柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种柑桔衰退病毒的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)检测方法。应用环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，根据GenBank公布的柑桔衰退病毒(CTV)不同株系的基因序列，针对病毒序列保守区域设计了CTV的RT-LAMP检测方法的特异性引物4条，其序列为，F3：CGAAGTGGATTTGTCTGACA；B3：GGAATCCCTGCATCTAGCG；FIP：ACTCGAAGGGCGTTAGTACGGCTTTGGACTGACGTCGTGTT；BIP：CTGGGGTAGGACTAACGATGCCGACGTCCGCCATAACTCAA。4条引物分别完全与识别的靶序列中6个区序列匹配。实验结果表明：灵敏度比普通逆转录-聚合酶链锁反应(RT-PCR)高100倍，对病毒早期诊断准确性更高。本发明与RT-PCR方法检测结果一致，比DTBIA方法灵敏、准确。本发明方法可快速、准确、灵敏地检测柑桔衰退病毒，适合样品快速检测、CTV流行监控、脱毒苗木鉴定和衰退病毒的鉴别。

权利要求

1.一种柑桔衰退病毒(CTV)的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于：根据CTV的保守序列设计RT-LAMP检测的特异性引物2对：一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，4条引物序列如下所示；利用特异性引物，在63～65℃条件下恒温反应45～60分钟，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样品中是否含有柑桔衰退病毒；

建立试剂盒，包含有LAMP反应液和LAMP特异引物的混合液构成的检测体系；CTV保守序列以及根据该序列设计的引物F3、B3、FIP、BIP如下所示：F3 5＇-CGAAGTGGATTTGTCTGACA-3＇B3 5＇-GGAATCCCTGCATCTAGCG-3＇FIP 5＇-ACTCGAAGGGCGTTAGTACGGCTTTGGACTGACGTCGTGTT-3＇BIP 5＇-CTGGGGTAGGACTAACGATGCCGACGTCCGCCATAACTCAA-3＇其中，所述检测试剂盒包括以下溶液：

溶液1：5×反应液的成分：Tris-HCl pH 8.8 100mM，KCl 50mM，MgSO4 40mM，(NH4)2SO4

50mM，Tween20 0.5%，甜菜碱4M，dNTPs 7mM each，AMV反转录酶10U/μL，BstDNA聚合酶

40U/μL；

溶液2：5×引物混合液的成分：F3 1μM，B3 1μM，FIP 4μM，BIP 4μM；

溶液3：超纯水。

2.根据权利要求1所述柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法，包括如下步骤：

1）提取待测样品总RNA核酸作为反应模板；

2）配制RT-LAMP反应溶液：总反应体积25μL，分别加入：5μL溶液1-5×反应缓冲液；

5μL溶液2-5×引物混合液，14μL溶液3-超纯水；

3）取步骤1）提取的样品总RNA 1μL加入到步骤2）配制的RT-LAMP反应液中，混合；

4）在63℃恒温水浴中反应45-60分钟；

5）结果诊断：将步骤4）扩增反应后产物进行判断，呈阳性的表示样本含有柑桔衰退病毒，呈阴性的表示样品不含有柑桔衰退病毒。

说明书

柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于农业科学生物技术应用领域，涉及一种检测柑桔衰退病毒RT-LAMP检测技术和依据该技术建立的试剂盒。

背景技术

[0002] 柑桔衰退病毒（CTV）引起的柑桔衰退病是柑桔主要病害之一，严重危害着柑桔产业。CTV检测是病毒防治、流行趋势研究、柑桔无病毒苗木鉴定、弱毒株系筛选等的重要前提和环节。现有技术中，依据病症误判率较高、血清学技术灵敏度低、反转录聚合酶链锁扩增（RT-PCR）检测技术操作复杂用时长，费用高，且需要昂贵的PCR仪器等缺点。

[0003] LAMP技术的全称是环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification）。由日本学者Notomi等发明的一种新型的基因扩增技术。但是，目前尚没有将RT-LAMP技术应用在柑桔衰退病毒（CTV）的检测上。

发明内容

[0004] 针对现有技术中，柑桔衰退病毒常用检测技术中酶联免疫检测技术灵敏度低、逆转录和巢式PCR技术操作复杂、用时长等问题，本发明的目的是提供一种操作简单、成本低，用时少、特异性强、灵敏度高的柑桔衰退病毒的RT-LAMP检测方法。

[0005] 实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法，其特征在于：根据CTV的保守序列设计RT-LAMP检测的特异性引物2对：一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，4条引物序列如下所示；利用特异性引物，在63～65℃条件下恒温反应45～60分钟，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样品中是否含有柑桔衰退病毒。

[0006] 利用该方法建立的试剂盒，包含有LAMP反应液和LAMP特异引物的混合液构成的检测体系。该试剂盒可快速、灵敏、特异地检测出柑桔衰退病毒。

[0007] CTV保守序列以及根据该序列设计的引物F3、B3、FIP、BIP如下所示：

[0008]

[0009] F3：cgaagtggatttgtctgaca

[0010] B3：ggaatccctgcatctagcg

[0011] FIP：actcgaagggcgttagtacggctttggactgacgtcgtgtt

[0012] BIP：ctggggtaggactaacgatgccgacgtccgccataactcaa

[0013] 其中，所述检测试剂盒包括以下溶液：

[0014] 溶液1：（5×反应液）成分：Tris-HCL(PH8.8)100mM，KCL 50mM，MgSO4 40mM，(NH4)2SO450mM，Tween20 0.5%，Betain 4M，dNTPs 7mM each，AMV反转录酶10U/μl，BstDNA置换酶40U/μl；

[0015] 溶液2：（5×引物混合液）成分：F3 1uM，B3 1uM，FIP 4uM，BIP 4uM；

[0016] 溶液3：超纯水。

[0017] 进一步，所述检测柑桔衰退病毒的RT-LAMP快速检测方法，包括如下步骤：

[0018] 1）提取待测样品总RNA核酸作为反应模板；

[0019] 2）配制RT-LAMP反应溶液：按总反应体积25μl为例，扩增体系分别加入：5μl溶液1（5×反应缓冲液），5μl溶液2（引物混合液），14μl溶液3(超纯水)；

[0020] 3）取步骤1）提取的样品总RNA 1μl加入到步骤2）配制的RT-LAMP反应液中，混合；

[0021] 4）在63℃恒温水浴中反应45～60分钟；

[0022] 5）结果诊断：将步骤4）扩增反应后产物进行判断，呈阳性的表示样本含有柑桔衰退病毒，呈阴性的表示样品不含有柑桔衰退病毒。

[0023] 相比现有技术，本发明具有如下优点：

[0024] 本发明根据GenBank公布的柑桔衰退病毒（CTV）不同株系的基因序列，针对柑桔衰退病毒序列保守区域设计了CTV的RT-LAMP检测方法的特异性引物2对，一对外引物F3、B3和一对内引物FIP、BIP，2对引物序列如上图表所示。以提取样本总RNA为模板，建立了快速检测柑桔衰退病毒的RT-LAMP技术。

[0025] 本发明RT-LAMP检测技术利用特异引物（4条），以识别柑桔衰退病毒靶基因的几个特定区域，特异性更强。反应在等温（63℃）条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，扩增反应极快，一般35-60分钟完，扩增产物量大，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样品中是否含有柑桔衰退病毒；灵敏度高、特异性强，适合病毒的快速准确检测。

[0026] 本发明RT-LAMP技术不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测的一些环节，降低了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比RT-PCR高100倍，使该方法对柑桔衰退病毒的早期诊断更准确。

[0027] 本方法具有操作简单、成本低，反应快速、特异性强、灵敏度高的优点，且用时短，灵敏度比普通逆转录-聚合酶链锁反应（RT-PCR）高100倍，对病毒早期诊断准确性更高。可广泛用于样品快速检测、CTV流行监控、脱毒苗木鉴定和衰退病毒的鉴别。

[0028] 本发明还根据检测方法相应地建立了检测试剂盒，本发明方法和试剂盒可快速、准确、灵敏地检测柑桔衰退病毒，适合样品快速检测、CTV流行监控、脱毒苗木鉴定和衰退病毒的鉴别。

附图说明

[0029] 图1是特异性验证试验1酶切电泳图；

[0030] 图2是特异性试验电泳图；

[0031] 图3是RT-PCR灵敏度实验电泳图；

[0032] 图4是RT-LAMP灵敏度实验电泳图；

[0033] 图5是26个样DTBIA检测结果电泳图；

[0034] 图6是26个样RT-PCR检测结果电泳图；

[0035] 图7是26个样T-LAMP检测结果电泳图。

[0036] 图1中，1：marker；2：酶切产物；3：RT-LAMP产物。

[0037] 图2中，1：marker（分子标尺）2：负对照；3：正对照；4：柑桔衰退病毒，5：柑桔碎叶病毒，6：柑桔裂皮病,7：柑桔黄龙病，8：柑桔溃疡病。

[0038] 图3中，注：1：marker，2：负对照，3：稀释1倍；4：稀释10-1；5：稀释10-2倍；6：稀-3 -4 -5 -6 -7 -8释10 倍；7：稀释10 倍；8：稀释10 倍；9：稀释10 倍；10：稀释10 倍；11：稀释10倍。

[0039] 图4中，注：1：marker，2：负对照，3：稀释1倍；4：稀释10-1倍；5：稀释10-2倍；6：-3 -4 -5 -6 -7 -8
稀释10 倍；7：稀释10 倍；8：稀释10 倍；9：稀释10 倍；10：稀释10 倍；11：稀释10倍。

[0040] 图5中，+CK：阳性对照，-CK：阴性对照，1-26：待测样品。

[0041] 图6中，1：marker（分子标尺）；2：水；3：阳性对照；4：阴性对照；5-30：待测样品。

[0042] 图7中：1：marker（分子标尺）；2：水；3阳性对照；4：阴性对照；5-30：待测样品。

具体实施方式

[0043] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

[0044] 本发明提供一种柑桔衰退病毒RT-LAMP的快速检测方法。根据GenBank公布的柑桔衰退病毒（CTV）不同株系的基因序列，针对柑桔衰退病毒序列相对保守区域设计了CTV的RT-LAMP特异性引物4条（如下序列），以柑桔衰退病毒不同株系为模板，建立了可以检测所有柑桔衰退病毒的RT-LAMP方法。然后依据电泳图谱诊断。

[0045] 引物设计：

[0046] CTV的保守序列及设计RT-LAMP的特异引物序列：

[0047]

[0048] F3：cgaagtggatttgtctgaca

[0049] B3：ggaatccctgcatctagcg

[0050] FIP：actcgaagggcgttagtacggctttggactgacgtcgtgtt

[0051] BIP：ctggggtaggactaacgatgccgacgtccgccataactcaa

[0052] 具体的检测方法步骤为：

[0053] 1）提取待测样品总RNA核酸作为反应模板；

[0054] 2）配制RT-LAMP反应溶液：按总反应体积25μl为例，扩增体系分别加入：5μl溶液1（5×反应缓冲液），5μl溶液2（引物混合液），14μl溶液3(超纯水)；

[0055] 3）取步骤1）提取的样品总RNA 1μl加入到步骤2）配制的RT-LAMP反应液中，混合；

[0056] 4）在63℃恒温水浴中反应45-60分钟；

[0057] 5）结果诊断：将步骤4）扩增反应后产物进行判断，呈阳性的表示样本含有柑桔衰退病毒，呈阴性的表示样品不含有柑桔衰退病毒。

[0058] 其中，试剂盒包括：

[0059] 溶液1：（5×反应液）成分：Tris-HCL(PH8.8)100mM，KCL 50mM，MgSO4 40mM，(NH4)2SO450mM，Tween20 0.5%，Betain 4M，dNTPs 7mM each，AMV反转录酶10U/μl，BstDNA置换酶40U/μl。

[0060] 溶液2：（5×引物混合液）成分：F3 1uM，B3 1uM，FIP 4uM，BIP 4uM。

[0061] 溶液3：超纯水。

[0062] 特异性实验：

[0063] 1、酶切实验，根据目的基因的特殊酶切位点，对扩增产物进行酶切实验。Acc Ⅰ内切酶充分切开扩增产物，凝胶电泳显示2条带，说明扩增产物为目的基因（如附图2）。

[0064] 2、检测实验，用同一套引物对柑桔常见病害核酸提取物进行RT-LAMP扩增，在柑桔衰退病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔裂皮病、柑桔黄龙病和柑桔溃疡病几种病害进行检测，检测结果只有柑桔衰退病呈现阳性。说明该方法对柑桔衰退病毒检测特异（如附图3）。

[0065] 灵敏度实验：

[0066] 对同一模板依次稀释到10-8倍，分别采用RT-PCR技术和RT-LAMP技术进行扩增检-4 -6测，结果显示RT-PCR检测到稀释10 倍模版的样，而RT-LAMP检测到稀释10 倍模版的样的。RT-LAMP灵敏度是RT-PCR的100倍（如附图4,5）。

[0067] 应用实例检测实验：

[0068] 分别采用组织斑点免疫方法（DTBIA）、RT-PCR方法、RT-LAMP方法对26个待测样品进行检测，样品呈阳性，说明样品携带柑桔衰退病毒。

[0069] DTBIA检测方法中，阳性对照样品显示黑色，阴性对照样品未显色，说明该次检测方法成功有效。26个待测样品中检测出阳性12个，结果如附图6。

[0070] RT-PCR检测方法中，阳性对照样品扩增出672bp大小条带，阴性未扩增出条带，说明该次检测成功有效。26个样品中，检测出阳性样品13个，结果如附图7。

[0071] RT-LAMP检测方法中，阳性对照样品扩增出梯度条带，阴性未扩增出梯度条带，说明该次检测成功有效。26个样品中检测出阳性样品13个，结果如附图8。

[0072] 3种检测方法结果表明，RT-LAMP检测方法检测效果完全与RT-PCR方法检测结果吻合，比DTBIA方法多检测出一个阳性样品。说明RT-LAMP检测方法准确有效，特异性强。

[0073] 以上实验结果说明，RT-LAMP检测方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高、操作方便、反应速度快等优点。同时，该检测技为边远农村地区实验室进行快速，准确的柑桔衰退病毒的分子检测提供了技术平台。此技术可用于样品快速检测、CTV流行监控、脱毒苗木鉴定和衰退病毒的鉴别。及早、方便准确的发现病毒，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。