，目的蛋白纯度达到95%以上，效价分析结果表明，本发明制备的rTPA38KDa 包涵体蛋白的效价与参比品一致。与现有技术相比，由于本发明采用的方法其工艺步骤少、未采用寿命短、价格昂贵的亲和层析介质，因此，其生产成本更低、复性和纯化的效率更高。

附图说明

[0051] 利用附图对本发明做进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。

[0052] 图1为本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的工艺流程图。

[0053] 图2为本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的HPLC高效液相色谱图。

[0054] 图3为本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的SDS-PAGE电泳图。

[0055] 图4为本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的HPLC纯度分析图。

具体实施方式

[0056] 结合以下实施例对本发明作进一步说明：

[0057] 实施例1

[0058] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的实施例1如图1所示，包括有以下步骤：

[0059] 步骤101. rTPA38KDa 包涵体蛋白的构建与表达

[0060] 本发明所采用的工程菌：重组结核分枝杆菌38KDa蛋白（rTPA38KDa）菌株系由带有结核分枝杆菌H37Rv菌株的38KDa蛋白编码基因（Pab）的PET9d-Pad质粒转化的大肠杆菌BL21（DE3）菌株，由解放军309医院构建并提供。

[0061] 该工程菌为含有重组结核分枝杆菌38KDa蛋白（rTPA38KDa）表达载体PET9d-TPA38的大肠杆菌。PET9d-TPA38含有rTPA38KDa编码序列，目的基因置于强启动子T7启动子的控制下。工程菌在IPTG诱导下可高效表达PET9d-TPA38，表达水平达到30%以上，表达产物为包涵体蛋白。

[0062] 步骤102.rTPA38KDa 工程菌的培养发酵

[0063] 将工程菌甘油菌种按1%（V/V）的接种比例接种于含LB培养基的三角瓶，于37℃、150～200rpm振荡培养过夜。按10%（V/V）比例接种于种子罐（全自控发酵罐），在温度
37℃、pH6.5～7.0和溶解氧30%以上条件下培养2.5～3.5hr。种子液按10～30%（V/V）比例接种于主发酵罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.5～7.0和溶解氧30%以上条件下培养2.0～3.0hr后加入IPTG至终浓度1 mmol/L，继续培养3.5～4.5hr，得到工程菌培养液。

[0064] 步骤103.制备初步纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白

[0065] 步骤103a. rTPA38KDa 工程菌破碎

[0066] 将工程菌培养液以连续流离心机14000～16000rpm离心，以pH7.0、15～25mmol/L磷酸盐缓冲液按10～30%（W/V）比例悬浮菌体，用高压匀浆机在800Mpa压力下破碎菌体，11000～13000 rpm离心8～12min，收集沉淀；

[0067] 步骤103b. rTPA38KDa 包涵体蛋白的洗涤

[0068] 步骤103b1：采用含0.5～1.5% Triton X100、pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液按8～12%（W/V）比例悬浮沉淀，280～320rpm室温搅拌15～25min，11000～13000rpm离心8～12min，收集沉淀；

[0069] 步骤103b2:重复上述洗涤步骤103b1；

[0070] 步骤103b3:再以pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0071] 在步骤103b3之后，离心后即获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。

[0072] 步骤104. rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0073] 以含6～10mmol/L尿素和0.5～1.5mmol/L DTT的pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，在280～320rpm条件下室温搅拌3hr以上，然后经0.45??m滤膜过滤后获得rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液。

[0074] 步骤105.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0075] 第一次阴离子交换层析采用DEAE-Sepharose FF层析介质（GE公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，样品为rTPA38KDa包涵体蛋白变性液，上样与洗脱流速均为135～165cm/hr。

[0076] 采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱2CV，然后使用A液-B液梯度洗脱30CV，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白第一缓冲液；

[0077] 具体的，A液为含4～8mmol/L尿素、0.5～1.5mmol/L DTT， pH7.5～8.5的15～25 mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0078] 具体的，B液为含8～12 mmol/L磷酸氢二钠、1.5～2.5mmol/L尿素， pH7.5～8.5的15～25 mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0079] 具体的，C液为含8～12mmol/L磷酸氢二钠、1.5～2.5mmol/L尿素、220～280 mmol/L NaCl，pH7.5～8.5的15～25mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0080] 具体的，采用0.5～1.5mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0081] 更具体的，将收集的洗脱峰采用0.5～1.5mol/L的HCl调节 pH至5.2～7.2。

[0082] 步骤106.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0083] 第二次阴离子交换层析采用采用PEI-WP硅胶层析介质（JT Baker公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，上样与洗脱流速均为135～165cm/hr。

[0084] 将含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱30CV，上样后，使用D液平衡层析柱2CV，然后使用D液-E液梯度洗脱15CV，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0085] 具体的，D液为pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0086] 具体的，E液为含0.4～0.6mmol/L氯化钠， pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0087] 具体的，第二次阴离子交换层析方法采用含6～10mol/L尿素、0.4～0.6mol/L NaCl，pH6～6.8的15～25mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0088] 步骤107.制备rTPA38KDa包涵体蛋白原液

[0089] 将获得含有高度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液，于-30℃保存。

[0090] 将经过上述步骤获得的rTPA38KDa包涵体蛋白采用以下方法进行测定：

[0091] 1.蛋白质纯度测定

[0092] 1）SDS-PAGE电泳法

[0093] 参照（《中国药典》）三部（2005版）附录IV C），用非还原型SDS-PAGE电泳法，分离胶浓度12.0%，加样量应低于10μg，（考马斯亮蓝R250染色法）。经扫描仪扫描，纯度不低于90.0%。

[0094] 2）HPLC高效液相色谱法

[0095] 参照（《中国药典》）三部（2005版）附录III B)。色谱柱为Waters Proteins PA-125，流速0.5ml/min；流动相为0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，上样量不低于20μg，于波长280nm处检测，以rTPA38KDa 包涵体蛋白的色谱峰计算理论板数应不低于500,按面积规一法计算，rTPA38KDa 包涵体蛋白的主峰面积应不低于总面积的95.0%。

[0096] 2.目的蛋白得率和复性效率计算：

[0097] 目的蛋白得率（%）=【洗脱峰目的蛋白质的量/ 上样样品目的蛋白质的量】×100[0098] 复性效率（%）=【NaCl峰目的蛋白质的量/(NaCl峰目的蛋白质的量 + NaOH峰目的蛋白质的量)】×100

[0099] 其中：蛋白质质量 = 浓度×体积×纯度。

[0100] 3.宿主蛋白、DNA和内毒素测定

[0101] 参照《中国药典》（2005版，三部）进行。

[0102] 4.效价测定

[0103] 将冻干参比品溶解液及待检原液稀释成0.1 ml含0.6μg、0.4μg、0.2μg稀释度，用体重400-600 g经结核杆菌致病感染的白色雌性豚鼠4只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述参比品（中国药品生物制品检定所提供）各稀释度和待检原液各稀释度0.1 ml。于注射后24、48小时各观察结果1次，算出标准参比品各稀释度和待检原液相应稀释度(24小时反应)的平均红晕、硬结反应直径(纵横直径相加除2)，计算累计值，并求其比值。

[0104] 实施例2

[0105] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的具体实施例2如图1所示，本实施例的主要技术方案与实施例1相同，在本实施例中未解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。本实施例与实施例1的区别在于：

[0106] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法包括有以下步骤：

[0107] 步骤101. rTPA38KDa 包涵体蛋白的构建与表达

[0108] 本步骤与实施例1相同。

[0109] 步骤102.rTPA38KDa 工程菌的培养发酵

[0110] 将工程菌甘油菌种按1%（V/V）的接种比例接种于含LB培养基的三角瓶，于37℃、170rpm振荡培养过夜。按10%（V/V）比例接种于种子罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.8、和溶解氧30%以上条件下培养3hr。种子液按10%（V/V）比例接种于主发酵罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.8、和溶解氧30%以上条件下培养2.5hr后加入IPTG至终浓度1 mmol/L，继续培养4hr，得到工程菌培养液。

[0111] 步骤103.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白

[0112] 步骤103a. rTPA38KDa 工程菌破碎

[0113] 将工程菌培养液以连续流离心机15000rpm离心，以pH7.0、20mmol/L磷酸盐缓冲液按10%（W/V）比例悬浮菌体，用高压匀浆机在800Mpa压力下破碎菌体，12000rpm离心10min，收集沉淀；

[0114] 步骤103b. rTPA38KDa 包涵体蛋白的洗涤

[0115] 步骤103b1：采用含1% Triton X100、pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮沉淀，300rpm室温搅拌20min，12000 rpm离心10min，收集沉淀；

[0116] 步骤103b2:重复上述洗涤步骤103b1；

[0117] 步骤103b3:再以pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0118] 在步骤103b3之后，离心后即获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。

[0119] 步骤104. rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0120] 以含8mmol/L尿素和1mmol/L DTT的pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，在300rpm条件下室温搅拌3hr以上，然后经0.45μm滤膜过滤后获得rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液。

[0121] 步骤105.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0122] 第一次阴离子交换层析采用DEAE-Sepharose FF层析介质（GE公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，样品为rTPA38KDa包涵体蛋白变性液，上样与洗脱流速均为150cm/hr。

[0123] 采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱2CV，然后使用A液-B液梯度洗脱30CV，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白第一缓冲液；

[0124] 具体的，A液为含6mmol/L尿素、1mmol/L DTT， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0125] 具体的，B液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素， pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0126] 具体的，C液为含10 mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L尿素、250 mmol/L NaCl，pH8.0的20mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0127] 具体的，采用1mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0128] 更具体的，将收集的洗脱峰采用1mol/L的HCl调节 pH至7.0。

[0129] 步骤106.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0130] 第二次阴离子交换层析采用采用PEI-WP硅胶层析介质（JT Baker公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，上样与洗脱流速均为150cm/hr。

[0131] 将含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱30CV，上样后，使用D液平衡层析柱2CV，然后使用D液-E液梯度洗脱15CV，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0132] 具体的，D液为pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0133] 具体的，E液为含0.5 mmol/L氯化钠， pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0134] 优选的，采用含8mol/L尿素、0.5mol/L NaCl， pH6.5的20mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0135] 步骤107.制备rTPA38KDa包涵体蛋白原液

[0136] 将获得含有高度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液，于-30℃保存。

[0137] 将经过上述步骤获得的rTPA38KDa包涵体蛋白采用实施例1的方法进行测定后，结果分析如下：

[0138] 1. DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析的复性与纯化

[0139] DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析复性与纯化结果如图2和图3所示，图2的HPLC高效液相色谱中，经尿素浓度梯度洗脱30CV后，样品中的尿素浓度缓慢降低至2mol/L，此时目的蛋白即处于复性环境，并进行了有效折叠。整个DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析过程中，呈现出上样穿透峰250 mmol/L NaCl洗脱峰和1mol/L NaOH洗脱峰等3个峰。

[0140] 如图3所示，SDS-PAGE电泳分析结果表明，上样穿透峰为无蛋白的杂峰，NaCl和NaOH洗脱峰均含高浓度目的蛋白。NaCl洗脱峰样品的非还原电泳带谱中未见TPA38KD的特征性二聚体或多聚体，因此可视为正确复性样品，而NaOH洗脱峰中的目的蛋白为非离子交换吸附的目的蛋白，可视为复性过程中变性在DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析柱中的目的蛋白。

[0141] 另外，NaCl洗脱峰280 nm吸收值大于254 nm的吸收值，表明该洗脱峰样品中以蛋白质组分为主，而NaOH洗脱峰254nm吸收值远大于280nm的吸收值，显然该峰样品中主要组分是核酸，表明经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析即可去除绝大部分宿主来源核酸污染。

[0142] 根据复性效率计算，复性缓冲液中含有磷酸盐和不含磷酸盐的复性效率分别为65%和12%，表明DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析在降低样品中尿素浓度时，磷酸盐可有效诱导TPA38KD正确折叠，使复性效率大大增加，经过DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析的目的蛋白回收率为60%，纯度达到了90%以上。结果表明，DEAE-Sepharose FF层析介质和本发明提出的磷酸盐诱导法非常适合rTPA38KDa 包涵体蛋白的工业规模的复性与纯化。

[0143] 2. DPEI-WP硅胶阴离子交换层析的纯化

[0144] DPEI-WP硅胶阴离子交换层析的纯化结果如图2、图3和图4所示，图2中，在150mmol/L NaCl处出现一洗脱峰，另在以含8mol/L尿素、0.5mol/LNaCl，pH6.5的20mmol/L 磷酸盐缓冲液作清洁洗柱时出现一个主峰；

[0145] 如图3所示，SDS-PAGE电泳分析结果表明，150mmol/L NaCl处洗脱峰为目的蛋白，经凝胶扫描分析其纯度为98%以上；

[0146] 对应图4，检测结果如表1所示，HPLC分析目的蛋白的纯度为99%以上，经DPEI-WP硅胶阴离子交换层析纯化后的目的蛋白得率约为60%。

[0147] 表1. 检测器分析结果（对应图4）

[0148]峰# 保留时间 面积 面积% 高度 高度% 理论塔板# 分离度
1 18.401 5987149 99.343 121762 99.467 3569.428 0.000
2 21.849 39617 0.657 653 0.533 3889.331 2.619
总计 6026766 100.000 122414 100.000

[0149] 3.rTPA38KDa 包涵体蛋白原液的质量分析

[0150] 所获得的rTPA38KDa 包涵体蛋白原液进行质量分析，结果如表2所示。

[0151] 表2. TPA38KDa包涵体蛋白原液质量分析结果

[0152]HPLC纯度 电泳纯度（%） 宿主蛋白 宿主DNA内毒素 效价
99.34% 99.42% 未检出 未检出 未检出 与参比品一致

[0153] 结果表明，经本发明的复性与纯化方法制备的rTPA38KDa 包涵体蛋白符合人体使用要求。

[0154] 实施例3

[0155] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的具体实施例3如图1所示，本实施例的主要技术方案与实施例1相同，在本实施例中未解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。本实施例与实施例1的区别在于：

[0156] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法包括有以下步骤：

[0157] 步骤101. rTPA38KDa 包涵体蛋白的构建与表达

[0158] 本步骤与实施例1相同。

[0159] 步骤102.rTPA38KDa 工程菌的培养发酵

[0160] 将工程菌甘油菌种按1%（V/V）的接种比例接种于含LB培养基的三角瓶，于37℃、150rpm振荡培养过夜。按10%（V/V）比例接种于种子罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.5、和溶解氧30%以上条件下培养2.5hr。种子液按30%（V/V）比例接种于主发酵罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.5、和溶解氧30%以上条件下培养2.0hr后加入IPTG至终浓度1 mmol/L，继续培养3.5hr，得到工程菌培养液。

[0161] 步骤103.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白

[0162] 步骤103a. rTPA38KDa 工程菌破碎

[0163] 将工程菌培养液以连续流离心机14000 rpm离心，以pH7.0、15mmol/L磷酸盐缓冲液按15%（W/V）比例悬浮菌体，用高压匀浆机在800Mpa压力下破碎菌体，11000rpm离心12min，收集沉淀；

[0164] 步骤103b. rTPA38KDa 包涵体蛋白的洗涤

[0165] 步骤103b1：采用含0.5% Triton X100、pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液按8%（W/V）比例悬浮沉淀，280rpm室温搅拌25min，11000rpm离心12min，收集沉淀；

[0166] 步骤103b2:重复上述洗涤步骤103b1；

[0167] 步骤103b3:再以pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0168] 在步骤103b3之后，离心后即获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。

[0169] 步骤104. rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0170] 以含6mmol/L尿素和0.5mmol/L DTT的pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，在280rpm条件下室温搅拌3hr以上，然后经0.45??m滤膜过滤后获得rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液。

[0171] 步骤105.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0172] 第一次阴离子交换层析采用DEAE-Sepharose FF层析介质（GE公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，样品为rTPA38KDa包涵体蛋白变性液，上样与洗脱流速均为135cm/hr。

[0173] 采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱2CV，然后使用A液-B液梯度洗脱30CV，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白第一缓冲液；

[0174] 具体的，A液为含4mmol/L尿素、0.5mmol/L DTT， pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0175] 具体的，B液为含8mmol/L磷酸氢二钠、1.5mmol/L尿素， pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0176] 具体的，C液为含8 mmol/L磷酸氢二钠、1.5mmol/L尿素、220 mmol/L NaCl，pH7.5的15mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0177] 具体的，采用0.5mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0178] 更具体的，将收集的洗脱峰采用0.5mol/L的HCl调节 pH至7.2。

[0179] 步骤106.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0180] 第二次阴离子交换层析采用采用PEI-WP硅胶层析介质（JT Baker公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，上样与洗脱流速均为135cm/hr。

[0181] 将含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱30CV，上样后，使用D液平衡层析柱2CV，然后使用D液-E液梯度洗脱15CV，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0182] 具体的，D液为pH6.0的15mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0183] 具体的，E液为含0.4 mmol/L氯化钠， pH6.0的15mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0184] 具体的，第二次阴离子交换层析采用含6mol/L尿素、0.4mol/L NaCl，pH6.0的15mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0185] 步骤107.制备rTPA38KDa包涵体蛋白原液

[0186] 将获得含有高度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液，于-30℃保存。

[0187] 实施例4

[0188] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的具体实施例4如图1所示，本实施例的主要技术方案与实施例1相同，在本实施例中未解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。本实施例与实施例1的区别在于：

[0189] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法包括有以下步骤：

[0190] 步骤101. rTPA38KDa 包涵体蛋白的构建与表达

[0191] 本步骤与实施例1相同。

[0192] 步骤102.rTPA38KDa 工程菌的培养发酵

[0193] 将工程菌甘油菌种按1%（V/V）的接种比例接种于含LB培养基的三角瓶，于37℃、200rpm振荡培养过夜。按10%（V/V）比例接种于种子罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.7、和溶解氧30%以上条件下培养3.5hr。种子液按10%（V/V）比例接种于主发酵罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.7、和溶解氧30%以上条件下培养3hr后加入IPTG至终浓度1 mmol/L，继续培养4.5hr，得到工程菌培养液。

[0194] 步骤103.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白

[0195] 步骤103a. rTPA38KDa 工程菌破碎

[0196] 将工程菌培养液以连续流离心机16000 rpm离心，以pH7.0、25mmol/L磷酸盐缓冲液按30%（W/V）比例悬浮菌体，用高压匀浆机在800Mpa压力下破碎菌体，13000 rpm离心8min，收集沉淀；

[0197] 步骤103b. rTPA38KDa 包涵体蛋白的洗涤

[0198] 步骤103b1：采用含1.5% Triton X100、pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液按12%（W/V）比例悬浮沉淀，320rpm室温搅拌15min，13000 rpm离心8min，收集沉淀；

[0199] 步骤103b2:重复上述洗涤步骤103b1；

[0200] 步骤103b3:再以pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0201] 在步骤103b3之后，离心后即获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。

[0202] 步骤104. rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0203] 以含10mmol/L尿素和1.5mmol/L DTT的pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，在320rpm条件下室温搅拌3hr以上，然后经0.45??m滤膜过滤后获得rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液。

[0204] 步骤105.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0205] 第一次阴离子交换层析采用DEAE-Sepharose FF层析介质（GE公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，样品为rTPA38KDa包涵体蛋白变性液，上样与洗脱流速均为165cm/hr。

[0206] 采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱2CV，然后使用A液-B液梯度洗脱30CV，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白第一缓冲液；

[0207] 具体的，A液为含8mmol/L尿素、1.5mmol/L DTT， pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0208] 具体的，B液为含12 mmol/L磷酸氢二钠、2.5mmol/L尿素， pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0209] 具体的，C液为含12 mmol/L磷酸氢二钠、2.5mmol/L尿素、280 mmol/L NaCl，pH8.5的25mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0210] 具体的，采用1.5mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0211] 更具体的，将收集的洗脱峰采用1.5mol/L的HCl调节 pH至5.2。

[0212] 步骤106.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0213] 第二次阴离子交换层析采用采用PEI-WP硅胶层析介质（JT Baker公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，上样与洗脱流速均为165cm/hr。

[0214] 将含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱30CV，上样后，使用D液平衡层析柱2CV，然后使用D液-E液梯度洗脱15CV，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0215] 具体的，D液为pH6.8的25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0216] 具体的，E液为含0.6 mmol/L氯化钠， pH6.5的25mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0217] 优选的，采用含10mol/L尿素、0.6mol/L NaCl，pH6.8的25mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0218] 步骤107.制备rTPA38KDa包涵体蛋白原液

[0219] 将获得含有高度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液，于-30℃保存。

[0220] 实施例5

[0221] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法的具体实施例5如图1所示，本实施例的主要技术方案与实施例1相同，在本实施例中未解释的特征，采用实施例1中的解释，在此不再进行赘述。本实施例与实施例1的区别在于：

[0222] 本发明的一种结核分枝杆菌重组包涵体蛋白的复性与纯化方法包括有以下步骤：

[0223] 步骤101. rTPA38KDa 包涵体蛋白的构建与表达

[0224] 本步骤与实施例1相同。

[0225] 步骤102.rTPA38KDa 工程菌的培养发酵

[0226] 将工程菌甘油菌种按1%（V/V）的接种比例接种于含LB培养基的三角瓶，于37℃、180rpm振荡培养过夜。按10%（V/V）比例接种于种子罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.8和溶解氧30%以上条件下培养3hr。种子液按10%（V/V）比例接种于主发酵罐（全自控发酵罐），在温度37℃、pH6.8和溶解氧30%以上条件下培养2.5hr后加入IPTG至终浓度
1 mmol/L，继续培养4hr，得到工程菌培养液。

[0227] 步骤103.制备初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白

[0228] 步骤103a. rTPA38KDa 工程菌破碎

[0229] 将工程菌培养液以连续流离心机15000 rpm离心，以pH7.0、23mmol/L磷酸盐缓冲液按20%（W/V）比例悬浮菌体，用高压匀浆机在800Mpa压力下破碎菌体，12000 rpm离心11min，收集沉淀；

[0230] 步骤103b. rTPA38KDa 包涵体蛋白的洗涤

[0231] 步骤103b1：采用含1.2% Triton X100、pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液按11%（W/V）比例悬浮沉淀，310rpm室温搅拌23min，12000 rpm离心9min，收集沉淀；

[0232] 步骤103b2:重复上述洗涤步骤103b1；

[0233] 步骤103b3:再以pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤1次。

[0234] 在步骤103b3之后，离心后即获得初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白。

[0235] 步骤104. rTPA38KDa 包涵体蛋白的裂解

[0236] 以含9mmol/L尿素和1.3mmol/L DTT的pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液按10%（W/V）比例悬浮初步纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白，在310rpm条件下室温搅拌3hr以上，然后经0.45??m滤膜过滤后获得rTPA38KDa 包涵体蛋白的变性液。

[0237] 步骤105.第一次阴离子交换层析方法进行复性和纯化

[0238] 第一次阴离子交换层析采用DEAE-Sepharose FF层析介质（GE公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，样品为rTPA38KDa包涵体蛋白变性液，上样与洗脱流速均为140cm/hr。

[0239] 采用A液平衡含DEAE-Sepharose FF层析介质的层析柱4CV，上样后，用A液平衡层析柱2CV，然后使用A液-B液梯度洗脱30CV，再使用C液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，获得含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白第一缓冲液；

[0240] 具体的，A液为含7mmol/L尿素、1.3mmol/L DTT， pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液的平衡液；

[0241] 具体的，B液为含11 mmol/L磷酸氢二钠、2.3mmol/L尿素， pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液；

[0242] 具体的，C液为含11 mmol/L磷酸氢二钠、2.3mmol/L尿素、270 mmol/L NaCl，pH8.2的23mmol/L Tris-Cl缓冲液。

[0243] 具体的，采用1.2mol/L的NaOH清洁层析柱。

[0244] 更具体的，将收集的洗脱峰采用1.2mol/L的HCl调节 pH至6.0。

[0245] 步骤106.第二次阴离子交换层析方法进一步纯化

[0246] 第二次阴离子交换层析采用采用PEI-WP硅胶层析介质（JT Baker公司产品），柱高20cm（任意内径），以带280 nm和254 nm波长检测仪的任意常压层析系统进行，上样与洗脱流速均为140cm/hr。

[0247] 将含有已复性和中度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第一缓冲溶液采用G25柱层析或超滤方法置换成缓冲溶液D液，采用D液平衡含PEI-WP 硅胶层析介质的层析柱30CV，上样后，使用D液平衡层析柱2CV，然后使用D液-E液梯度洗脱15CV，收集洗脱峰，获得含有高度纯化的rTPA38KDa 包涵体蛋白的第二缓冲液；

[0248] 具体的，D液为pH6.6的23mmol/L 磷酸钠盐缓冲液的平衡液；

[0249] 具体的，E液为含0.5 mmol/L氯化钠， pH6.2的23mmol/L 磷酸钠盐缓冲液。

[0250] 优选的，采用含10mol/L尿素、0.6mol/L NaCl，pH6.2的25mmol/L 磷酸钠盐清洁层析柱。

[0251] 步骤107.制备rTPA38KDa包涵体蛋白原液

[0252] 将获得含有高度纯化的rTPA38KDa包涵体蛋白的第二缓冲液进行超滤或透析获得rTPA38KDa包涵体蛋白原液，于-30℃保存。

[0253] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。