一种猪免疫性状相关的CD169基因及制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201110263685.5
文献号 : CN102296074B
文献日 : 2012-12-12
发明人 : 张淑君 , 陈焕春 , 任钰为 , 杨利国 , 赵俊龙 , 方六荣 , 张演寅 , 梁爱心 , 周傲 , 陈星 , 贾启涛
申请人 : 华中农业大学
摘要 :
本发明公开了一种猪免疫性状相关的CD169基因及制备方法和应用，从猪的血液中提取总DNA，根据GenBank公布的猪CD169序列（GeneBank登录号：NC_010459.2）为模板设计引物（正向引物：5'-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3'，反向引物：5'-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3'），PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得了序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，该序列包括一个突变位点C305-A305，此位点可以被HinfI内切酶识别，因此应用CRS-PCR-RFLP方法检测猪CD169基因的多态性。该基因主要的作用是介导PRRSV的粘附和内吞。PRRSV侵入机体后，首先和细胞膜上的受体蛋白（例如CD169）结合，然后在CD169的协助下通过包吞作用进入细胞内。本发明为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
权利要求 :
1.一种与猪免疫力相关的分子标记，其特征在于：分子标记C305-A305，以猪CD169基因为模板，引物SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3扩增得到，其序列为SEQ ID NO.1所示，大小为615bp。
2.权利要求1所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。
说明书 :
一种猪免疫性状相关的CD169基因及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种猪免疫性状相关的CD169基因，同时还涉及一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，还涉及一种猪免疫性状相关的CD169基因的用途。
背景技术
[0002] 自从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)被发现以来，其在全世界大部分地区流行，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。为了深入地了解猪繁殖与呼吸综合症的发病机理并控制该疾病，研究者们需要研究PRRSV受体的生物学特征，具体包括参与病毒吸附、内化、拆卸核衣壳、基因组释放过程中的受体。但是传统的治疗方法有很多局限性，无法有效地解决问题，而且药物及其有害物质残留影响动物食品安全和环境，因此动物遗传育种和分子标记辅助技术越来越受到重视。
[0003] CD169(Sialoadhesin，Sn)，又名唾液酸粘附素，是一种I型跨膜糖蛋白。被鉴定为一种唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素受体，具有17个区域的复杂结构，分子结构包括细胞外区、跨膜区和胞内区，其中胞外区含有免疫球蛋白V区和C区样结构(Crocker PR等.Sialoadhesin，a macrophage sialic acid binding receptor for haemopoietic cells with 17 immunoglobulin-like domains.The EMBO Journal，1994，13(19)：4490-4503.)。
[0004] CD169具有强烈的巨噬细胞趋性，主要在组织巨噬细胞上表达。PRRSV侵入猪肺泡巨噬细胞后，CD169主要起粘附和内吞的作用，此过程需要借助病毒表面的唾液 酸 (Delputte PL等 .Porcine arterivirus infection of alveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus.Journal of Virology，2004，78(15)：8094-8101.)。Van Breedam等通过实验证明了病毒囊膜上的唾液酸与猪肺泡巨噬细胞(PAM)上的pSn发生反应后，继而激发病毒的内吞。并且构建可溶的pSn与PRRSV的溶解产物发生免疫沉淀反应，结果表明是病毒的M/GP5二聚体与pSn相互作用。
[0005] 虽然PRRSV有严格的细胞嗜性，但是在哺乳动物的非允许细胞表面表达重组的猪唾液酸粘附素后，PRRSV可以有效地吸附这些重组细胞。例如将包含Sn的质粒转染到非允许细胞PK-15，使Sn表达后接种PRRSV，虽然在重组细胞中没有发现病毒核衣壳拆卸及核病毒粒子的复制，但是在阳性细胞浆内发现了大量的病毒，表明pSn是介导PRRSV吸附和内吞的受体。安同庆等的实验结果表明，pSn的N端17-150氨基酸可能与病毒的吸附有关，而C端胞质尾区可能是介导病毒内吞的因素。近来，有实验表明，病毒能够吸附一个仅由pSn的N端区域直接偶联跨膜区和C短胞质尾区的片段(An TQ等.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment is mediated by the N-terminal domain of the sialoadhesin receptor.Vet Microbiol，2010，143(2/4)：371-378.)。唾液酸凝集活116
性在PRRSV与受体CD169的结合中发挥了重要的作用，利用点突变的方法将N端的R 氨基
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酸转换成E 氨基酸后，虽然整个蛋白质的结构没有明显的改变，但是pSn丧失了唾液酸凝集的能力，导致病毒无法吸附和内吞(Delputte PL等.Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is dependent on the sialic acid-binding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin.
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J Virol，2007，81(17)：9546-9550.)，表明R 是CD169与病毒的M/GP5二聚体结合的重要
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的位点。此外，CD169的唾液酸结合区域的R 不仅可以和唾液酸的碳水化合物形成盐桥，
97
而且可以和唾液酸的甘油侧链形成疏水性的接触，当R 被替换为赖氨酸之后，影响CD169和唾液酸之间的疏水性作用，阻碍盐桥的形成，导致与唾液酰乳糖的结合能力显著降低。类
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似地，将R 转换成丙氨酸也会导致CD169丧失结合唾液酸的能力。
性在PRRSV与受体CD169的结合中发挥了重要的作用，利用点突变的方法将N端的R 氨基
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酸转换成E 氨基酸后，虽然整个蛋白质的结构没有明显的改变，但是pSn丧失了唾液酸凝集的能力，导致病毒无法吸附和内吞(Delputte PL等.Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is dependent on the sialic acid-binding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin.
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J Virol，2007，81(17)：9546-9550.)，表明R 是CD169与病毒的M/GP5二聚体结合的重要
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的位点。此外，CD169的唾液酸结合区域的R 不仅可以和唾液酸的碳水化合物形成盐桥，
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而且可以和唾液酸的甘油侧链形成疏水性的接触，当R 被替换为赖氨酸之后，影响CD169和唾液酸之间的疏水性作用，阻碍盐桥的形成，导致与唾液酰乳糖的结合能力显著降低。类
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似地，将R 转换成丙氨酸也会导致CD169丧失结合唾液酸的能力。
[0006] 同时使用肝素酶和pSn的特异性抗体MAb 41D3处理PAM后，完全阻断了PRRSV对PAM的吸附作用，说明硫酸乙酰肝素和pSn都介导了病毒对受体的吸附作用，并且PAM表面可能不存在参与吸附PRRSV过程的其他的受体，或存在但是数量很少以至于无法检测。
[0007] 鉴于CD169基因在PRRSV感染PAM过程中的重要作用，因此以受体基因CD169为靶基因，调控其功能，从而达到有效控制猪繁殖与呼吸综合症的目的，并且借助分子标记辅助选择，筛选CD169基因潜在的与免疫功能相关分子标记，为抗病育种提供参考。
发明内容
[0008] 本发明的第一个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因，该基因主要的作用是介导PRRSV的粘附和内吞。PRRSV侵入机体后，首先和细胞膜上的受体蛋白(例如CD169)结合，然后在CD169的协助下通过包吞作用进入细胞内。
[0009] 本发明的第二个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，该方法通过设计特异性的引物，扩增包括一个突变位点的CD169基因的部分片段，并且根据HinfI-RFLP方法得到的不同酶切片段确定不同的基因型。
[0010] 本发明的第三个目的是在于提供了一种猪免疫性状相关的CD169基因在猪分子标记辅助选择中的应用。
[0011] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
[0012] 一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，其步骤是：
[0013] 1.引物设计：
[0014] 利用引物设计软件Primer 5.0(Premier公司，加拿大)，以猪CD169基因(GeneBank登录号：NC_010459.2)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物对的DNA序列如下：
[0015] 正向引物：5′-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3′(SEQ ID NO：2)；
[0016] 反向引物：5′-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3′(SEQ IDNO：3)。
[0017] 2.PCR产物的纯化和测序：
[0018] PCR扩增反应体系20ul，包括500ng的DNA，2.0ul 10×PCR buffer，0.6ul 10mM dNTP，0.8ul of each primer(10uM)and 1 U Ampli Taq DNA polymerase(上海生工生物工程技术公司)。PCR反应条件为：PCR的反应程序为：95℃5min；94℃40s，58℃30s，72℃30s，34个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图
2)。
2)。
[0019] 回收5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的PCR产物，每个品种选3个样本，混合测序。测序产物与猪CD169基因(GeneBank登录号：NC_010459.2)比对，成功获得猪CD169基因部分序列615bp的片段(见序列表SEQ ID NO：1)。测序图出现明显双峰，突变位点是C305-A305(见序列表SEQ ID NO：1)。
[0020] 3.CRS-PCR-RFLP方法检测分子标记C305-A305：
[0021] 用引物序列(见序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3)扩增CD169基因，得到615bp的片段(见序列表SEQ ID NO：1)，用限制性内切酶HinfI鉴别CC、CA、AA三种基因型。
[0022] 在NCBI网站上查到与CD169的615bp片段(见序列表SEQ ID NO：1)对应的氨基酸序列，用在线软件分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，该序列属于CD169蛋白的Igc2区域，包含成纤维细胞生长因子受体，血管内皮细胞生长因子受体，白介素6受体和神经细胞黏附分子，而这些细胞因子结合位点在免疫调节作用中有重要作用，表明该区域与免疫功能密切相关。
[0023] 一种猪免疫性状相关的CD169基因在猪分子标记辅助选择中的应用，以猪的DNA为模板，利用引物(见序列表SEQ IDNO：2和SEQ IDNO：3)扩增CD169的部分片段，得到615bp的PCR产物(SEQID NO：1)，用PCR-HinfI-RFLP方法检测C305-A305的多态性，鉴别出CC、CA、AA三种基因型，通过统计分析三种基因型的基因型频率与发病相对危险度的关联，筛选出AA基因型可能是与免疫相关的分子标记，为猪分子标记辅助选择提供参考。
[0024] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0025] 1.分子标记是以DNA多态性为基础，表现稳定，多态性直接以DNA形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；
[0026] 2.等位变异存在于自然界中，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为样本采集创造了条件；
[0027] 3.标记辅助选择可以缩短世代间隔，减少培育优良品种所需时间；
[0028] 4.操作简单，所需仪器设备较少，成本低，一般实验室均可进行；
[0029] 5.测序图直观，可以准确地筛选突变位点；
[0030] 6.琼脂糖凝胶电泳即可鉴别基因型，简单快捷，图片直观、准确。
附图说明
[0031] 图1为一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法流程图。
[0032] 图2为一种猪CD169基因部分序列扩增的电泳图谱。
[0033] 片段大小为615bp(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中：Marker泳道为DNA分子量标准。
[0034] 图3为一种猪CD169基因测序后发现的C305-A305突变位点。
[0035] 图4为一种是本发明中猪CD169基因PCR-HinfI-RFLP的三种基因型(CC，CA和AA)电泳图谱。
具体实施方式
[0036] 实施例1：
[0037] 一种猪免疫性状相关的CD169基因的制备方法，其步骤是：
[0038] 根据猪CD169基因(GeneBank登录号：NC_010459.2)序列设计引物，从猪的血液中提取DNA作为模板，扩增PCR，回收，纯化，测序。查找突变位点，用CRS-PCR-RFLP的方法鉴别基因型，并分析3种基因型的发病相对危险度，筛选与免疫相关的分子标记(图1)。
[0039] 1.引物设计
[0040] 利用引物设计软件Primer 5.0(Premier公司，加拿大)，以猪CD169基因(GeneBank登录号：NC_010459.2)为模板设计出包含部分序列的扩增引物，用来扩增“杜长大”(由国外品种“杜洛克”，“长白”和“大白”三个品种杂交得到，是一种中国普遍推广应用的商用猪)CD169基因的部分序列。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物对的DNA序列如下：
[0041] 正向引物：5′-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3′，
[0042] 反向引物：5′-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3′。
[0043] 2.PCR产物的纯化和测序：
[0044] (1)PCR扩增：
[0045] 从猪品种血液中提取总DNA，以此DNA作为模板。PCR扩增反应体系20ul，包括500ng的DNA，2.0ul10×PCR buffer，0.6ul 10mM dNTP，0.8ul of each primer(10uM)and
1 U Ampli Taq DNA polymerase(上海生工生物工程技术公司)。PCR反应条件为：PCR的反应程序为：95℃5min；94℃40s，58℃30s，72℃30s，34个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图2)。
1 U Ampli Taq DNA polymerase(上海生工生物工程技术公司)。PCR反应条件为：PCR的反应程序为：95℃5min；94℃40s，58℃30s，72℃30s，34个循环；72℃延伸10min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测(见图2)。
[0046] (2)PCR产物的纯化及测序：
[0047] 以5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的DNA为模板，每个品种内随机挑选3个个体用于PCR扩增，回收猪5个品种PCR扩增产物，混合测序。利用北京天根生物技术公司生产的小量DNA片段纯化试剂盒进行纯化回收，具体方法参考该试剂盒的操作说明书。序列测定由上海生工生物工程技术公司完成。
[0048] (3)DNA序列同源性检索鉴定：
[0049] 通过NCBI-BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的参考序列(登录号：NC_010459.2)进行比对，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，结果显示成功克隆得到猪CD169基因部分序列615bp的片段(见序列表SEQ ID NO：1)。
[0050] (4)DNA序列中突变位点的筛选：
[0051] 通过NCBI-BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)工具，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的序列(登录号：NC_010459.2)进行比对，将5个猪品种(长白，大白，清平，金华，小梅山)的混合测序峰图导入SeqMan软件(DNASTAR公司，美国)进行比对分析，结果显示在猪CD169基因部分序列1个位点出现明显的双峰，这说明该基因在这个位点处发生了碱基突变(见图3)。这个突变位点是：C305-A305(见序列表SEQ ID NO：1)。
[0052] CRS-PCR-RFLP基因型检测方法的建立：
[0053] 1.引物设计：
[0054] 针对多态位点C305-A305点设计了一对引物，用于基因型检测，其核苷酸序列序列分别如下所示(与序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列相同)：
[0055] 正向引物：5’-GGGCATTCAAAGCCAAACTC-3’(见序列表SEQ ID NO：2)[0056] 反向引物：5’-CCTCGGGTGTAGCCCTCAAA-3’(见序列表SEQ ID NO：3)[0057] 2.PCR扩增：
[0058] 20uL的反应体系中加入DNA模板1μL，双蒸水14.3μL，10×PCR buffer 2.0μL，10mMdNTP 0.6μL，10uM引物各0.8μL，Taq酶1U。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，
94℃变性40s、58℃退火30s、72℃延伸30s，34个循环，最后72℃延伸10min。3μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(见图3)，阳性样品用于下一步酶切检测。
94℃变性40s、58℃退火30s、72℃延伸30s，34个循环，最后72℃延伸10min。3μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(见图3)，阳性样品用于下一步酶切检测。
[0059] 3.RFLP检测：
[0060] HinfI-RFLP检测分子标记C305-A305
[0061] 将PCR产物6μL，10×Buffer 1μL，限制性内切酶HinfI为4U，加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，酶切产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测分型。
[0062] 分子标记基因型分析：如图4所示，分别代表C305-A305处单核苷酸多态性(SNP)3种不同的基因型(基因型用其突变碱基表示CC、AA、CA)，电泳结果显示CC基因型(有4条带，长度为471bp、92bp、36bp、17bp)、CA基因型(有6条带，长度为471bp、268bp、202bp、92bp、36bp和17bp)和AA基因型(有5条带，长度为268bp/202bp/92bp/36bp/17bp)，其中
36bp和17bp由于片段太小，无法用琼脂糖胶显示出来。
36bp和17bp由于片段太小，无法用琼脂糖胶显示出来。
[0063] 实施例2：
[0064] CD169分子标记分型方法在免疫性状关联分析中的应用：
[0065] 试验共检测了256头“杜长大”猪个体的多态性，包括发病猪215头，健康猪41头。用CRS-PCR-RFLP方法确定其基因型，并进行基因突变位点与猪繁殖与呼吸综合征的关联分析。应用SAS软件(赛仕软件(北京)有限公司，北京)的Logistic回归模型分析方法，设定一个基因型的OR值(OR值的全称是odd ratio，又称比值比，对于发病率很低的疾病来说，它的OR值即是相对危险度的精确估计值)为参考值(OR＝1)，计算另外2种基因型的OR值，如果OR值大于1，且P值小于0.05，则此基因型可能是一个危险因子，即猪群中携带此基因型的个体容易感染猪繁殖与呼吸综合征；反之，如果OR值小于1，且P值小于0.05，则此基因型可能是保护因子，即猪群中携带此基因型的个体对猪繁殖与呼吸综合征有抵抗力。95％CI表示OR值的95％置信区间(Andrew M.Smith MD等，Environmental Tobacco Smoke and Interleukin 4 Polymorphism(C-589T)Gene：Environment Interaction Increases Risk of Wheezing in African-American Infants.The Journal of Pediatrics，2008，152(5)：709-715；Yen-Li Lo等，ATM polymorphisms and risk of lung cancer among never smokers.LungCancer，2010，69：148-154.)。
[0066] (一)基因型检测结果表明在256个个体中，CC基因型有85个个体，CA基因型有127个个体，AA基因型有44个个体。等位基因C与等位基因A在各个群体中的分布情况见表1，通过观察可以看出在“杜长大”中，C等位基因为优势等位基因。
[0067] 表1CD169基因的SNP在群体中基因型频率和基因频率分布
[0068]
[0069] (二)与CD169基因C305-A305(HinfI-RFLP)变异位点基因型频率和基因频率及其与发病相对危险度关联
[0070] 应用CRS-PCR-HinfI-RFLP检测分子标记C305-A305基因型并采用Logistic回归分析方法分析基因CD169三种基因型在疾病发生后健康猪、发病猪两个猪群中的发病相对危险度。AA基因型的发病相对危险度可能是CC基因型的3.167倍(OR＝3.167，P＝0.0183)，差异显著。具体结果见表2。结果表明，AA基因型可能是与免疫相关的一个分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个参考。
[0071] 表2猪CD169基因HinfI变异位点基因型频率和基因频率及其与发病相对危险度关联分析
[0072]
[0073] 注：P＜0.05表示差异显著。