一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的方法转让专利
申请号 : CN201110231994.4
文献号 : CN102296039B
文献日 : 2013-04-24
发明人 : 张偲 , 张长生 , 田新朋 , 李苏梅 , 张文军 , 张海波 , 张光涛 , 尹浩 , 鞠建华
申请人 : 中国科学院南海海洋研究所
摘要 :
本发明公开了一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的方法。假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。假诺卡氏菌SCSIO 01299能够产生抗生素Deoxynyboquinone，因此可以利用假诺卡氏菌SCSIO 01299在制备Deoxynyboquinone，从而为生产具有抗肿瘤活性的抗生素Deoxynyboquinone提供了一条新的方法。
权利要求 :
1.一种假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299，其保藏号为：CCTCC NO：M
2011255。
2.一种利用权利要求1所述的假诺卡氏菌SCSIO 01299制备Deoxynyboquinone的方法，其特征在于，所述的Deoxynyboquinone是从权利要求1所述的假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中制备分离得到的。
3.根据权利要求2所述的利用假诺卡氏菌SCSIO 01299制备Deoxynyboquinone的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
b)将浸膏A或浸膏B或浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比100∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.1，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1∶1作为流动相洗脱，再经重结晶得到Deoxynyboquinone。
4.根据权利要求3所述的利用假诺卡氏菌SCSIO 01299制备Deoxynyboquinone的方法，其特征在于，所述的a)步骤的制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物是通过以下方法制备：将活化的假诺卡氏菌SCSIO 01299接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉
15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO32g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4。
5.根据权利要求3所述的利用假诺卡氏菌SCSIO 01299制备Deoxynyboquinone的方法，其特征在于，所述的重结晶是在氯仿/甲醇体积比10∶1的条件下重结晶。
6.权利要求1所述的假诺卡氏菌SCSIO 01299在制备Deoxynyboquinone中的应用。
说明书 :
一种假诺卡氏菌及利用其制备Deoxynyboquinone的方法
技术领域：
[0001] 本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种能够产生抗生素Deoxynyboquinone的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299新种，以及利用该菌制备抗生素Deoxynyboquinone的方法。
背景技术：
背景技术：
[0002] Deoxynyboquinone(DNQ)是一个已经人工合成的化合物，其结构如式(I)所示，该化合物具有显著细胞毒活性，在以产生活性氧自由基(ROS)为抗性机理的抗肿瘤药物中，该化合物表现出优异的特征-在缺氧条件下仍显示出较强活性，成药潜力巨大。与之结构相近的化合物SCH 538415活性较之弱10倍(Bair，J.S，；Palchaudhuri，R.；Hergenrother，P.J.，Chemistry and biology of deoxynyboquinone，a potent inducer of cancer cell death.J Am Chem Soc2010，132，(15)，5469-78.)。
[0003]
[0004] 式(I)发明内容：
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。
[0006] 本发明的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299是从我国南海北部(E120°0.975′，N19°0.664′)水深3258米的海底沉积物中分离获得的。常规PCR扩
增假诺卡氏菌SCSIO 01299的16S rDNA并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列号JN204514。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该T
菌株与Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 的相似度为98％，说明该菌株SCSIO
01299为假诺卡氏菌属。如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组假诺卡氏菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于假诺卡氏菌属的一种。
增假诺卡氏菌SCSIO 01299的16S rDNA并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列号JN204514。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该T
菌株与Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 的相似度为98％，说明该菌株SCSIO
01299为假诺卡氏菌属。如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组假诺卡氏菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于假诺卡氏菌属的一种。
[0007] 形态学特征和生理生化分析：
[0008] 该菌属于革兰氏阳性，好氧放线菌，基丝微黄分枝，气丝白色分支并分化成卷曲的孢子链；孢子杆状(图2)，长1.3-2.5μm，表面光滑。Czapek’s agar有可溶性色素产生。能水解淀粉、纤维素、吐温20，40，60；明胶液化、牛奶凝固和胴化阴性，H2S产生，吐温80水解，氧化酶和硝酸盐还原反应阴性。接触酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利用D-阿拉伯糖，D-纤维二糖，草酸盐，D-半乳糖，D-葡萄糖，肌醇，D-麦芽糖，D-甘露醇，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核糖，D-蔗糖，卫矛醇，D-乳糖，D-山梨糖和木糖醇，果糖和D-木糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6.0-8.0，0-15％和4-40℃。细胞壁含有meso-DAP。磷脂组分为PG，DPG，PE，PI，PIM和未知磷脂PL。优势醌为MK-8(H4)。主要脂肪酸为i-C16:0，i-C16:1H，ai-C17:0和i-C17:1w9c。G+C摩尔含量为73.2(±0.5)％。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与T
已知最接近的菌株Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 有较大的差异，且基因组杂交显示其与最相似菌株的杂交值为36％；远低于种内差异标准的70％(Stackebrandt，E.&Ebers，J.Taxonomic parameters revisited：tarnished gold standards.Microbiol Today.(2006).33，152-155.)；因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，并将此菌命名为：假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO
01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。
已知最接近的菌株Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 有较大的差异，且基因组杂交显示其与最相似菌株的杂交值为36％；远低于种内差异标准的70％(Stackebrandt，E.&Ebers，J.Taxonomic parameters revisited：tarnished gold standards.Microbiol Today.(2006).33，152-155.)；因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，并将此菌命名为：假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO
01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。
[0009] 本发明发现假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299能够产生抗生素Deoxynyboquinone。因此本发明的第二个目的是提供了一种制备抗生素Deoxynyboquinone的方法，所述的Deoxynyboquinone是从假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中制备分离得到的。
[0010] 本发明优选通过以下方法从假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299的发酵培养物中制备分离得到抗生素Deoxynyboquinone，具体步骤如下：
[0011] a)制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；
[0012] b)将浸膏A或浸膏B或浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比100∶1梯度洗脱下来的馏分Fr1，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1∶1作为流动相洗脱，再经重结晶得到Deoxynyboquinone。
[0013] 所述的a)步骤的制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的假诺卡氏菌SCSIO 01299接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO32g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4。经本方法制备的假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中Deoxynyboquinone的含量比较高。
[0014] 由于本发明的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299能够产生抗生素Deoxynyboquinone，因此本发明的第三个目的是提供假诺卡氏菌SCSIO 01299在制备Deoxynyboquinone中的应用。
[0015] 本发明的假诺卡氏菌SCSIO 01299是假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，该菌能够产生具有抗肿瘤活性的抗生素Deoxynyboquinone，因此为Deoxynyboquinone的制备提供了一条新的方法。
[0016] 本发明的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011255。附图说明：
[0017] 图1是Pseudonocardia sp.SCSIO 01299基于16s rDNA序列的邻接法重建的与之亲缘关系最近的种之间关系的系统发育树；
[0018] 图2是Pseudonocardia sp.SCSIO 01299的孢子形态扫描电镜图；
[0019] 图3是上清液的提取物-浸膏A和菌丝体的提取物-浸膏B的高效液相色谱图，其中1为Deoxynyboquinone，HPLC条件：色谱柱为phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流动相包括流动A相和流动B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+0.08％(体积分数)的三氟乙酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5-0∶100，20-21min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100，21-22min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100-95∶5，
22-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5，检测波长254nm，流速1ml/min。
22-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5，检测波长254nm，流速1ml/min。
[0020] 图4是化合物1(Deoxynyboquinone)的X-衍射图。具体实施方式：
[0021] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0022] 实施例1：
[0023] 一、假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299的分离和鉴定
[0024] 假诺卡氏菌SCSIO 01299鉴定中涉及的基因组DNA的提取，16S rDNA的PCR扩增，序列比对和系统进化树的建立方法以及生理学、化学和形态学鉴定等，均参考文献[Tian，X.P，Zhi，X.Y.，Qiu，Y. Q.，Zhang，Y. Q.，Tang，S.K.，Xu，L. H.，Zhang，S.，Li，W. J.Sciscionella marina gen.nov.，sp.nov.，a marine actinomycete isolated from a sediment in the northern South China Sea.Int J Syst EvolMicrobiol，2009，59(Pt2)：222-228]。
[0025] 本发明的假诺卡氏菌SCSIO 01299是从我国南海北部(E 120°0.975′，N19°0.664′)水深3258米的海底沉积物中分离获得的。分离培养基为现有技术中的ISP5培养基，每升含有L-天门冬氨酸1.0g，甘油10.0g，K2HPO41.0g，微量元素溶液1ml，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 72，*微量元素溶液为FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g。分离培养条件为：28℃，14天。由此从海底沉积物分离纯化得到一菌株SCSIO 01299(假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299)。
[0026] 按照参考文献中的方法或者常规方法提取该菌株SCSIO 01299的基因组DNA，应用常规PCR扩增该菌株的16S rDNA并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列号JN204514。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该T菌株与Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 的相似度为98％，说明该菌株SCSIO
01299为假诺卡氏菌属。如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组假诺卡氏菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于假诺卡氏菌属的一种。
01299为假诺卡氏菌属。如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组假诺卡氏菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于假诺卡氏菌属的一种。
[0027] 形态学特征和生理生化分析：
[0028] 菌株SCSIO 01299属于革兰氏阳性，好氧放线菌，基丝微黄分枝，气丝白色分支并分化成卷曲的孢子链；孢子杆状(如图2所示)，长1.3-2.5μm，表面光滑。Czapek’s agar有可溶性色素产生。能水解淀粉、纤维素、吐温20，40，60；明胶液化、牛奶凝固和胴化阴性，H2S产生，吐温80水解，氧化酶和硝酸盐还原反应阴性。接触酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利用D-阿拉伯糖，D-纤维二糖，草酸盐，D-半乳糖，D-葡萄糖，肌醇，D-麦芽糖，D-甘露醇，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核糖，D-蔗糖，卫矛醇，D-乳糖，D-山梨糖和木糖醇，果糖和D-木糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6.0-8.0，0-15％和4-40℃。细胞壁含有meso-DAP。磷脂组分为PG，DPG，PE，PI，PIM和未知磷脂PL。优势醌为MK-8(H4)。主要脂肪酸为i-C16∶0，i-C16∶1H，ai-C17∶0和i-C17∶1w9c。G+C摩尔含量为73.2(±0.5)％。根据以上形态学、生理学、T化学等分析，其与已知最接近菌株Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050 有较大T
的差异，且基因组杂交显示其与最接近株菌Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050的杂交值为36％；远低于种内差异标准的70％(Stackebrandt，E.&Ebers，J.Taxonomic parameters revisited：tarnished gold standards.Microbiol Today.(2006).33，
152-155.)。因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，并将此菌命名为：假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。
的差异，且基因组杂交显示其与最接近株菌Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050的杂交值为36％；远低于种内差异标准的70％(Stackebrandt，E.&Ebers，J.Taxonomic parameters revisited：tarnished gold standards.Microbiol Today.(2006).33，
152-155.)。因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，并将此菌命名为：假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。
[0029] 二、Deoxynyboquinone的分离和制备
[0030] 1、培养基
[0031] A、种子培养基：每升含有淀粉15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO32g，海盐30g，余量为水，pH 7.4。121℃，灭菌30min；
[0032] B、发酵培养基：配方同种子培养基。121℃，灭菌30min。
[0033] 2、发酵
[0034] 2.1、种子培养：将培养皿上活化的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299的单菌落分别接入18瓶，每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28℃，-1200r·min ，培养48h，制得种子液900mL。
[0035] 2.2、发酵培养：将种子液以10％的接种量(体积百分比)接入到9L发酵培养基-1(置于250mL的锥形培养瓶，每瓶含有50ml发酵培养基，共180瓶)中，28℃，200r·min ，振荡培养120h，得到9L发酵培养物。
[0036] 3、萃取
[0037] 发酵培养物先进行离心分离(3500r·min-1，8min)，得到9L体积的上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液用2倍体积的丁酮萃取4次，合并萃取液，丁酮层减压蒸馏得上清液提取物-浸膏A(11.3g)；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，提取液减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏得菌丝体提取物-浸膏B(3.2g)。
[0038] 4、化合物Deoxynyboquinone的提取分离
[0039] 经HPLC检测表明(如图3)，由图3可以看出，浸膏A和浸膏B中均含有Deoxynyboquinone(1号峰)。将浸膏A和浸膏B合并，合并后的粗提物经常压硅胶柱(300-400目)层析，以氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比为100∶0到0∶100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比100∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.1(1.2g)，蒸干，过Sephadex LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1∶1作为流动相洗脱，然后在氯仿/甲醇体积比10∶1的条件下重结晶得到化合物1(150.3mg)。
[0040] 通过结构分析，对本发明的从假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中制备得到的化合物1的鉴定结果如下：
[0041] 化合物1：红色针晶(甲醇)，UV(CH3CN:H2O：Trifluoroacetic acid)：203.0，276.3，353.8，1 13 +
460.7nm.HNMR(500MHz，CDCl3)and C NMR(125MHz，CDCl3)，见表1。ESIMS m/z 285.0[M+H]，+ - -
569.7[2M+H]，283.2[M-H]，567.4[2M-H]。从氢谱和碳谱上能看到化合物1含有3个甲基，包括1个单峰甲基和2个双峰甲基[δH4.01(s，Me-15)，2.59(d，J＝1.0Hz，Me-16)；，
2
2.55(d，J＝1.0Hz，Me-17)δC33.9(q，Me-15)，23.0(q，Me-16)，22.1(q，Me-17)]，2个sp 杂化的次甲基[δH6.82(d，J＝1.0Hz，H-3)，δC 126.8(d，C-3)；δH6.78(d，J＝1.0Hz，H-7)，
2
δC 127.1(d，C-7)]，和10个季碳，包括6个sp 杂化的季碳和4个羰基碳。根据HMBC相关谱可看到，H-15与C-2/C-11相关，H-3与C-2/C-12/C-16相关，H-16与C-3/C-4/C-12相关，可得出环A；H-7与C-8/C-13/C-17相关，H-17与C-6/C-7/C-13相关，推测该化合物可能含有环B；结合碳谱中2个羰基碳(δC182.4，176.9)，和X-衍射图(图4)，确定该结构与已知化合物deoxynyboquinone[式(I)]结构一致。
460.7nm.HNMR(500MHz，CDCl3)and C NMR(125MHz，CDCl3)，见表1。ESIMS m/z 285.0[M+H]，+ - -
569.7[2M+H]，283.2[M-H]，567.4[2M-H]。从氢谱和碳谱上能看到化合物1含有3个甲基，包括1个单峰甲基和2个双峰甲基[δH4.01(s，Me-15)，2.59(d，J＝1.0Hz，Me-16)；，
2
2.55(d，J＝1.0Hz，Me-17)δC33.9(q，Me-15)，23.0(q，Me-16)，22.1(q，Me-17)]，2个sp 杂化的次甲基[δH6.82(d，J＝1.0Hz，H-3)，δC 126.8(d，C-3)；δH6.78(d，J＝1.0Hz，H-7)，
2
δC 127.1(d，C-7)]，和10个季碳，包括6个sp 杂化的季碳和4个羰基碳。根据HMBC相关谱可看到，H-15与C-2/C-11相关，H-3与C-2/C-12/C-16相关，H-16与C-3/C-4/C-12相关，可得出环A；H-7与C-8/C-13/C-17相关，H-17与C-6/C-7/C-13相关，推测该化合物可能含有环B；结合碳谱中2个羰基碳(δC182.4，176.9)，和X-衍射图(图4)，确定该结构与已知化合物deoxynyboquinone[式(I)]结构一致。
[0042]
[0043] 式(I)
[0044] 表1：化合物1的核磁数据归属
[0045]
[0046] 注：1H-NMR数据于500MHz测定，括号中为偶合常数(Hz)，13C-NMR数据于125MHz测定，核磁数据在氘代吡啶中测得。