一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶、其基因的核苷酸序列及其应用

摘要

本发明涉及一种7-木糖紫杉醇糖基水解酶，其氨基酸序列，包括SEQ ID NO：2所示序列的至少8个氨基酸序列；还涉及编码7-木糖紫杉醇糖基水解酶的核苷酸序列，以及含有该核苷酸序列的表达载体及宿主细胞；本发明还涉及7-木糖紫杉醇糖基水解酶或含有7-木糖紫杉醇糖基水解酶的宿主细胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。

权利要求

1.一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶，其特征在于，所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种编码权利要求1所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

4.一种含有权利要求2所述核苷酸序列的表达载体。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞，其中，细菌选自大肠杆菌，放线菌选自链霉菌，丝状真菌选自担子菌、丝状子囊菌，酵母菌选自毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母，动物细胞选自昆虫细胞。

7.根据权利要求1所述的7-木糖紫杉烷糖基水解酶或含有权利要求1所述的7-木糖紫杉烷糖基水解酶的宿主细胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶水解去除木糖基时底物选自7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖紫杉醇、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖巴卡亭III、7-木糖紫杉醇C。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉烷糖基水解酶水解去除木糖基后得到的产物选自10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III、10-去乙酰紫杉醇C、紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡亭III、紫杉醇C。

10.根据权利要求8、9任一所述的应用，其特征在于，所述的7-木糖紫杉烷糖基水解酶在以7-糖基紫杉烷为原料制备7-羟基紫杉烷时的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的7-糖基紫杉烷原料选自带有木糖基的紫杉烷类的混合物。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的紫杉烷类的混合物选自紫杉属植物组织、植物细胞培养物或微生物细胞培养物。

13.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的的7-木糖紫杉烷糖基水解酶在进行水解反应时的溶剂选自水、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

说明书

一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶、其基因的核苷酸序列及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种水解酶及编码该酶的核苷酸序列，具体讲，涉及一种专一性水解紫杉烷木糖苷的7-木糖紫杉烷糖基水解酶及其核苷酸序列，以及应用。

背景技术

[0002] 紫杉醇( Paclitaxel)主要由红豆杉属植物产生，作为二十世纪90年代抗癌药的重要成就之一，自问世以来，其独特的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤活性令世人瞩目[Kingston DGI,et al.The taxane diterpenoids.In:Herz W,et al.eds.Progress in the chemistry of organic natural products.New York:Springer-Verlag,1993,161-165]。它可以与微管蛋白结合，促进微管蛋白的聚合并抑制其解聚，阻止细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞停滞于G2期和M期。目前紫杉醇在临床上被用作乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等的一线药物。对头颈部癌症、黑色素瘤、结肠癌以及由HIV引起的卡波济肉瘤也有较好的疗效。

[0003] 紫杉醇在红豆杉植株中含量很低，即使是含量最高的部位树皮中也只有万分之二左右[美国专利US 6028206]。如果以红豆杉树皮为原料，每提取1公斤紫杉醇就需要10吨树皮(相当于2000棵左右的树木)！而满足1例病人的用药量相当于毁掉3-4棵百年老树。目前，灌木型红豆杉杂交种的苗圃栽培被认为是已知的解决紫杉醇来源最简易、资源可再生、成本最低廉的方法。另外，1988年法国Denis等从欧洲红豆杉的针叶中得到含量为0.1％的紫杉醇前体化合物10-去乙酰巴卡亭III(10-deacetylbaccatin III)，以此为前体半合成了紫杉醇，并研制出比紫杉醇抗肿瘤活性更强、有更好水溶性的多烯紫杉 醇Taxotere[Denis JN,Greene AE.J.Am Chem Soc1988,110(17):5917-5919；Ringel I,Horwitz SB.J Nat Cancer Inst 1991,83(4):288-291]。

[0004] 尽管红豆杉植株中紫杉醇的含量非常低，但具有紫杉醇母核结构的C-7木糖紫杉烷类化合物(紫杉烷木糖苷)，包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol,XDT)、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III(7-β-xylosyl-10-deacetylbaccatin III,XDB)、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱(7-β-xylosyl-10-deacetylcepholomanine,XDC)等，却含量丰富，例如，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol,XDT)的含量可达紫杉醇的10倍以上，在红豆杉Taxus wallichiana的树皮中，XDT的收率甚至可高达0.5％[美国专利US6028206]。这些在红豆杉材料中大量存在的紫杉醇类似物如果采用化学或生物方法去除其木糖基，产生C-7位羟基化产物，用于制备紫杉醇或多烯紫杉醇、或其中间体，则可以达到提高红豆杉资源利用率的目的。而这方面的研究已经取得了一些进展。

[0005] 但化学方法存在许多不足，如：在高碘酸盐的氧化过程中容易导致7-木糖紫杉烷其他侧链的降解，收率低，反应过程较繁琐，对环境有污染等。生物方法则由于符合“绿色化学”的理念而越来越收到重视。

[0006] 美 国 及 欧 洲 专 利 [US005700669A；EP0668360A1] 及 发 表 的 相 关 论 文[Hanson,RL,et al.Biotechnol Appl Biochem 1997,26:153-158]公开 了利 用细 菌Moraxella sp.、Bacillus macerans、Bacillus circulans和Micrococcus sp.将C-7木糖紫杉烷转化为C-7羟基紫杉烷的水解方法。其中，Moraxella sp.(ATCC55475)的转化能力最强，在2ml细胞悬浮液中加入0.5mg 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)(湿细胞91.5mg/mL；XDT0.25mg/ml)，28℃、12rpm条件下极向(end-over-end)混合21小时，没有XDT剩余，HPLC检测到产物DT的产率为0.23mg/ml。在另一个实验中，2ml反应悬浮液中的62.5mg湿菌体在7小时内可将0.5mg XDT几乎完全转化为DT。

[0007] 中 国专 利[ 申请 号200610046296.6] 及发 表 的 相 关 论文 [Hao DC,Ge GB,Yang L.FEMS Microbiol Lett 2008,284:204–212]公开了利用放线菌Leifsonia shinshuensis DICP 16(CCTCC No.M 206026)将C-7木糖紫杉烷转化为C-7羟基紫杉烷的水解方法。利用类似于上述美国专利的培养及转化条件，在2ml菌体悬浮液中加入1mg XDT，21小时后反应液中无XDT残留，产生0.4mg/ml DT。在另一个实验中，在7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III最佳底物浓度(1.95mg/ml)条件下，反应40小时后可将底物几乎完全转化成产物。

[0008] 另一份中国专利[申请号200710012698.9]公开了放线菌纤维化纤维单孢菌(Cellulosimicrobium cellulans,XZ-5CCTCC No.M 207130)、水解酶及其在紫杉烷转化方面的用途：将10ml XDT(浓度为5mg/ml)加入到90ml粗酶液(100ml培养液加入1ml 30℃培养2天的纤维化纤维单孢菌种子液，150rpm，30℃摇瓶培养5天，离心收集上清即为粗酶液)，50rpm、30℃下反应20小时，得到40mg DT(转化率91％)。

[0009] 除此之外，未见其他相关报道。

[0010] 上述生物方法在水解7-木糖紫杉烷方面均有潜在的应用价值，但由于现存技术中的细胞酶量普遍偏低、底物在水中的溶解度不高等因素，导致产物的产率(单位体积反应液或单位体积菌体转化底物为产物的质量数)仍然低下，不符合规模化工业生产的要求。

[0011] 本发明在前期工作获得能转化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的1株真菌的基础上，从培养的菌体中分离并纯化了能催化上述反应的糖基水解酶，根据LC-MS/MS对该酶几个肽段的氨基酸序列分析结果，设计出一系列简并引物，通过巢式PCR、RACE和Genomic Walking等分子生物学技术克隆并测定出该酶的核苷酸编码序列及其结构基因，将该基因的核苷酸编码序列或其开放阅读框(ORF)与适当表达载体连接后，导入到生长快、适合高密度发酵的宿主如毕赤酵母中，重组菌可高效转化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷。

[0012] 尽管能水解木糖残基的普通β-木糖苷酶已从细菌、放线菌、真菌等多种来源分离得到[Lama L,et al.Res Microbiol 2004,155(4):283-289；Belfaquih,Penninckx MJ.Enzyme Microb Technol 2000,27(1-2):114-121；Tuohy MG,et al.Biochem J1993,290(Pt 2):515–523；Golubev AM,et al.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr
2000,56(Pt 8):1058–1060；Pan I,Yao H,Li Y.Enzyme Microb Technol 2001,28(2–
3):196–201；Rizzatti AC,et al.J Ind Microbiol Biotechnol 2001,26(3):156–160；
Saha BC.J Ind Microbiol Biotechnol 2001,27(4):241–245；Gargouri M,et al.J Mol Cataly B:Enzymati 2004,29,Issues 1-6:89-94]。一些β-木糖苷酶基因，如几种真菌来源的编码β-木糖苷酶的基因[Margolles-Clark E,et al.Appl Environ Microbiol
1996,62(10):3840–3846；van Peij NN,et al.Eur J Biochem 1997,245(1):164–173；
Perez-Gonzalez JA,et al.Appl Environ Microbiol 1998,64(4):1412–1419；Kitamoto N,et al.Appl Environ Microbiol 1999,65(1):20–24；Reen FJ,et al.Biochem Biophys Res Commun 2003,305(3):579-585],已被克隆和测序，但是，包括所有原核生物及真核生物在内，尚未见到能专一性水解去除7-木糖紫杉烷的木糖基的基因克隆的报道或专利。因此，本发明首次克隆并异源表达了能专一性地催化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷这一水解反应的糖基水解酶的基因，该基因序列与GenBank中已注册的所有DNA序列相比较差异极大，几乎没有一致性(identity),最为接近者也多为假定蛋白基因序列，且覆盖率仅3～
7％。

发明内容

[0013] 本发明的首要发明目的在于提供一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶。

[0014] 本发明的第二发明目的在于提供编码该酶的核苷酸序列。

[0015] 本发明的第三发明目的在于提供含有该核苷酸序列的表达载体。

[0016] 本发明的第四发明目的在于提供含有该表达载体的宿主细胞。

[0017] 本发明的第五发明目的在于提供了该酶的应用。

[0018] 为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：

[0019] 本发明提供一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶，所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2所示序列的至少8个氨基酸序列，优选包括SEQ ID NO:2所示序列的至少15个氨基酸序列，更优选包括SEQ ID NO:2所示序列的至少240个氨基酸序列，进一步优选包括SEQ ID NO:2所示序列的至少321个氨基酸序列，更优选包括SEQ ID NO:2所示序列的至少481个氨基酸序列。

[0020] 本发明还提供了一种编码所述7-木糖紫杉烷糖基水解酶的核苷酸序列。

[0021] 其中，该核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的至少24个核苷酸。

[0022] 本发明还提供两种含有该核苷酸序列的表达载体。

[0023] 本发明还提供一种含有该表达载体的宿主细胞。

[0024] 其中，所述宿主细胞优选为细菌、放线菌、丝状真菌、酵母菌、植物细胞、动物细胞；进一步优选的，细菌选自大肠杆菌，放线菌选自链霉菌，丝状真菌选自担子菌、丝状子囊菌，酵母菌选自毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母，动物细胞选自昆虫细胞。

[0025] 本发明还提供7-木糖紫杉烷糖基水解酶或含有7-木糖紫杉烷糖基水解酶的宿主细胞在水解去除木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的应用。

[0026] 其中，7-木糖紫杉烷糖基水解酶水解去除木糖基时底物包括：7-木糖紫杉烷、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖紫杉醇、7-木糖三尖杉宁碱、7-木糖巴卡亭III、
7-木糖紫杉醇C；水解去除木糖基后得到的产物包括：7-羟基紫杉烷，其中制备的7-羟基紫杉烷，包括但不限于10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰三尖杉宁碱、10-去乙酰巴卡亭III、
10-去乙酰紫杉醇C、紫杉醇、三尖杉宁碱、巴卡亭III、紫杉醇C。

[0027] 本发明的7-木糖紫杉烷糖基水解酶在应用方面的技术方案优选为：7-木糖紫杉烷糖基水解酶在以7-糖基紫杉烷为原料制备7-羟基紫杉烷时的应用。

[0028] 其中，所述的7-糖基紫杉烷原料选自带有木糖基的紫杉烷类的混合物，进一步优选的，紫杉烷类的混合物选自紫杉属植物组织、植物细胞培养物或微生物细胞培养物。

[0029] 下面对本发明的技术方案做进一步的说明：

[0030] 本发明提供的一种能明确其氨基酸序列的水解酶—7-木糖紫杉烷糖基水解酶，系由一种口蘑科(Tricholomareceae)真菌香菇(Lentinula edodes M95.33)、或由含有该酶编码基因的重组细胞产生，可位于细胞内或分泌到细胞外，用于转化C-7-木糖紫杉烷为紫杉烷或其类似物。

[0031] 本发明的水解酶—7-木糖紫杉烷糖基水解酶的氨基酸序列具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列至少8个氨基酸残基，或具有SEQ ID No:2至少30％的氨基酸序列，或者是SEQ ID NO：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

[0032] 本发明还提供了编码该氨基酸序列的核苷酸序列，与提供的SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的一部分具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列的至少24个核苷酸，优选具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列的至少45个核苷酸，更优选具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列的至少720个核苷酸，进一步优选具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列的至少963个核苷酸，更优选具有编码SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列的至少1443个核苷酸。

[0033] 本发明提供的该糖基水解酶核苷酸序列，包括完整的开放阅读框架(ORF)可以用来构建各种类型的重组表达质粒，后者被转移到原来的真菌或其他真菌宿主细胞，或被转移到原核细胞(包括大肠杆菌、放线菌)、植物细胞和动物细胞等宿主细胞，由于该糖基水解酶基因的表达可以使这些宿主获得水解7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的能力。还可以用于有糖基的其他化合物的生物转化。

[0034] 本发明还提供了该7-木糖紫杉烷糖基水解酶的应用。

[0035] 本发明还提供了一种紫杉烷及其类似物的生物转化制备方法：以C-7-木糖紫杉烷为原料，用上述口蘑科的真菌或重组菌(如重组毕赤酵母)水解除去原料上的木糖基，得到紫杉烷或其类似物。

[0036] 本发明所述的溶解底物的溶剂，除非有明确说明，一般是指：水、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)等。

[0037] 本发明提供的方法中制备的紫杉烷或其类似物(产物)，以及所用的C-7-木糖紫杉烷原料(底物)，其结构特征如通式I所示。

[0038]

[0039] 其中Ph为苯基，Bz为苯甲酰基，Ac为乙酰基

[0040]

[0041] 本发明首次克隆并异源表达了能专一性地催化7-木糖紫杉烷为7-羟基紫杉烷的糖基水解酶的基因，制备出具有该酶活性的生物工程菌，为大规模制备7-羟基紫杉烷提供了新的、有效的途径。

附图说明

[0042] 图1为糖基水解酶分离纯化梯度洗脱的图谱和酶活样品对底物XDT转化的TLC图，其中A图为层析得到的酶活峰；B图为P1、P2酶活样品对底物XDT转化的TLC图。B图中1为XDT对照品，2为DT对照品，3为P1转化XDT，4为P2转化XDT。

[0043] 图2为P1经SDS-PAGE电泳的电泳图；1为蛋白质分子量marker,2为P1还原处理，3为P1非还原处理。

[0044] 图3为对抗性菌落PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为导入空载体pPIC9K的重组酵母基因组对照扩增结果；2为导入pPIC9K-P1-2的重组酵母基因组扩增结果；3为pPIC9K-P1-2重组质粒对照扩增结果。

[0045] 图4为重组菌酶活力对比曲线，其中P1表示导入pPIC9K-P1-2的重组酵母；空载体表示导入空载体pPIC9K的重组酵母。

[0046] 图5为重组酵母水解XDT为DT的HPLC分析，其中A为底物，B为导入P1基因的重组菌对XDT的转化。

[0047] 图6为重组酵母水解7-木糖紫杉烷混合物的HPLC分析，其中A为混合底物(对照)；B为导入空载体的重组酵母+混合底物(对照)；C为导入P1基因的重组酵母+混合底物。1为7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱；2为7-木糖-10-去乙酰紫杉醇；3为7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C；1′、2′和3′分别为对应的7-羟基紫杉烷产物。

[0048] 本发明通过下列实施例予以进一步阐明，这些实施例是仅用于说明性的，而不是以任何方式限制本发明权利要求的范围。

具体实施方式

[0049] 实施例1；糖基水解酶的纯化

[0050] 真菌M95.33的培养：从培养好的菌种斜面(麦麸培养基，含1.5％琼脂)挑取约2
1cm 见方的菌苔，接种到100ml无菌的麦麸液体培养基中(麦麸培养基成分：麦麸5％，葡萄糖2％，蔗糖2％，蛋白胨0.2％，KH2PO40.15％，MgSO40.075％)，25℃、160rpm摇瓶培养6-8d。

[0051] 糖基水解酶的分离纯化：过滤收集菌丝，加入液氮研磨后，按照3～5倍体积加入pH 8.0的Tris磷酸蛋白裂解液裂解，离心后收集上清为粗酶液。以对硝基苯基-β-D-木糖苷(PNP-Xyl)作为特异性生色底物对有β-木糖苷酶活性的蛋白进行跟踪。一个酶单位定义为在50℃，pH 5.0，以PNP-Xyl为底物，1min内催化产生1nmol对硝基酚所需要的酶量。依次经过DEAE Sepharose FF离子交换柱，收集0.1～0.25mol/L NaCl阶段洗脱组分；Phenyl Sepharose疏水柱，1.0～0mol/L(NH4)2SO4线性梯度洗脱，收集有活性的酶活组分；
DEAE Sepharose FF离子交换柱，0.1～0.25mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集酶活最高的组分；浓缩后上Sephacryl S200 HR分子筛层析，收集酶活最高的组分，得到最终纯化的酶。

[0052] 用疏水柱线性梯度洗脱时得到两个独立的具有β-木糖苷酶活性的峰，分别命名为P1和P2。P1和P2均能水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)为10-去乙酰紫杉醇(DT)(如图1所示)。后经LC-MS/MS等分析确定P2与P1具有相同的氨基酸残基序列，但为不同的糖基化类型。其中，在图1中，A.为层析得到的酶活峰；B.为P1、P2酶活样品对底物XDT转化的TLC，B中的1为XDT对照品，2为DT对照品，3为P1转化XDT，4为P2转化XDT。

[0053] 以下为反应方程式：

[0054]

[0055] 重点对P1进行纯化，纯化结果如表1所示。

[0056] 表1：

[0057]

[0058] 实施例2：P1蛋白水解不同糖苷类底物的特异性实验：

[0059] 选 取 4 种 生 色 底 物：对 硝 基 苯 基 -β-D- 木 糖 苷 (p-Nitrophenyl beta-D-xylopyranoside，PNP-Xyl)、对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside,PNP-Glc)、对硝基苯基-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,PNP-Gal)和对硝基苯基-α-L-阿拉伯糖苷(p-Nitrophenyl a-L-arabinopyranoside,PNP-Ara)，均用50mM的醋酸缓冲液配制成5mM、pH 5.0的溶液。

[0060] 取实施例1得到的25μl纯化的P1蛋白稀释液，加100μl生色底物，50℃，20min，用2ml饱和硼酸钠溶液终止反应，在405nm处检测吸光值。结果显示：P1蛋白能水解PNP-Glc和PNP-Xyl，不能水解PNP-Gal和PNP-Ara，见表2。

[0061] 表2

[0062]

[0063] 实施例3：糖基水解酶P1的基因克隆

[0064] 将实施例1得到的P1经SDS-PAGE电泳(见附图2)后，回收110KDa处的电泳条带并做LC-MS/MS分析，挑选5个峰值最高的肽段进行de novo测序，获得5个肽段的氨基酸残基序列，分别为LPWTWGK、QSGSLPLQHPQR、HWLAYEQETSR、DLPVGDSAVVTYPPR、TLTPLEALQK(其中I和L无法区分，K和Q无法区分)，根据这5个肽段设计一系列简并引物，并应用不同的引物组合进行PCR扩增。筛选至少含有上述任意2个肽段编码区的PCR产物，再利用RACE技术向两端扩增得到包含上述5个肽段编码区的cDNA片段，该片段含有2412bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。根据此cDNA序列设计特异性引物，以真菌M95.33基因组DNA为模板，进行PCR扩增和染色体步移(Genome Walking)，获得P1的结构基因序列，其中，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有3608bp，其核苷酸序列SEQ ID NO:1和该序列编码的蛋白质序列SEQ ID NO:2如附录所示。SEQ ID NO:1信息

[0065] (ⅰ)序列特征：

[0066] (A)长度：3608个碱基对

[0067] (B)类型：核酸

[0068] (C)类型：双链

[0069] (D)拓扑结构：线性

[0070] (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)

[0071] (ⅲ)假设：无

[0072] (ⅳ)反义：无

[0073] (ⅵ)最初来源：

[0074] (A)生物体：口蘑科(Tricholomareceae)真菌香菇Lentinus edodes[0075] (E)菌株：M95.33

[0076] (ⅸ)特征

[0077] (A)名称/关键词：外显子

[0078] (B)位置：1...153

[0079] (ⅸ)特征

[0080] (A)名称/关键词：内含子

[0081] (B)位置：154...217

[0082] (ⅸ)特征

[0083] (A)名称/关键词：外显子

[0084] (B)位置：218...306

[0085] (ⅸ)特征

[0086] (A)名称/关键词：内含子

[0087] (B)位置：307...359

[0088] (ⅸ)特征

[0089] (A)名称/关键词：外显子

[0090] (B)位置：360...587

[0091] (ⅸ)特征

[0092] (A)名称/关键词：内含子

[0093] (B)位置：588...644

[0094] (ⅸ)特征

[0095] (A)名称/关键词：外显子

[0096] (B)位置：645...666

[0097] (ⅸ)特征

[0098] (A)名称/关键词：内含子

[0099] (B)位置：667...718

[0100] (ⅸ)特征

[0101] (A)名称/关键词：外显子

[0102] (B)位置：719...738

[0103] (ⅸ)特征

[0104] (A)名称/关键词：内含子

[0105] (B)位置：739...794

[0106] (ⅸ)特征

[0107] (A)名称/关键词：外显子

[0108] (B)位置：795...905

[0109] (ⅸ)特征

[0110] (A)名称/关键词：内含子

[0111] (B)位置：906...961

[0112] (ⅸ)特征

[0113] (A)名称/关键词：外显子

[0114] (B)位置：962...1016

[0115] (ⅸ)特征

[0116] (A)名称/关键词：内含子

[0117] (B)位置：1017...1077

[0118] (ⅸ)特征

[0119] (A)名称/关键词：外显子

[0120] (B)位置：1078...1102

[0121] (ⅸ)特征

[0122] (A)名称/关键词：内含子

[0123] (B)位置：1103...1162

[0124] (ⅸ)特征

[0125] (A)名称/关键词：外显子

[0126] (B)位置：1163...1255

[0127] (ⅸ)特征

[0128] (A)名称/关键词：内含子

[0129] (B)位置：1256...1323

[0130] (ⅸ)特征

[0131] (A)名称/关键词：外显子

[0132] (B)位置：1324...1477

[0133] (ⅸ)特征

[0134] (A)名称/关键词：内含子

[0135] (B)位置：1478...1542

[0136] (ⅸ)特征

[0137] (A)名称/关键词：外显子

[0138] (B)位置：1543...1719

[0139] (ⅸ)特征

[0140] (A)名称/关键词：内含子

[0141] (B)位置：1720...1792

[0142] (ⅸ)特征

[0143] (A)名称/关键词：外显子

[0144] (B)位置：1793...1955

[0145] (ⅸ)特征

[0146] (A)名称/关键词：内含子

[0147] (B)位置：1956...2018

[0148] (ⅸ)特征

[0149] (A)名称/关键词：外显子

[0150] (B)位置：2019...2095

[0151] (ⅸ)特征

[0152] (A)名称/关键词：内含子

[0153] (B)位置：2096...2188

[0154] (ⅸ)特征

[0155] (A)名称/关键词：外显子

[0156] (B)位置：2189...2293

[0157] (ⅸ)特征

[0158] (A)名称/关键词：内含子

[0159] (B)位置：2294...2367

[0160] (ⅸ)特征

[0161] (A)名称/关键词：外显子

[0162] (B)位置：2368...2754

[0163] (ⅸ)特征

[0164] (A)名称/关键词：内含子

[0165] (B)位置：2755...2807

[0166] (ⅸ)特征

[0167] (A)名称/关键词：外显子

[0168] (B)位置：2808...2916

[0169] (ⅸ)特征

[0170] (A)名称/关键词：内含子

[0171] (B)位置：2917...3002

[0172] (ⅸ)特征

[0173] (A)名称/关键词：外显子

[0174] (B)位置：3003...3214

[0175] (ⅸ)特征

[0176] (A)名称/关键词：内含子

[0177] (B)位置：3215...3309

[0178] (ⅸ)特征

[0179] (A)名称/关键词：外显子

[0180] (B)位置：3310...3519

[0181] (ⅸ)特征

[0182] (A)名称/关键词：内含子

[0183] (B)位置：3520...3586

[0184] (ⅸ)特征

[0185] (A)名称/关键词：外显子

[0186] (B)位置：3587...3608

[0187] (ⅸ)特征

[0188] (A)名称/关键词：CDS

[0189] (B)位置：连接(1...153,218...306,360...587,645...666,719...738,795...905,962...1016,1078...1102,1163...1255,1324...1477,1543...1719,1793...1955,201
9...2095,2189...2293,2368...2754,2808...2916,3003...3214,3310...3519,3587...3
608)

[0190] (C)鉴定方法：实验

[0191] 实施例4：重组质粒的构建和重组酵母菌的筛选

[0192] 将实施例3得到的P1编码区的ORF通过PCR方法在其5′-、3′-端分别引入SnaB I和Not I酶切位点，双酶切后连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K(分泌型表达载体)上。重组质粒通过Sac I单酶切线性化，电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，同时，以空载体pPIC9K用同样方法电转入毕赤酵母GS115感受态细胞作为对照。将转化后的酵母细胞涂布5
到MD平板(葡萄糖2％，无氨基酵母氮源1.34％，生物素4×10-％，琼脂1.5％)上，28℃培养2-3天后挑取单菌落接种到含有4mg G418/ml的YPD(酵母提取物1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂1.5％)抗性平板，继续培养2-3天后筛选抗性菌落，并对抗性菌落进行菌落PCR鉴定(见附图3)。

[0193] PCR引物分别与pPIC9K载体上克隆位点两侧的AOX1序列相匹配：

[0194] 正向：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′；

[0195] 反向:5′GGCAAATGGCATTCTGACATCC 3′。

[0196] 空载体pPIC9K转化菌株扩增出492bp的片段，而重组质粒pPIC9K-P1-2及其转化菌株均能扩增出2910bp的片段。其中，图3中1为导入空载体pPIC9K的重组酵母基因组对照扩增结果；2为导入pPIC9K-P1-2的重组酵母基因组扩增结果；3为pPIC9K-P1-2重组质粒对照扩增结果。

[0197] 用于培养重组酵母菌的种子和发酵培养基分别为BMGY(酵母提取物1％，蛋白胨2％，磷酸钾缓冲液100mM,pH 6.0，甘油1％)和BMMY(用1％的甲醇代替BMGY中的甘油作为碳源)培养基。将筛选到的抗性菌株接种到20ml种子培养基中，30℃，200rpm培养24h，离心洗涤菌体2次，并将菌体转入20ml发酵培养基，30℃，200rpm培养，每隔24h补加1％的甲醇诱导重组蛋白的表达，定时取样观察重组菌的酶活力。菌体经蒸馏水离心洗涤两遍后用同样体积蒸馏水悬浮，取50μl悬浮液加入100μl 5mM PNP-Xyl，30～55℃反应20min，可见到重组菌具有水解底物PNP-Xyl的能力，而转入空载体的对照菌没有酶活性(见附图
4)，另外，重组菌的发酵液上清部分尚未检测到明显活性，说明重组酶主要位于细胞内。

[0198] 实施例5：重组酵母菌水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)

[0199] 将实施例4得到的重组酵母菌按照实施例4的方法诱导培养5天，离心收集并洗涤菌体，用pH 3.5～7.5的醋酸缓冲液悬浮菌体至65mg(湿重，相当于16mg干重)/ml，作为水解反应液。在20ml菌体反应液中加入0.5ml的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)溶液，至XDT终浓度为0.625mg/ml，30～55℃水浴，往返震荡12h。

[0200] 反应结束后用乙酸乙酯萃取，经TLC分析底物已完全转化，HPLC[条件：色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)，流动相：乙睛(38％-52％)，流速：1ml/min，柱温：28℃，检测波长：230nm]分析萃取物中底物XDT和产物DT含量，转化率为
98.80％。

[0201] 重组酵母菌水解XDT反应结果的HPLC分析如图5所示，其中A为底物，B为转入P1基因的重组菌。

[0202] 实施例6：重组酵母菌水解7-木糖紫杉烷混合物

[0203] 按照实施例4的方法，将P1编码区的ORF连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K(胞内表达载体)上，构建成pPIC3.5K-P1-2重组质粒，将其导入毕赤酵母，筛选出重组菌，并以导入空载体pPIC3.5K的重组菌作为对照。参考实施例5的方法对重组酵母进行培养和生物转化反应。转化底物为7-木糖紫杉烷混合物，主要成分为：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇占62.12％，7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱占12.75％，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C占17.04％，其它成分约占8.09％。

[0204] 在200ml重组菌反应液中加入16ml浓度为100mg/ml的7-木糖紫杉烷混合物，至7-木糖紫杉烷混合物终浓度为8mg/ml(过饱和状态)。以导入空载体的重组酵母作为阴性对照。30～55℃水浴，往返震荡24h。反应结束后按照实施例5的方法用HPLC分析转化体系中底物和产物含量(附图6)，转化率分别为：7-木糖-10-去乙酰紫杉醇92.45％，10-去乙酰三尖杉宁碱93.6％，10-去乙酰紫杉醇C 92.0％。HPLC测得转化后反应液中的产物：
10-去乙酰紫杉醇约为3.27mg/ml，10-去乙酰三尖杉宁碱约为0.74mg/ml，10-去乙酰紫杉醇C约为0.92mg/ml，所得混合产物总产率约为4.93mg/ml；而对照则不具备上述活性。

[0205] 重组酵母水解7-木糖紫杉烷混合物反应结果的HPLC分析如附图6所示，A为混合底物(对照)；B为导入空载体的重组酵母+混合底物(对照)；C为导入P1基因的重组菌+混合底物。1为7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱；2为7-木糖-10-去乙酰紫杉醇；3为7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C；1′、2′和3′分别为对应的7-羟基紫杉烷产物。实施例7：重组酵母菌水解7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III(XDB)

[0206] 利用实施例4获得的重组酵母(含pPIC9K-P1-2重组质粒)按照实施例5的方法进行培养和生物转化反应，在1.5ml菌体反应液中加入XDB至终浓度为8mg/ml，30～55℃水浴，往返震荡12h。结果显示：7-羟基-10-去乙酰巴卡亭III的产率为3.04mg/ml。