表达木糖异构酶的微生物

摘要

本发明涉及一种经过转化的微生物，其能够实现(a)比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或(b)比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢；和/或(d)比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

权利要求

1.一种经过转化的微生物，其能够实现：

(a)比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或

(b)比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢；和/或

(d)比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成，其中所述微生物经过包含SEQ ID No1、SEQ ID No10、SEQ ID17、SEQ ID No12、SEQ ID No27或SEQ ID No28所示核苷酸序列的编码木糖异构酶的核苷酸序列转化，或其中所述微生物经过编码包含SEQ ID No14、SEQ ID No11、SEQ ID No18、SEQ ID No13、SEQ ID No19或SEQ ID No20所示氨基酸序列的木糖异构酶的核苷酸序列转化，其中所述微生物经过编码木酮糖激酶的核苷酸序列转化，

且其中所述经过转化的微生物是经过转化的酵母，其中所述酵母是糖酵母属（Saccharomyces）。

2.依照权利要求1的微生物，其中所述木酮糖激酶是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）木酮糖激酶。

3.依照权利要求1的微生物，其中所述木酮糖激酶是树干毕赤氏酵母（Pichia stipitis）木酮糖激酶。

4.包含依照权利要求1至3任一项的微生物的接种物。

5.包含依照权利要求1至3任一项的微生物的培养基。

6.依照权利要求5的培养基，其中所述培养基包含木糖源。

7.依照权利要求5或6的培养基，其中所述培养基包含自木质纤维素材料衍生的材料。

8.一种用于制备经过转化的微生物的方法，所述方法包括转化微生物的步骤，使得所述经过转化的微生物能够实现：

(a)比转化前的微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或

(b)比转化前的微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)比转化前的微生物要更快的木糖代谢；和/或(d)比转化前的微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成，其中所述微生物经过包含SEQ ID No1、SEQ ID No10、SEQ ID17、SEQ ID No12、SEQ ID No27或SEQ ID No28所示核苷酸序列的编码木糖异构酶的核苷酸序列转化，或其中所述微生物经过编码包含SEQ ID No14、SEQ ID No11、SEQ ID No18、SEQ ID No13、SEQ ID No19或SEQ ID No20所示氨基酸序列的木糖异构酶的核苷酸序列转化，其中所述微生物经过编码木酮糖激酶的核苷酸序列转化，

且其中所述经过转化的微生物是经过转化的酵母，其中所述酵母是糖酵母属（Saccharomyces）。

9.依照权利要求8的方法，其中所述木酮糖激酶是酿酒酵母木酮糖激酶或树干毕赤氏酵母木酮糖激酶。

10.依照权利要求8或9的方法，其中所述编码木糖异构酶的核苷酸序列在编码木糖异构酶的表达载体中。

11.一种发酵方法，包括在培养基中培养依照权利要求1至3任一项的微生物或通过权利要求8至10任一项的方法制备的微生物。

12.一种用于生产自木糖衍生的产物的方法，包括在培养基中培养依照权利要求1至3任一项的微生物或通过权利要求8至10任一项的方法制备的微生物。

13.一种用于生产生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养依照权利要求

1至3任一项的微生物或通过权利要求8至10任一项的方法制备的微生物的步骤。

14.依照权利要求13的方法，其中所述方法进一步包括自所述培养基获得所述生物燃料的步骤。

15.依照权利要求1至3任一项的微生物或通过权利要求8至10任一项的方法制备的微生物用于生产自木糖衍生的产物的用途。

16.依照权利要求15的用途，其中所述自木糖衍生的产物选自下组：木酮糖，木酮糖-5-磷酸，乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，

4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2,3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1,4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

17.依照权利要求1至3任一项的微生物或通过权利要求8至10任一项的方法制备的微生物用于生产生物燃料的用途。

说明书

表达木糖异构酶的微生物

发明领域

[0001] 本发明涉及微生物。

[0002] 特别地，本发明涉及经过转化的微生物，其能够实现：比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢；和/或比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0003] 本发明进一步涉及用于制备经过转化的微生物的方法，所述经过转化的微生物能够实现：比转化前的微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或比转化前的微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或比转化前的微生物要更快的木糖代谢；和/或比转化前的微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0004] 另外，本发明涉及包含依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物的接种物和培养基。

[0005] 在另一个方面，本发明涉及发酵方法，包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。

[0006] 本发明另外涉及用于生产生物燃料和/或自木糖衍生的产物的方法，包括在培养基中培养本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。

[0007] 另外，本发明涉及通过本发明的方法获得的生物燃料和/或自木糖衍生的产物。

[0008] 另外，本发明涉及依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生产自木糖衍生的产物和/或生物燃料的用途。

[0009] 发明背景

[0010] 乙醇被认为是一种诱人的替代运输燃料，其可用作资源最终受到限制的化石燃料汽油的添加剂、补充剂或部分替换。

[0011] 乙醇可以以更小的浓度代替甲基叔丁基醚(MTBE)作为更清洁的辛烷增效剂或氧化添加剂用于汽油，或者它可用于以更高的量(10至85％)混入汽油，其中所述混合物可用于仅仅略微更改的汽车发动机，正如我们今天知道的。因此，它相对于其它替代运输燃料具有巨大的优点。能以最大灵活性进行任何分数的替代，而且这对运输发动机技术没有剧烈改变，正如我们今天知道的。

[0012] 乙醇具有作为可再生资源的优点，因为它能以很大的量自植物材料生产。这后面还有二氧化碳释放入大气中的净贡献低的优点，因为使用乙醇释放的二氧化碳通过植物材料的必要生产被再吸收以再生使用掉的乙醇。

[0013] 在通过发酵进行的传统乙醇生产中，所使用的植物材料是六碳糖，或是直接自含有游离单糖或二糖的植物提取，或是通过水解来自含有淀粉的植物部分的淀粉来生成。这些糖来自同样用于人类或用于动物消费的植物部分。因此，传统的乙醇生产直接竞争在其它情况中会用于食物或饲料的植物材料。食物变成燃料的转变在世界上引起了伦理关注，因为数百万人正在挨饿；计算显示生产一辆在美国非常普通的越野型轿车的一整罐燃料所需要的玉米的量大约是一个挨饿的人喂饱一整年所需要的量。

[0014] 一种备选解决办法是使用在其它情况中被看作是废物的木质纤维素植物材料来生成能量和燃料。这一般被看作是一种非常积极的方式，而且因此使用木质纤维素植物材料来生产乙醇的方式的开发在许多国家吸引了政治上和一般公众二者强力支持。另一个优点是木质纤维素材料丰富，事实上使得用乙醇替代50％或更多当前汽油消费在理论上可行。

[0015] 有众多木质纤维素材料来源可用于乙醇生产-前提是能建立有效且经济的收集和转变工艺。今天早就在进行收集的一些例子包括甘蔗渣、木屑、玉米秣(stover)和小麦秆。

[0016] 经由发酵使用木质纤维素材料生产乙醇中遭遇的两个主要技术问题是：1.难以将含有六碳糖的纤维素水解成葡萄糖但不生成妨碍或阻止微生物进一步将葡萄糖转变成乙醇的副产物；和2.缺乏能够有效将木质纤维素材料的半纤维素部分中存在的五碳糖(例如木糖和阿拉伯糖)转变成乙醇的生物体。

[0017] 啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为用于将自植物材料衍生的六碳糖转变成乙醇的优选微生物超过6000年。这是由于高乙醇产率、高比生产力和高乙醇耐受连同在低pH生长和发酵的能力(其它竞争微生物在低pH连存活都有麻烦)的有利组合。当纤维素水解的难题被克服时，那么酿酒酵母最有可能会继续作为用于通过发酵所释放的六碳糖单体来生成乙醇的优选生物体。但是，不幸的是，酿酒酵母不能代谢占木质纤维素糖材料多至三分之一的五碳糖。

[0018] 因此最近二十年进行工作来寻找遗传工程改造酿酒酵母以引入五碳糖发酵能力的方式。这项工作主要聚焦于木糖发酵，因为木糖占木质纤维素中五碳糖的主要部分。虽然酿酒酵母不能代谢木糖，但是它能够代谢异构体木酮糖(Wang and Schneider，1980)，木酮糖是构成进入戊糖磷酸途径的进入点的代谢产物。因此，原则上，通过给酿酒酵母提供将木糖转变成木酮糖的能力能解决所述问题。

[0019] 已经成功地将两种不同的现有的生化途径引入酿酒酵母，以经由木酮糖将木糖引导入戊糖磷酸途径中。在天然的代谢木糖的真菌中，木糖以两步过程被转变成木酮糖(见图1)。木糖首先被木糖还原酶(XR-EC 1.1.1.21)还原成木糖醇。然后木糖醇被木糖醇脱氢酶(XDH-EC 1.1.1.9)脱氢成木酮糖。还原酶和脱氢酶不存在于酿酒酵母中，但是有可能将编码这两种酶的基因自树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)转移入酿酒酵母中并表达，而且所得经过修饰的酿酒酵母菌株能够代谢木糖。

[0020] 这两种酶的活性需要NADPH和NAD+且生成NADP+和NADH，所以生物体必须通过代+ + +谢中别处的氧化还原过程来再生NAD-NADH和NADP-NADPH平衡，否则当NADPH和NAD 被耗尽时木糖代谢会停止运转。这样修饰的酿酒酵母菌株中相当低的木糖代谢速率和大量木糖醇的生成被归于木糖还原酶-木糖醇脱氢酶途径中的这种内在问题。

[0021] 在代谢木糖的细菌中，木糖难以转变成木酮糖：一种酶，即木糖异构酶(EC5.3.1.5)，直接将木糖转变成木酮糖(见图1)。这看上去更简单，而且它不产生上文所述+
NAD-NADPH失衡。因此，它也是第一种被提出用于将木糖代谢能力赋予酿酒酵母的策略。但是证明了这种策略难以运转。大多数来自细菌的木糖异构酶基因的表达没有导致酿酒酵母中活性木糖异构酶的存在，而且它的确切原因仍然未知。多项研究揭示了在酿酒酵母中常常能检测到自细菌基因表达产生的蛋白质，但是所表达的蛋白质显然未能折叠成活性酶。

[0022] 热稳定的酶在其它类型的极端条件中常常也更加稳定，诸如高盐和极端pH值。这可指示热稳定的酶更有可能维持(及或许还有获得)正确的折叠。而且，确实有可能找到自嗜热生物体分离的细菌木糖异构酶基因在酿酒酵母中表达活性木糖异构酶的例子(参见Walfridsson et al，1996；Bao et al，1999)。这些基因显示出使酿酒酵母能够代谢木糖，但是速率很低。速率低被归于如下事实，即热稳定的木糖异构酶在80-90℃具有最佳活性，但是容许大多数酿酒酵母菌株存活的温度是30-35℃。

[0023] 发明概述

[0024] 本发明涉及经过转化的微生物，其能够实现：(a)比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或(b)比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢；和/或(d)比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0025] 在另一个方面，本发明涉及包含依照本发明的微生物的接种物。

[0026] 在另一个方面，本发明涉及包含依照本发明的微生物的培养基。

[0027] 在又一个方面，本发明涉及用于制备经过转化的微生物的方法，所述方法包括转化微生物的步骤，使得所述经过转化的微生物能够实现：(a)比转化前的微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或(b)比转化前的微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)比转化前的微生物要更快的木糖代谢；和/或(d)比转化前的微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0028] 在另一个方面，本发明涉及发酵方法，包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。

[0029] 在又一个方面，本发明提供了用于生产自木糖衍生的产物的方法，包括在培养基中培养依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物。

[0030] 在另一个方面，本发明提供了用于生产生物燃料的方法，其中所述方法包括在培养基中培养本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物的步骤。

[0031] 在本发明的另一个方面，提供了通过本发明的方法获得的生物燃料。

[0032] 在本发明的又一个方面，提供了通过本发明的方法获得的自木糖衍生的产物。

[0033] 在本发明的又一个方面，提供了依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生产自木糖衍生的产物的用途。

[0034] 另外，本发明提供了依照本发明的微生物或通过本发明的方法制备的微生物用于生产生物燃料的用途。

[0035] 在另一个方面，本发明提供了经过转化的微生物，其中所述经过转化的微生物包含编码木糖异构酶的外源核苷酸序列。

[0036] 讨论

[0037] 先前寻找在例如酿酒酵母中表达时具有高活性的常温起源的细菌木糖异构酶基因的努力没有获得成功。出乎意料地，如本文中公开的，发明人现在成功地鉴定出含有编码如下木糖异构酶的核苷酸序列的细菌(特别是常温细菌)，该木糖异构酶在例如酿酒酵母中表达时在所述生物体中产生高胞内木糖异构酶活性。此类序列可用于例如工程化改造糖酵母属家族的菌株，以使所述酵母能够将木糖转变成木酮糖，并由此推动木糖的有效生成和/或代谢成乙醇。图4详细描绘了木糖代谢成乙醇；木酮糖-5-磷酸(一种可以自D-木糖衍生的中间产物)进入戊糖磷酸途径并在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。但是除此之外，此类序列还可用于将例如酿酒酵母的菌株工程化改造成其它经由戊糖磷酸途径自木糖衍生的化合物的有效生产者。此类化合物的例子包括但不限于芳香族氨基酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醛、糠醛、衣康酸/甲叉丁二酸、谷氨酸、柠檬酸、甲酚、赖氨酸、3-羟基丙酸、聚-3-羟基链烷酸盐/酯、原儿茶酸、焦儿茶酚、愈创木酚、藜芦醚、白藜芦醇、香草醛、香草酸、香草醇、粘康酸/己二烯二酸、肥酸/己二酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲酸、4-氨基苯甲酸盐/酯、4-羟基苯胺、4-甲氧基苯胺、醌醇/对苯二酚、茴香醚/苯甲醚、苯酚、氨茴酸/邻氨基苯甲酸、3-羟基氨茴酸盐/酯、2，3-二羟基苯甲酸、2-氨基苯酚、1，4-环己二酮、异戊二烯和苯乙烯。

[0038] 一些优点

[0039] 有利地，本发明涉及转化(工程化改造)微生物，诸如糖酵母属家族的微生物，以使所述微生物能够代谢木糖。这继而有利地提高微生物(特别是糖酵母属菌株)自含有木糖的原料(诸如木质纤维素材料)生成乙醇的效率。另外，它有利地提高微生物生成其它自戊糖磷酸途径中的中间产物衍生的天然或工程化代谢产物的效率，诸如芳香族氨基酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醛、糠醛、衣康酸/甲叉丁二酸、谷氨酸、柠檬酸、甲酚、赖氨酸、3-羟基丙酸、聚-3-羟基链烷酸盐/酯、原儿茶酸、焦儿茶酚、愈创木酚、藜芦醚、白藜芦醇、香草醛、香草酸、香草醇、粘康酸/己二烯二酸、肥酸/己二酸、4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、4-甲氧基苯甲酸、4-氨基苯甲酸盐/酯、4-羟基苯胺、4-甲氧基苯胺、醌醇/对苯二酚、茴香醚/苯甲醚、苯酚、氨茴酸/邻氨基苯甲酸、3-羟基氨茴酸盐/酯、2，3-二羟基苯甲酸、2-氨基苯酚、1，4-环己二酮、异戊二烯和苯乙烯。另外，它推动含有木糖的材料作为用于产业目的的糖酵母属家族菌株生长的原料的一般使用。

[0040] 又一个优点在于编码木糖异构酶的核苷酸序列衍生自常温生物体和/或能够在常温实现高活性。

[0041] 另一个优点在于依照本发明的微生物生成活性木糖异构酶。

[0042] 有利地，通过使用依照本发明的微生物，可生产生物燃料(诸如乙醇)。

[0043] 更有利地，通过使用依照本发明的微生物，可以自废物材料诸如农业废物(包括谷类秆-诸如小麦秆；甜菜浆；甘蔗渣；秣-诸如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)生产生物燃料。凭借本发明，不需要(或需要降低)使用在其它情况中能用作人的食物来源和/或动物饲料的材料(诸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱淀粉、玉蜀黍淀粉、小麦淀粉或玉米淀粉)。

[0044] 有利地，依照本发明的微生物能够通过戊糖(特别是木糖)发酵最佳地使用通过木质纤维素材料水解而释放的糖。

[0045] 本发明能够生产与基于石油的运输燃料相比要更CO2中性的生物燃料。与生产典型的基于石油的运输燃料(化石燃料)相比，凭借本发明，在依照本发明生产生物燃料时CO2排放会较低(甚至更低)。

[0046] 附图简述

[0047] 图1。代谢途径的示意图，详绘了两种戊醛糖，D-木糖和L-阿拉伯糖的代谢。这两种戊醛糖被转变成戊酮糖，并被进一步转变成D-木酮糖5-磷酸。不希望受理论束缚，如图中所示，一种类型的途径(醛糖还原酶型)见于真菌，而另一种类型的途径(异构酶型)见于细菌。在真菌途径类型中，第一种酶可以称作“D-木糖还原酶”和“L-阿拉伯糖还原酶”，但是常常同一种酶能还原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，而且可以然后服务于这两种途径且称作不太特异性的名称“醛糖还原酶”。

[0048] 图2。不希望受理论束缚，图2显示一些不太丰富的戊糖(D-和L-来苏糖，D-核糖)的真菌和细菌类型的代谢途径的示意图，详绘了初始代谢直至进入戊糖磷酸途径。

[0049] 图3。戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化性部分的示意图。

[0050] 图4。木糖变成乙醇的代谢转变的示意图。在这里，可以自D-木糖衍生的戊酮糖木酮糖-5-磷酸在厌氧条件下被进一步代谢成乙醇。XI指木糖异构酶，而XK指木酮糖激酶。显示了进入该过程的木糖净输入和来自该过程的乙醇净输出(净过程)。

[0051] 图5。经过编码细菌木糖异构酶的核苷酸序列转化的酿酒酵母中的木糖异构酶(XI)活性。所述细菌木糖异构酶衍生自(i)丁香假单胞菌(Pseudomonassyrmgae)、(ii)热硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)、(iii)热产硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfurigenes)/热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosulphurigenes)或(iv)乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)(木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus))。

[0052] 图6。经过编码且表达细菌木糖异构酶的核苷酸序列和编码且表达木酮糖激酶的核苷酸序列(自树干毕赤氏酵母克隆的)转化的酿酒酵母在木糖上的生长。

[0053] 图7。经过编码且表达变体乳球菌属木糖异构酶的核苷酸序列转化的酿酒酵母的木糖异构酶比活性。所述变体乳球菌属木糖异构酶(XI)具有氨基酸序列SEQ ID No 14、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ IDNo 20。

[0054] 发明详述

[0055] 如本文中使用的，短语“比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性”和“比转化前的微生物要更高的木糖异构酶活性”指经过转化的微生物在至少容许所述微生物维持的合适培养条件下培养时具有至少0.16、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0个木糖异构酶单位每mg微生物蛋白质的木糖异构酶活性；例如，所述培养基可包含一种或多种能够激活编码木糖异构酶的核苷酸序列表达的物质(例如木糖)，但是所述培养基不含任何能够抑制编码木糖异构酶的核苷酸序列表达的物质。实施例5中描述了合适培养条件的一个例子。所述木糖异构酶活性使用Dische和Borenfreund(1951)所述半胱氨酸-咔唑测定法来测量。经过转化的微生物的木糖异构酶活性比在与经过转化的微生物相同的培养条件下培养的转化前的等同微生物或转化前的微生物要高。

[0056] 如本文中使用的，短语“比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率”和“比转化前的微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率”指在相同条件下培养时，经过转化的微生物能够实现升高的生长速率，使得微生物数目加倍所需要的时间比转化前的等同微生物或转化前的微生物要短至少10％、15％、20％或25％。

[0057] 如本文中使用的，短语“比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢”和“比转化前的微生物要更快的木糖代谢”指在指数生长阶段内在相同条件下培养给定时间段时，经过转化的微生物能够代谢木糖，使得培养基中木糖的消耗量比转化前的等同微生物或转化前的微生物要高至少10％、20％、25％、30％或35％每个细胞。所述经过转化的微生物在至少容许所述微生物维持的合适培养条件下培养；例如，所述培养基可包含一种或多种能够激活编码木糖异构酶的核苷酸序列表达的物质(例如木糖)，但是所述培养基不含任何能够抑制编码木糖异构酶的核苷酸序列表达的物质。

[0058] 如本文中使用的，短语“比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成”和“比转化前的微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成”指以木糖作为碳源在厌氧条件下培养给定时间段时，经过转化的微生物能够比转化前的等同微生物或转化前的微生物要多生成至少10％、20％或30％乙醇每个细胞。

[0059] 如本文中使用的，术语“转化前的等同微生物”包括提到用编码木糖异构酶的核苷酸序列转化前或用引起木糖异构酶上调(例如过表达)的核苷酸序列转化前的微生物。

[0060] 在一个实施方案中，依照本发明的微生物经过引起微生物过表达木糖异构酶的核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组中，使得该微生物能够过表达编码木糖异构酶的内源核苷酸序列。

[0061] 在另一个实施方案中，依照本发明的微生物经过编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。例如，微生物经过包含与调节序列可操作连接的编码木糖异构酶的核苷酸序列的表达载体转化。

[0062] 优选地，依照本发明的微生物经过编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0063] 优选地，依照本发明的微生物经过编码外源木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0064] 优选地，依照本发明的微生物经过编码自乳球菌属物种衍生的外源木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0065] 在一个优选的实施方案中，依照本发明的微生物经过编码SEQ ID No14、SEQ ID No11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ IDNo 20所示氨基酸序列的核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物转化。

[0066] 在一个更优选的实施方案中，依照本发明的微生物经过编码SEQ ID No19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列的核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物转化。

[0067] 在一个优选的实施方案中，依照本发明的微生物经过SEQ ID No 1、SEQID No 10、SEQ ID No 17、SEQ ID No 12、SEQ ID No 27或SEQ ID No 28所示核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物转化。

[0068] 在一个更优选的实施方案中，依照本发明的微生物经过SEQ ID No 27或SEQ ID No 28所示核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物转化。

[0069] 在一个方面，依照本发明的微生物经过两种或更多种编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0070] 优选地，本文所述编码木糖异构酶的核苷酸序列在编码木糖异构酶的表达载体中。

[0071] 优选地，本文所述表达载体包含使得编码木糖异构酶的核苷酸序列能够过表达的启动子。此类启动子的例子包括GPD启动子、TEF启动子和ADP启动子。可用于过表达木糖异构酶的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的调节元件。

[0072] 在一个实施方案中，在依照本发明的方法中，微生物经过引起微生物过表达木糖异构酶的核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组中，使得该微生物能够过表达编码木糖异构酶的内源核苷酸序列。又例如，将启动子插入微生物的基因组中，使得该微生物能够组成性表达编码木糖异构酶的内源核苷酸序列。

[0073] 在另一个实施方案中，在依照本发明的方法中，微生物经过编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。例如，微生物经过包含与调节序列可操作连接的编码木糖异构酶的核苷酸序列的表达载体转化。又例如，微生物经过包含与调节序列可操作连接的编码木糖异构酶的核苷酸序列的表达载体转化，其中所述调节序列使得编码木糖异构酶的核苷酸序列能够组成性表达。

[0074] 优选地，在依照本发明的方法中，微生物经过编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0075] 优选地，在依照本发明的方法中，微生物经过编码外源木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0076] 在一个优选的实施方案中，在依照本发明的方法中，微生物经过包含SEQ ID No1、SEQ ID No 10、SEQ ID No 17、SEQ ID No 12、SEQ ID No 27或SEQ ID No 28所示核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物、编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0077] 在一个优选的实施方案中，在依照本发明的方法中，微生物经过编码包含SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列或其变体、同源物或衍生物的木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0078] 在一个方面，在依照本发明的方法中，微生物经过两种或更多种编码木糖异构酶的核苷酸序列转化。

[0079] 在依照本发明的方法中，优选地，编码木糖异构酶的核苷酸序列在编码木糖异构酶的表达载体中。

[0080] 如本文中使用的，术语“发酵方法”指在好氧和厌氧条件下培养一种或多种微生物。

[0081] 在一个实施方案中，培养基包含木糖和/或木糖源。

[0082] 在一个实施方案中，培养基包含戊糖和/或戊糖源。优选地，戊糖为木糖。在一个实施方案中，戊糖衍生和/或可衍生自木质纤维素材料。

[0083] 或者/另外，培养基包含自木质纤维素材料衍生的材料。

[0084] 优选地，依照本发明的方法进一步包括自培养基获得生物燃料的步骤。

[0085] 在一个实施方案中，自木糖衍生的产物选自下组：木酮糖，木酮糖-5-磷酸，乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

[0086] 优选地，自木糖衍生的产物选自下组：木酮糖，木酮糖-5-磷酸，乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸和聚-3-羟基链烷酸盐/酯。

[0087] 在一个高度优选的实施方案中，自木糖衍生的产物是乙醇。

[0088] 如本文中使用的，短语“引起微生物过表达木糖异构酶的核苷酸序列”和“能够过表达编码木糖异构酶的核苷酸序列的启动子”中的术语“过表达”指当经过转化的微生物与转化前的等同微生物比较时，表达自零升高至一定的表达水平或自较低的表达水平上升至较高的表达水平(例如上调)。过表达木糖异构酶的微生物具有升高的催化木糖转变成木酮糖的能力。将木糖转变成木酮糖的能力可通过测定细胞溶胞物自木糖生成木酮糖的能力来确认，即使用例如戊酮糖测定法来测定所生成的木酮糖，如Dische和Borenfreund(Dische and Borenfreund，1951)记载的，本文实施例部分也有描述。

[0089] 优选地，过表达木糖异构酶的经过转化的微生物能够实现：

[0090] (a)比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性；和/或

[0091] (b)比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或

[0092] (c)比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢；和/或

[0093] (d)比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0094] 过表达木糖异构酶的微生物的例子包括：(i)经过编码木糖异构酶的表达载体转化的微生物(在转化之前，所述微生物不能表达木糖异构酶)；和(ii)经过转化以上调内源木糖异构酶表达的微生物(在转化之前，所述微生物能够在指数生长期间在给定培养条件集下表达所述木糖异构酶，但是在转化之后，所述微生物能够在指数生长期间在相同的培养条件下以更高的水平表达所述木糖异构酶)。

[0095] 如本文中使用的，术语“编码木糖异构酶的核苷酸序列”涵盖包含调节序列的核苷酸序列，所述调节序列使得编码木糖异构酶的核苷酸序列能够表达，诸如可与编码木糖异构酶的核苷酸序列天然或非天然关联的启动子和增强子。

[0096] 在一个方面，本发明提供了经过遗传修饰的酵母细胞，其具有自乳球菌属家族的微生物衍生的功能性外源木糖异构酶基因，其中所述外源木糖异构酶基因可操作连接至在所述酵母中有功能的启动子和终止子序列。

[0097] 在另一个方面，本发明提供了一种发酵方法，其中在包括自木质纤维素材料衍生的材料的发酵液中在发酵条件下培养本文所述微生物。

[0098] 在又一个方面，本发明提供了利用依照本发明的微生物的发酵方法，其中发酵液(即培养基)包含戊糖。

[0099] 经过转化的微生物

[0100] 如本文所述，术语“经过转化的微生物”指通过重组DNA技术经过遗传改变的微生物。如本文中使用的，术语“经过转化的”与术语诸如“经过转染的”、“重组的”、“经过遗传工程改造的”和“经过遗传修饰的”同义。

[0101] 涉及本发明的术语“经过转化的微生物”包括任何包含如下的表达载体的微生物，所述表达载体包含本文所述核苷酸序列和/或能够容许本文所述核苷酸序列表达(特别是过表达，即上调)的启动子。在一个实施方案中，将核苷酸序列掺入微生物的基因组。在另一个方面，将启动子掺入微生物的基因组。这些特征使得经过转化的微生物(在与转化前的等同微生物比较时)具有(a)更高的木糖异构酶活性；和/或(b)更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率；和/或(c)更快的木糖代谢；和/或(d)更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0102] 术语“经过转化的微生物”不涵盖在它们的天然启动子(在其天然环境中的)控制下的天然核苷酸编码序列(在其天然环境中的)。

[0103] 因此，本发明的经过转化的微生物包括包含下述任一项或其组合的微生物：编码本文所述酶的核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的构建物，包含所述核苷酸序列的载体，包含所述核苷酸序列的质粒和包含所述核苷酸序列的表达载体。

[0104] 如此，本发明的又一个实施方案提供经表达本文所述酶的核苷酸序列转化或转染的微生物。微生物会选择成与载体相容，而且可以是例如细菌、真菌或酵母细胞。

[0105] 合适的细菌宿主生物体的例子是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌物种。

[0106] 根据编码本文所述酶的核苷酸序列的性质，真核宿主诸如酵母或其它真菌可能是优选的。一般地，优选酵母细胞胜过真菌细胞，因为它们易于操作。

[0107] 合适的微生物-诸如酵母和真菌宿主细胞-的使用可提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，因为它们可能是赋予本文所述重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。

[0108] 合适的微生物包括细菌、真菌和酵母。优选地，微生物是酵母。

[0109] 优选地，所述经过转化的微生物是经转化酵母。优选地，所述经转化酵母衍生自糖酵母属/酵母属。更优选地，所述经转化酵母是酿酒酵母。

[0110] 在一个实施方案中，本文所述经过转化的微生物能够实现比转化前的等同微生物要更高的木糖异构酶活性。

[0111] 在另一个方面，本文所述经过转化的微生物能够实现比转化前的等同微生物要更高的在包含木糖的生长培养基中或上的生长速率。

[0112] 在又一个方面，本文所述经过转化的微生物能够实现比转化前的等同微生物要更快的木糖代谢。

[0113] 在另一个方面，本文所述经过转化的微生物能够实现比转化前的等同微生物要更高的以木糖作为碳源厌氧培养时的乙醇生成。

[0114] 微生物可以使用本领域例行的技术诸如电穿孔(Sambrook等，1989)来转化。另外，经过转化的微生物中序列的存在可以通过合适培养基上的生长选择来确定，所述合适培养基选择经过转化的微生物的生长。或者/另外，插入的异源DNA序列的存在可以通过使用为插入的序列专门设计的引物进行的直接菌落PCR来确定。此类技术是本领域公知的且例行的(参见例如Sambrook等，1989和Ausubel等，1995)。

[0115] 依照本发明的经过转化的微生物可以与一种或多种别的微生物组合使用。例如，一种或多种依照本发明的经过转化的微生物可以与能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成分之一的至少一种微生物组合培养：乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

[0116] 在又一个方面，提供下述各项的组合：(i)一种或多种依照本发明的经过转化的微生物和(ii)至少一种能够在某些培养条件下生成选自下列的多种成分之一的别的微生物：乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

[0117] 另外，本发明提供包含依照本发明的经过转化的微生物和一种或多种别的微生物的组合的接种物。

[0118] 另外，提供包含依照本发明的经过转化的微生物和一种或多种别的微生物的组合的培养基。

[0119] 另外，本发明提供包含接种物的试剂盒，所述接种物包含一种或多种依照本发明的微生物。

[0120] 另外，本发明提供包含下述各项的试剂盒：(i)包含一种或多种依照本发明的微生物的接种物和(ii)包含一种或多种别的微生物的接种物。

[0121] 经过转化的酵母

[0122] 在一个优选的实施方案中，所述转基因微生物是酵母。

[0123] 在酵母中表达异源基因的原理的综述提供于例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。

[0124] 在这点上，酵母(诸如物种酿酒酵母或巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris))(参见FEMS Microbiol Rev(200024(1)：45-66)可用作异源基因表达的媒介。

[0125] 在酿酒酵母中表达异源基因及分泌基因产物的原理的综述提供于EHinchcliffe E Kenny(1993，“Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes”，Yeasts，Vol 5，Anthony H Rose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic Press Ltd.)。

[0126] 为了转化酵母，开发了数种转化方案。例如，依照本发明的转基因糖酵母属可通过遵循Hinnen et al.，(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；Ito，H et al(1983，J Bacteriology 153，163-168)的教导来制备。

[0127] 经过转化的酵母细胞可使用各种选择标志来选择，诸如营养缺陷标志显性抗生素抗性标志。

[0128] 表达载体

[0129] 术语“表达载体”指能够在体内或在体外表达的构建物。

[0130] 一方面，将表达载体掺入合适微生物的基因组。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基因组。

[0131] 本文所述核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接至调节序列，其能够提供合适宿主微生物对核苷酸序列的表达。

[0132] 将载体转化入本文所述合适宿主微生物。

[0133] 载体的选择(例如质粒、粘粒、或噬菌体载体)常常会取决于它要导入的微生物。

[0134] 供本文中使用的载体可以含有一种或多种选择标志核苷酸序列-诸如赋予抗生素抗性的核苷酸序列，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。或者，可以通过共转化来实现选择(如WO91/17243中记载的)。

[0135] 载体可以在体外使用，例如转染、转化、转导或感染宿主微生物。

[0136] 载体可以进一步包含使得载体能够在所讨论的宿主微生物中复制的核苷酸序列。此类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

[0137] 在一个优选的方面，如本文所述能够将木糖转变成木酮糖的微生物包含编码木糖异构酶的核苷酸序列。

[0138] 优选地，如本文所述的表达载体包含编码木糖异构酶的核苷酸序列。

[0139] 在又一个方面，优选地，如本文所述能够将木糖转变成木酮糖的微生物包含至少一种编码木糖异构酶的表达载体。

[0140] 优选地，另一方面，如本文所述能够将木糖转变成木酮糖的微生物可进一步包含至少一种编码选自下组的一种或多种酶的表达载体：木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸异构酶，核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮醇酶和戊糖磷酸途径的任何其它酶。更优选地，所述如本文所述能够将戊醛糖转变成戊酮糖的微生物进一步包含至少一种编码木酮糖激酶的表达载体。

[0141] 一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶：醛糖-1-差向异构酶，木糖还原酶，D-木酮糖还原酶，阿拉伯糖还原酶，L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶，L-木酮糖还原酶，L-阿拉伯糖异构酶，核酮糖激酶，核酮糖磷酸4-差向异构酶，D-来苏糖异构酶，D-核糖异构酶，木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核酮糖-5-磷酸差向异构酶，核糖-5-磷酸异构酶，转醛醇酶，和转酮醇酶。

[0142] 一方面，如本文所述的表达载体可进一步编码选自下组的一种或多种酶：醛糖-1-差向异构酶，木酮糖激酶，D-核酮糖激酶，核糖-5-磷酸异构酶，D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶，转醛醇酶，转酮醇酶和戊糖磷酸途径的任何其它酶。优选地，所述如本文所述的表达载体进一步编码木酮糖激酶。

[0143] 在一个优选的方面，如本文所述能够将木糖转变成木酮糖的微生物进一步包含至少一种编码醛糖-1-差向异构酶的表达载体。

[0144] 优选地，如本文所述的表达载体进一步包含编码醛糖-1-差向异构酶的核苷酸序列。

[0145] 调节序列

[0146] 在一些应用中，将本文所述核苷酸序列可操作连接至调节序列，其能够提供核苷酸序列的表达，诸如由所选择的微生物进行。举例而言，本发明涵盖使用如下的载体，其包含可操作连接至此类调节序列的本文所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。

[0147] 术语“可操作连接”指如下的并置，其中所述成分的关系容许它们以它们的预定方式发挥功能。“可操作连接”至编码序列的调节序列以如下方式连接，即在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

[0148] 术语“调节序列”包括启动子和增强子和其它表达调节信号。

[0149] 在一个实施方案中，调节序列使与该调节序列可操作连接的核苷酸序列能够在宿主细胞中组成性表达。

[0150] 如本文中使用的，术语“组成性表达的”和“组成性表达”指与调节序列(诸如组成性启动子)可操作连接的核苷酸序列的连续转录。如此，例如，培养基不需要包含物质来激活编码木糖异构酶的核苷酸序列表达。又例如，培养基不能包含抑制调节序列并因此抑制编码木糖异构酶的核苷酸序列表达的物质。

[0151] 术语“启动子”以本领域普通含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。

[0152] 编码本文所述酶的核苷酸序列的增强的表达还可以通过选择异源调节区来实现，例如启动子、分泌前导和终止子区。

[0153] 优选地，将本文所述核苷酸序列可操作连接至至少一种启动子。

[0154] 其它启动子可同样用于指导本文所述多肽的表达。

[0155] 用于在细菌、真菌或酵母细胞中指导核苷酸序列转录的合适启动子的例子是本领域公知的。

[0156] 启动子可另外包括特征以确保或提高合适宿主中的表达。例如，所述特征可以是保守区，诸如Pribnow框或TATA框。

[0157] 在一个实施方案中，启动子使与该启动子可操作连接的核苷酸序列能够在宿主细胞中组成性表达。

[0158] 构建物

[0159] 术语“构建物”-其与术语诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”同义-包括直接或间接附着至启动子的本文所述核苷酸序列。

[0160] 间接附着的一个例子是在启动子和本文所述核苷酸序列中间提供合适的间隔物基团，诸如内含子序列，诸如Sh1内含子或ADH内含子。涉及本发明的术语“融合”也是如此，其包括直接或间接附着。在一些情况中，这些术语不覆盖天然组合的编码通常与野生型基因启动子有关的蛋白质且它们都处于天然环境中时的核苷酸序列。

[0161] 构建物甚至可以含有或表达标志物，其容许选择遗传构建物。

[0162] 对于一些应用，优选地，构建物至少包含可操作连接至启动子的本文所述核苷酸序列。

[0163] 启动子

[0164] 如本文所述，一方面，本发明涉及已经用引起微生物过表达木糖异构酶的核苷酸序列，诸如启动子转化的微生物。

[0165] 例如，将启动子插入微生物的基因组，这使得微生物能够过表达(例如上调)编码木糖异构酶的内源核苷酸序列。

[0166] 在一个实施方案中，将启动子插入微生物的基因组中，这使该微生物能够组成性表达编码木糖异构酶的内源核苷酸序列。

[0167] 另一方面，将启动子可操作连接至例如表达载体中的核苷酸序列。

[0168] 在一个实施方案中，启动子使与该启动子可操作连接的核苷酸序列能够在宿主细胞中组成性表达。

[0169] 另一方面，启动子不受葡萄糖的存在遏制。

[0170] 能在依照本发明的微生物，诸如酿酒酵母中使用的合适启动子的例子包括：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的启动子；醇脱氢酶(ADH)基因的启动子；和促甲状腺胚胎因子(TEF)基因的启动子。

[0171] 可用于过表达木糖异构酶的优选启动子可以是在酵母，特别是糖酵母属，诸如酿酒酵母中控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的任何调节元件。这些的例子有葡萄糖激酶(GLK1)启动子、磷酸葡萄糖异构酶(PGI1)启动子、磷酸果糖激酶(PFK1)启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)启动子。

[0172] 生物燃料

[0173] 如本文中使用的，术语“生物燃料”指适合于在(例如)内燃机中使用的燃料(例如液体燃料)。所述生物燃料衍生自包含戊糖和/或通过酶手段和/或通过酸处理的水解能衍生戊糖的生物学物质。优选地，所述戊糖是戊醛糖木糖。

[0174] 植物材料-包括包含木质纤维素材料的植物废物(例如：谷类秆，诸如小麦秆；甜菜浆；甘蔗渣；高粱秣；大豆秣；玉蜀黍秣；玉米秣；木屑；和纸浆)和完整植株(诸如那些为能量目的而种植的，例如柳枝稷)-是用于本发明的戊糖，特别是戊醛糖(诸如木糖)的合适来源。植物材料的其它合适来源包括非废物产品(换言之，食物和饲料来源)诸如甘蔗提取物、甜菜提取物、高粱、大豆、小麦淀粉和玉米淀粉。

[0175] 优选地，本文所述生物燃料包含至少一种醇。

[0176] 在一个优选的方面，醇选自下组：甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。更优选地，生物燃料包含乙醇。

[0177] 优选地，所述生物燃料是自一种或多种依照本发明的经过转化的微生物已经在合适条件下培养的培养基获得的(或可获得的)-换言之，提取(或可提取的)。所述生物燃料可以是使用本领域常规技术自培养基获得的(或可获得的)，诸如通过离心除去微生物、分离上清液接着蒸馏、和进一步的脱水步骤以产生99.5％纯的醇诸如乙醇。

[0178] 生物燃料可包含一种或多种别的生物燃料成分，诸如丁醇。

[0179] 可以在自培养物获得或提取(可获得的或可提取的)生物燃料之前和/或之后将一种或多种别的生物燃料成分与生物燃料混合。

[0180] 或者/另外，可以在在培养基中培养依照本发明的经过转化的微生物以生成生物燃料之前和/或之后和/或同时通过在培养基中培养微生物来生成一种或多种别的生物燃料成分。

[0181] 本发明还提供包含使用依照本发明的微生物生成的生物燃料的运输燃料。

[0182] 用作运输燃料的乙醇可用于两种不同目的：

[0183] (i)它能起氧化添加剂(oxygenated additive)的作用以提高辛烷值和降低新配方汽油(RFG)(四乙铅或MTBE替代物)排放；

[0184] (ii)它能起常规汽油(RG)部分或完全替代品的作用以降低对汽油供给的依赖性。

[0185] 无水乙醇具有130的辛烷值，而且能以5-10％的浓度(取决于季节)添加至直接自精炼厂获得的常规汽油。传统上，将四乙铅用于提高辛烷，然而，由于健康问题，几乎全世界都禁止使用铅。向常规汽油添加氧化剂(oxygenate)降低一氧化碳排放以及造成空气污染的其它颗粒。甲基叔丁基醚(MTBE)最初用作氧化添加剂，然而，饮用水含水层中MTBE污染的发生促使一些州禁止使用这种氧化剂。乙醇在全世界日益用作MTBE的替代物，作为RFG制造的氧化添加剂。

[0186] 在充当新配方汽油生产中的氧化添加剂之外，乙醇可用作常规汽油的一般替代品。在发动机没有任何改变的情况中，汽车能使用E10混合物(添加10％乙醇)。

[0187] 另外，已经制造了能以100％乙醇运行的交通工具-换言之，不需要基于化石的燃料。

[0188] 依照本发明的经过转化的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物能够以比转化前的等同微生物要更高的速率生成生物燃料。如本文中使用的，术语“更高的速率”指在相同培养条件下培养指数生长期内的给定时间段时，经过转化的微生物能够在培养基中生成比转化前的等同微生物多至少5％、10％、20％、25％、30％或35％的生物燃料(诸如生物乙醇)每细胞。

[0189] 木糖衍生产物

[0190] 如本文中使用的，术语“木糖衍生产物”或“自木糖衍生的产物”指任何自木糖衍生的化合物。

[0191] 自木糖衍生的产物的例子包括但不限于：乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

[0192] 可以将自木糖衍生的产物转变成其它产物。例如，可以经戊糖磷酸途径将自戊醛糖D-木糖衍生的戊酮糖D-木酮糖转变成乙醇。

[0193] 优选地，所述自木糖衍生的产物是选自下组的一种或多种：乙醇，芳香族氨基酸，乳酸，琥珀酸，乙酸，乙醛，糠醛，衣康酸/甲叉丁二酸，谷氨酸，柠檬酸，甲酚，赖氨酸，3-羟基丙酸，聚-3-羟基链烷酸盐/酯，原儿茶酸，焦儿茶酚，愈创木酚，藜芦醚，白藜芦醇，香草醛，香草酸，香草醇，粘康酸/己二烯二酸，肥酸/己二酸，4-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲醛，4-甲氧基苯甲酸，4-氨基苯甲酸盐/酯，4-羟基苯胺，4-甲氧基苯胺，醌醇/对苯二酚，茴香醚/苯甲醚，苯酚，氨茴酸/邻氨基苯甲酸，3-羟基氨茴酸盐/酯，2，3-二羟基苯甲酸，2-氨基苯酚，1，4-环己二酮，异戊二烯和苯乙烯。

[0194] 更优选地，所述自木糖衍生的产物是乙醇。

[0195] 培养基

[0196] 在一个实施方案中，培养基包含木糖和/或木糖源。

[0197] 另外，培养基可包含至少一种别的戊糖。在一个优选的方面，培养基进一步包含至少一种戊醛糖。

[0198] 优选地，经过转化的微生物在所述微生物的最适培养基中培养。使用常规技术，可以确定最适培养基；另外，可以确定最适生长条件。

[0199] 在一个实施方案中，培养基包含一种或多种能够激活编码木糖异构酶的核苷酸序列在依照本发明的微生物中表达的物质，但是所述培养基不包含任何能够抑制编码木糖异构酶的核苷酸序列在依照本发明的微生物中表达的物质。例如，如果编码木糖异构酶的核苷酸序列包含木糖诱导型启动子，那么培养基包含木糖。

[0200] 一方面，所述培养基在接种微生物(即在时间零)之前包含约1％、约2％、约4％、约8％、约15％或约25％木糖。

[0201] 优选地，所述培养基包含最适量的盐、维生素和微生物所必需的其它养分。

[0202] 微生物优选于它们的最适生长温度培养。技术人员会容易地能够确定培养本文所述微生物的最适温度。

[0203] 在一个实施方案中，微生物于约20℃、25℃、30℃、35℃、或37℃培养。

[0204] 在一个实施方案中，微生物于约35℃至39℃、优选约36℃至38℃、更优选约35.5℃至37.5℃培养。

[0205] 在一个实施方案中，微生物培养约3至96小时，优选约3至48小时、约3至24小时、约3至15小时和约3至6小时。

[0206] 优选地，微生物培养约3小时、约6小时、约15小时、约24小时、约48小时或约96小时。

[0207] 一方面，微生物，特别是经过转化的微生物，是醇耐受的和/或酸耐受的。

[0208] 涉及本发明的术语“醇耐受的”指微生物能够在包含至少2％、5％、10％或15％醇的培养基中生长。

[0209] 如本文所述，术语“酸耐受的”指微生物能够在pH等于或小于6.5、6.0、5.0、4.0或3.0的培养基中生长。

[0210] 在一个优选的方面，给培养基接种至少5X107至5X1011个细胞每kg培养基，优选8 10 9 10
5X10 至5X10 个细胞每kg培养基，优选1X10 至1X10 个细胞每kg培养基和更优选约
9
5X10 个细胞每kg培养基。

[0211] 术语“接种物”和“起始培养物”可互换使用。

[0212] 培养条件至少容许依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物维持。培养条件可任选容许依照本发明的微生物或通过依照本发明的方法制备的微生物生长。

[0213] 木糖源

[0214] 木糖是一种戊醛糖。木糖可衍生自：通常用作食物或饲料来源的植物材料(诸如：甘蔗、甜菜、高粱、小麦和玉米-它们是富含淀粉和富含糖的植物材料)；完整植株(诸如那些为能量目的而种植的，例如柳枝稷)；和，特别地，废物农业(植物)材料(诸如：谷类秆，例如小麦秆；甜菜浆；渣，例如甘蔗渣；秣，例如高粱、大豆、玉蜀黍或玉米秣；和木屑)。

[0215] 用于本文所述培养基的木糖源包括通常视为农业废物材料的木质纤维素材料。茎/干、柄梗和叶含有木质纤维素材料，而且因此是木质纤维素材料的来源。甘蔗渣、玉米秣和木屑(只有半纤维素)是三种容易获得的木质纤维素材料来源，因为这些在各个季节易于大量收集或储存。

[0216] 木质纤维素材料主要由长糖链组成。平均而言，三分之二的这些糖是己糖，它们主要以纤维素存在，而且三分之一的糖是戊糖，主要以阿拉伯糖基木聚糖聚合物存在。

[0217] 显著量的半纤维素衍生戊糖是木糖。

[0218] 可以水解木质纤维素材料以释放纤维素、半纤维素和木质素的长链糖中的己糖和/或戊糖。

[0219] 木质纤维素材料的水解可以通过升高的温度的酸处理来进行。然而，这种处理可生成糖衍生副产物，它们对大多数微生物有毒，而且阻止糖转变成乙醇。可以除去此类有毒副产物(如果生成的话)，但是这一般是不经济的。

[0220] 或者，可以使用纤维素和半纤维素水解酶来水解木质纤维素材料。有利地，这种工艺避免有毒副产物的生成。

[0221] 在一个优选的方面，培养基包含自一种或多种经处理以释放木糖的木质纤维素材料(此类处理技术的例子包括蒸气处理、蒸气爆发、湿氧化、酸水解、碱性湿氧化和氨纤维膨胀)衍生的材料。优选地，通过酶促水解工艺来处理木质纤维素材料。可以进一步处理所述经水解的木质纤维素材料以提取糖，之后在培养基中使用所述提取物。

[0222] 木质纤维素材料的水解

[0223] 初步机械处理：

[0224] 根据需要及在认为需要时，将木质纤维素材料砍成小片。例如，将小麦秆切成长度为大约5cm的段。

[0225] 后续湿热预处理：

[0226] 木质纤维素材料的湿热预处理可以以蒸汽预处理接着清洗步骤来进行，由此生成纤维级分和液体级分。纤维级分含有超过90％的纤维素、最初存在于纤维素材料中的木质素、和一些半纤维素。液体级分含有来自半纤维素的糖(C5糖)、超过90％的包含在木质纤维素生物质中的碱金属氯化物、和大部分自木质纤维素原料预处理产生的发酵抑制剂。

[0227] 典型地，通过蒸汽将小麦秆加热至介于180和200℃之间的温度，停留时间5-15分钟。自压力反应器卸下经预处理的生物质，并清洗和挤压。收集释放的蒸汽，并再次用于液体级分蒸发以进料糖蜜。

[0228] 酶促水解：

[0229] 糖聚合物的后续水解可以通过添加纤维素酶和半纤维素酶来进行，或是在发酵之前或是在发酵期间或是二者，就像同步糖化和发酵工艺等。

[0230] 己糖

[0231] 己糖具有6个碳原子。己醛糖在1位具有醛，而己酮糖在2位具有酮。葡萄糖是己醛糖的例子。果糖是己酮糖的例子。

[0232] 戊糖

[0233] 戊糖具有5个碳原子。戊糖或是具有1位醛官能团(戊醛糖)或是具有2位酮官能团(戊酮糖)。木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、木酮糖和核酮糖是戊糖的例子。

[0234] 戊醛糖

[0235] 木糖、阿拉伯糖、核糖和来苏糖是戊醛糖的例子。

[0236] 在一个方面，优选地，所述戊醛糖是木糖。

[0237] 木糖可以是L-木糖或D-木糖。

[0238] 优选地，所述木糖是D-木糖。

[0239] 戊酮糖

[0240] 木酮糖和核酮糖是戊酮糖的例子。

[0241] 在一个方面，所述戊酮糖是木酮糖或核酮糖。

[0242] 在一个优选的方面，所述戊酮糖是木酮糖。

[0243] 木酮糖可以是L-木酮糖或D-木酮糖。

[0244] 优选地，所述木酮糖是D-木酮糖。

[0245] 在一个备选的实施方案中，所述戊酮糖是核酮糖。更优选地，所述核酮糖是D-核酮糖。

[0246] 酶

[0247] 本文所述酶命名法编号(EC号)指1992年出版的国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会关于酶命名和分类的推荐(ISBN 0-12-227165-3)。

[0248] 本文所述酶可以由自极其多种来源衍生的核苷酸序列生成。一方面，编码本文所述酶的核苷酸序列可以衍生或可衍生自乳球菌属物种(诸如乳酸乳球菌和乳酸乳球菌乳亚种)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、Piromyces sp、热厌氧杆菌属物种(诸如热硫化氢热厌氧杆菌和热产硫磺热厌氧杆菌)、树干毕赤氏酵母、或酿酒酵母。优选地，编码本文所述酶的核苷酸序列衍生或可衍生自乳球菌属物种(诸如乳酸乳球菌和乳酸乳球菌乳亚种)。

[0249] 木糖异构酶(EC 5.3.1.5)

[0250] 木糖异构酶具有EC命名法编号EC 5.3.1.5。木糖异构酶可称作D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶、或D-木糖酮醇异构酶。

[0251] 术语木糖异构酶指能够将D-木糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。

[0252] 本文所述木糖异构酶能够作用于D-木糖。

[0253] 木糖异构酶可衍生自细菌物种，诸如乳球菌属物种。特别地，木糖异构酶可衍生自乳酸乳球菌乳亚种；乳酸乳球菌乳亚种菌株NRRL B-449；乳酸乳球菌乳亚种菌株KF147；乳酸乳球菌乳亚种菌株DSM20175；和乳酸乳球菌乳亚种菌株IO-1。

[0254] 适合于如本文所述使用的木糖异构酶的例子包括包含SEQ ID No 14、SEQ ID No11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列或其变体、同源物或衍生物；GenBank登录号ABX75758所示氨基酸序列；或GenBank登录号AAD20249所示氨基酸序列的木糖异构酶。

[0255] 适合于如本文所述使用的木糖异构酶的例子包括由下述各项编码的木糖异构酶：SEQ ID No 1、SEQ ID No 10、SEQ ID No 17、SEQ ID No 12、SEQID No 27或SEQ ID No 28所示核苷酸序列或其变体、同源物或衍生物；编码SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No
18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列或其变体、同源物或衍生物的核苷酸序列。

[0256] 醛糖-1-差向异构酶(EC 5.1.3.3)

[0257] 本文所述醛糖-1-差向异构酶能够作用于戊醛糖。

[0258] 醛糖-1-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.3。醛糖-1-差向异构酶可称作变旋酶或醛糖变旋酶。

[0259] 术语醛糖-1-差向异构酶指能够将α-戊醛糖转变成β-戊醛糖和反之亦然的酶。

[0260] 在一个优选的实施方案中，醛糖-1-差向异构酶由选自下组的核苷酸序列编 码：AAD20257，ABX75760，AAK05605，AAD20245，AAD20251，ABJ73095，ABI49935 和AAO80762(NCBI登录号)。更优选地，醛糖-1-差向异构酶选自下组：AAD20257，ABX75760，AAK05605，AAD20245和AAD20251。

[0261] 适合于如本文所述使用的醛糖-1-差向异构酶的例子包括由下述各项编码的醛糖-1-差向异构酶：乳酸乳球菌醛糖-1-差向异构酶基因的核苷酸序列(NCBI登录号AAD20245)；酿酒酵母GAL10基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活性的氨基酸序列的部分)；和酿酒酵母菌株D0002 GAL10基因的核苷酸序列(特别地，编码具有变旋酶活性的氨基酸序列的部分)。

[0262] 醛糖还原酶(EC 1.1.1.21)

[0263] 醛糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。醛糖还原酶可称作：多元醇脱氢酶，醛还原酶，ALR2，NADPH-戊醛糖还原酶，NADPH-醛糖还原酶，醛醇：NADP氧化还原酶或醛醇：+
NADP1-氧化还原酶。

[0264] 术语醛糖还原酶指能够将醛醇转变成醛糖和反之亦然的酶。

[0265] 醛糖还原酶可还原超过一种类型的醛糖。例如，同一种酶可以能够还原D-木糖和L-阿拉伯糖二者，此类酶因此可称作醛糖还原酶，或者，它可以更特异性地以底物之一命名，例如木糖还原酶。

[0266] 木糖还原酶(EC 1.1.1.21)

[0267] 在一个实施方案中，醛糖还原酶是木糖还原酶。木糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。

[0268] 术语木糖还原酶指能够将D-木糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。

[0269] 本文所述木糖还原酶能够作用于D-木糖。

[0270] 适合于如本文所述使用的木糖还原酶的例子包括由下述各项编码的木糖还原酶：树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木糖还原酶基因(PsXR)的核苷酸序列-NCBI登录号X59465；纤细假丝酵母(Candida tenuis)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核苷酸序列可以如Kavanagh等，2003所述来获得)；和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)的核苷酸序列(所述编码木糖还原酶的核苷酸序列可以如Woodyer等，2005所述来获得)。

[0271] 阿拉伯糖还原酶(EC 1.1.1.21)

[0272] 在另一个实施方案中，醛糖还原酶是阿拉伯糖还原酶。阿拉伯糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.21。

[0273] 术语阿拉伯糖还原酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-阿拉伯糖醇和反之亦然的酶。

[0274] 本文所述阿拉伯糖还原酶能够作用于L-阿拉伯糖。

[0275] 本领域当前已知的D-木糖还原酶也可以相似活性作用于作为底物的L-阿拉伯糖。因此，术语L-阿拉伯糖还原酶也可指归类为D-木糖还原酶的酶，而且适合于引入木糖代谢的本文所述木糖还原酶类似地适合用于将阿拉伯糖代谢引入微生物。

[0276] 在又一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将L-来苏糖转变成L-阿拉伯糖醇和反之亦然。在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将D-来苏糖转变成D-阿拉伯糖醇和反之亦然。

[0277] 在另一个实施方案中，醛糖还原酶可以能够将核糖转变成核糖醇(特别是将D-核糖转变成D-核糖醇)和反之亦然。

[0278] 木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9和EC 1.1.1.10)

[0279] 术语木酮糖还原酶涵盖D-木酮糖还原酶和L-木酮糖还原酶。

[0280] D-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.9)

[0281] D-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.9。D-木酮糖还原酶可称作木糖醇脱氢酶、木糖醇-2-脱氢酶、2，3-顺式-多元醇(DPN)脱氢酶(C3-5)、NAD依赖性木糖醇脱氢酶、赤藓糖醇脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。

[0282] 术语D-木酮糖还原酶指能够将木糖醇转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。

[0283] 本文所述D-木酮糖还原酶能够作用于木糖醇。

[0284] 适合于如本文所述使用的D-木酮糖还原酶的例子包括由下述各项编码的D-木酮糖还原酶：树干毕赤氏酵母D-木酮糖基因(PsXDH)的核苷酸序列；和树干毕赤氏酵母菌株DSM3651D-木酮糖还原酶基因(PsXDH)的核苷酸序列-NCBI登录号X55392。

[0285] L-木酮糖还原酶(EC 1.1.1.10)

[0286] L-木酮糖还原酶具有EC命名法编号1.1.1.10。L-木酮糖还原酶可称作L-木糖醇脱氢酶。

[0287] 术语L-木酮糖还原酶指能够将L-木酮糖转变成木糖醇和反之亦然的酶。

[0288] 本文所述L-木酮糖还原酶能够作用于L-木酮糖。

[0289] 编码L-木酮糖还原酶的核苷酸序列可以自黑曲霉(Aspergillus niger)(如Witteveen等，1994所述)或自酵母单孢神食酵母(Ambrosiozymamonospora)(Verho等，2004)获得。

[0290] 木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)

[0291] 木酮糖激酶具有EC命名法编号2.7.1.17。木酮糖激酶可称作D-木酮糖激酶。

[0292] 术语木酮糖激酶指能够将D-木酮糖转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0293] 本文所述木酮糖激酶能够作用于D-木酮糖。

[0294] 适合于如本文所述使用的木酮糖激酶的例子包括由下述各项编码的木酮糖激酶：树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因(PsXKS)的核苷酸序列；树干毕赤氏酵母菌株DSM3651木酮糖激酶基因(PsXKS)的核苷酸序列-NCBI登录号AF127802；酿酒酵母木酮糖激酶基因(ScXKS)的核苷酸序列；和酿酒酵母菌株D0002木酮糖激酶基因(ScXKS)的核苷酸序列-NCBI登录号X61377。

[0295] D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.11)

[0296] D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.11。D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶可称作D-阿拉伯糖醇脱氢酶或阿拉伯糖醇脱氢酶。

[0297] 术语D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将D-阿拉伯糖醇转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。

[0298] 本文所述D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于D-阿拉伯糖醇。

[0299] 一种合适的D-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Cheng等，2005。

[0300] L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.12)

[0301] L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.12。L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶可称作L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶或戊糖醇-DPN脱氢酶。

[0302] 术语L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶指能够将L-阿拉伯糖醇转变成L-木酮糖和反之亦然的酶。

[0303] 本文所述L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶能够作用于L-阿拉伯糖醇。

[0304] 一种合适的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Richard等，2001。

[0305] L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4)

[0306] L-阿拉伯糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.4。L-阿拉伯糖异构酶可称作L-阿拉伯糖酮醇异构酶。

[0307] 术语L-阿拉伯糖异构酶指能够将L-阿拉伯糖转变成L-核酮糖和反之亦然的酶。

[0308] 本文所述L-阿拉伯糖异构酶能够作用于L-阿拉伯糖。

[0309] 编码L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列的一个例子是可以自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得的核苷酸序列(NCBI登录码NC_004567中记载的基因)。

[0310] 核酮糖激酶(EC 2.7.1.16)

[0311] 核酮糖激酶具有EC命名法编号2.7.1.16。核酮糖激酶可称作L-核酮糖激酶。

[0312] 术语核酮糖激酶指能够(i)将L-核酮糖转变成L-核酮糖5-磷酸和反之亦然；和/或(ii)将D-核酮糖转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0313] 本文所述核酮糖激酶能够作用于L-核酮糖和/或D-核酮糖。

[0314] 一种合适的编码核酮糖激酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567中记载的基因)。

[0315] D-核酮糖激酶(EC 2.7.1.47)

[0316] D-核酮糖激酶具有EC命名法编号2.7.1.47。

[0317] 术语核酮糖激酶指能够将D-核酮糖转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0318] 编码D-核酮糖激酶的核苷酸序列的一个例子可以自富氏葡萄孢盘菌(Botryotinia fuckeliana)获得(GenBank登录码CH476984)。GenBank登录号EDN20859详述了D-核酮糖激酶的氨基酸序列。

[0319] L-核酮糖磷酸4-差向异构酶(EC 5.1.3.4)

[0320] L-核酮糖磷酸4-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.4。L-核酮糖磷酸4-差向异构酶可称作核酮糖磷酸4-差向异构酶、磷酸核酮糖异构酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向异构酶、AraD或L-Ru5P。

[0321] 术语L-核酮糖磷酸4-差向异构酶指能够将L-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0322] 本文所述L-核酮糖磷酸4-差向异构酶能够作用于L-核酮糖5-磷酸。

[0323] 一种合适的编码L-核酮糖磷酸4-差向异构酶的核苷酸序列可以自植物乳杆菌菌株NCIMB8826(ATCC 14917)获得(NCBI登录码NC_004567中记载的基因)。

[0324] D-核糖醇4-脱氢酶(EC 1.1.1.56)

[0325] D-核糖醇4-脱氢酶具有EC命名法编号1.1.1.56。这种酶也可称作核糖醇2-脱氢酶、福寿糖醇脱氢酶或核糖醇脱氢酶。

[0326] 术语D-核糖醇4-脱氢酶指能够将核糖醇转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。

[0327] 本文所述D-核糖醇4-脱氢酶能够作用于D-核糖醇。

[0328] 一种合适的D-核糖醇4-脱氢酶和相应的基因记载于Dothie等，1985。

[0329] D-来苏糖异构酶(EC 5.3.1.15)

[0330] D-来苏糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.15。这种酶也可称作D-来苏糖酮醇异构酶。

[0331] 术语D-来苏糖异构酶指能够将D-来苏糖转变成D-木酮糖和反之亦然的酶。

[0332] 本文所述D-来苏糖异构酶能够作用于D-来苏糖。

[0333] 编码D-来苏糖/L-核糖异构酶的核苷酸序列可以自生物体不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌 株DL-28(Shimonishi 和 Izumori，1996) 或 产 气 气 杆 菌(Aerobacter aerogenes)(Anderson和Allison，1965)克隆。

[0334] 核糖异构酶(EC 5.3.1.20)

[0335] 核糖异构酶具有EC命名法编号5.3.1.20。这种酶也可称作D-核糖异构酶或D-核糖酮醇异构酶。

[0336] 术语核糖异构酶指能够将D-核糖转变成D-核酮糖和反之亦然的酶。

[0337] 本文所述核糖异构酶能够作用于D-核糖。

[0338] 已经在生物体耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(Izumori等，1975)中找到D-核糖异构酶，可以自该生物体克隆D-核糖异构酶。

[0339] 核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶(EC 5.1.3.1)

[0340] 核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶具有EC命名法编号5.1.3.1。这种酶也可称作：戊糖-5-磷酸3-差向异构酶，磷酸戊酮糖3-差向异构酶，磷酸戊酮糖差向异构酶，磷酸核酮糖差向异构酶，核酮糖-磷酸3-差向异构酶；D-核酮糖5-磷酸差向异构酶；D-核酮糖磷酸-3-差向异构酶；D-核酮糖-5-P 3-差向异构酶；D-木酮糖-5-磷酸3-差向异构酶；赤藓糖-4-磷酸异构酶；核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；和木酮糖磷酸3-差向异构酶。

[0341] 术语核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶指能够将D-核酮糖5-磷酸转变成D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0342] 适合于如本文所述使用的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的例子包括由下述各项编码的核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶：酿酒酵母RPE1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 RPE1基因的核苷酸序列；NCBI登录码NP_012414的核苷酸序列；和能在NCBI登录码NP_012414中找到的来自树干毕赤氏酵母的核酮糖-5-磷酸异构酶。

[0343] 核糖-5-磷酸异构酶(EC 5.3.1.6)

[0344] 核糖-5-磷酸异构酶具有EC命名法编号5.3.1.6。这种酶也可称作磷酸戊糖异构酶 (phosphopentoisomerase，phosphopentoseisomerase，phosphopentosisomerase)、磷酸核糖异构酶、核糖5-磷酸差向异构酶、核糖磷酸异构酶、5-磷酸核糖异构酶、或D-核糖-5-磷酸酮醇异构酶。

[0345] 术语核糖-5-磷酸异构酶指能够将D-核糖5-磷酸转变成D-核酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0346] 适合于如本文所述使用的核糖-5-磷酸异构酶的例子包括由下述各项编码的核糖-5-磷酸酮醇异构酶：酿酒酵母RKI1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 RKI1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X94335的核苷酸序列；NCBI登录码NP_014738的核苷酸序列；和能在登录号NC_009043中找到的来自树干毕赤氏酵母的核糖-5-磷酸异构酶。

[0347] 转酮醇酶(EC 2.2.1.1)

[0348] 转酮醇酶具有EC命名法编号2.2.1.1。这种酶也可称作羟乙醛转移酶。

[0349] 术语转酮醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸和反之亦然的酶。

[0350] 适合于如本文所述使用的转酮醇酶的例子包括由下述各项编码的转酮醇酶：酿酒酵母TKL1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TKL1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X73224的核苷酸序列；NCBI登录码NP_015399的核苷酸序列；和能在登录码CP000496中找到的来自树干毕赤氏酵母的转酮醇酶。

[0351] 转醛醇酶(EC 2.2.1.2)

[0352] 转醛醇酶具有EC命名法编号2.2.1.2。这种酶也可称作二羟基丙酮转移酶、二羟基丙酮合酶、甲醛转酮醇酶或甘油酮转移酶。

[0353] 术语转醛醇酶指能够将景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸转变成D-赤藓糖4-磷酸+D-果糖6-磷酸和反之亦然的酶。

[0354] 适合于如本文所述使用的转醛醇酶的例子包括由下述各项编码的转醛醇酶：酿酒酵母TAL1基因的核苷酸序列；酿酒酵母菌株D0002 TAL1基因的核苷酸序列；NCBI登录码X15953的核苷酸序列；NCBI登录码NP_013458的核苷酸序列；和能在登录码CP000502中找到的来自树干毕赤氏酵母的转醛醇酶。

[0355] 外源木糖异构酶

[0356] 在一个方面，本文所述木糖异构酶是外源木糖异构酶。

[0357] 在一个方面，编码本文所述木糖异构酶的核苷酸序列编码外源木糖异构酶。

[0358] 优选地，外源木糖异构酶衍生自常温微生物。更优选地，外源木糖异构酶衍生自常温细菌。

[0359] 如本文中使用的，术语“常温微生物”指在15℃和40℃之间的温度生长和/或茁壮成长最好的微生物。常温微生物的例子包括乳球菌属物种、糖酵母属物种(诸如酿酒酵母)、埃希氏菌属(Escherichia)物种(诸如大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli))和芽孢杆菌属(Bacillus)物种(诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。

[0360] 在一个实施方案中，外源木糖异构酶衍生自乳球菌属物种。优选地，外源木糖异构酶衍生自能够在木糖上生长的乳球菌属物种。优选地，外源木糖异构酶衍生自乳酸乳球菌。更优选地，外源木糖异构酶衍生自乳酸乳球菌乳亚种。在一个高度优选的实施方案中，外源木糖异构酶衍生自乳酸乳球菌菌株NRRL B-4449、菌株DSM 20175、菌株KF147或菌株IO-1。

[0361] 微生物乳酸乳球菌乳亚种可称作木糖乳杆菌。

[0362] 戊醛糖测定法

[0363] 溶液(诸如培养基)中戊醛糖(诸如木糖)的量可以通过如Ebert等(ASimplified，Colorimetric Micromethod for Xylose in Serum or Urine，withPhloroglucinol，1979，Clin.Chem.25，no.8，pp.1440-1443)记载的根皮酚法来比色测定。

[0364] 显色试剂由0.5g根皮酚(1，3，5-三羟基苯)、100ml冰乙酸和10ml浓HCl组成。将50μl样品添加至950μl显色试剂。将混合物加热至100℃达4分钟，并于554nm读取混合物的吸光度。依据用同一种戊醛糖作为标准品绘制的标准曲线确定样品中戊醛糖(诸如木糖)的量。这种方法也可用于测定培养基中阿拉伯糖、来苏糖和核糖的量。

[0365] 戊酮糖测定法

[0366] 溶液(诸如培养基)中戊酮糖(诸如木酮糖)的量可以通过如ZachariasDische和Ellen Borenfreund(1951；J.Biol.Chem.192(2)：583)记载的半胱氨酸-咔唑法来比色测定。

[0367] 木糖异构酶测定法

[0368] 溶液中木糖异构酶活性的量可如下测定。

[0369] 木糖变成木酮糖的转变在于20mM TRIS缓冲液pH 7.4中含有一定量的木糖异构酶、2％木糖和2mM MgCl2并于选定温度温育的溶液中测定。反应通过添加木糖来启动并通过将反应或反应样品置于冰上来终止。反应时间通常是30或60分钟，或者用于跟踪反应的样品可在不同时间点采集。使用半胱氨酸/咔唑法(Dische and Borenfreund，1951)量化所生成的木酮糖。一个木糖异构酶活性单位定义为每分钟催化1纳摩尔木糖转变成木酮糖的活性量。

[0370] 在一个高度优选的方面，经过转化的微生物具有至少0.2个木糖异构酶单位每mg微生物蛋白质的木糖异构酶活性。木糖异构酶活性的量如本文所述测定，而蛋白质含量如下所述测定。微生物预先在包含木糖的培养基中培养了96小时或不到。

[0371] 蛋白质含量

[0372] 溶液中蛋白质的量(即蛋白质含量)通过使用商品化BCA测定试剂盒(Pierce Biotechnology inc.，USA)基于双辛可宁酸(bicinchoninic acid)测定法(Smith et al，1985)来测定，使用牛血清清蛋白作为标准品。

[0373] 乙醇测定法

[0374] 溶液 (诸 如培 养 基)中 生 物 燃料 像 乙 醇的 量 可 以通 过 使 用由MegazymeInternational，Bray Business Park，Bray，Co.Wicklow，Ireland制造和销售的商品化乙醇测定法K-ETOH试剂盒来测定；或者它可以通过例如使用气相层析来测定。

[0375] 戊糖磷酸途径

[0376] 戊酮糖(诸如木酮糖)经戊糖磷酸途径被转变成乙醇。这样的一个例子显示于图4。

[0377] 涉及戊糖磷酸途径的酶的例子包括：转酮醇酶，转醛醇酶，核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶。

[0378] 在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经转化以表达或过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶。

[0379] 在一个实施方案中，依照本发明的微生物还已经用引起微生物过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列转化。例如，将启动子插入微生物的基因组，使得微生物能够过表达编码涉及戊糖磷酸途径的酶的内源核苷酸序列。

[0380] 在另一个实施方案中，微生物已经用编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列转化。例如，微生物用表达载体转化，该表达载体包含编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的核苷酸序列。

[0381] 优选地，本文所述表达载体包含一种或多种启动子，其能够过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列。此类启动子的例子包括GPD启动子、TEF启动子和ADP启动子。可用于过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列的优选启动子可以是任何控制编码涉及糖酵解和葡萄糖发酵的蛋白质的核苷酸序列表达的调节元件。

[0382] 如本文中使用的，短语“引起微生物过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列”和“能够过表达编码一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的一种或多种核苷酸序列的一种或多种启动子”中的术语“过表达”指在比较经过转化的微生物与转化前的等同微生物时，表达自零升高至某表达水平或自较低的表达水平升高至较高的表达水平(例如上调)。过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物具有升高的催化戊酮糖(诸如木酮糖5-磷酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)的能力。

[0383] 优选地，所述过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的经过转化的微生物能够以比未转化的微生物要高至少10％、15％、20％或25％的速率催化戊酮糖(诸如木酮糖5-磷酸)转变成生物燃料(诸如乙醇)。

[0384] 过表达一种或多种涉及戊糖磷酸途径的酶的微生物的例子包括：(i)经编码一种或多种转酮醇酶、转醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一种或多种表达载体转化的微生物；和(ii)经转化以上调编码一种或多种转酮醇酶、转醛醇酶、核糖-5-磷酸酮醇异构酶和核酮糖-5-磷酸3-差向异构酶的一种或多种内源核苷酸序列表达的微生物(在转化之前，所述微生物能够在指数生长期间对于给定的培养条件集表达一种或多种这些酶，但是在转化之后，所述微生物能够在指数生长期间在相同培养条件中以更高的水平表达一种或多种这些酶)。

[0385] 变体/同源物/衍生物

[0386] 本发明涵盖使用蛋白质的任何氨基酸序列的或编码此类蛋白质的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。

[0387] 特别地，本发明涵盖使用由SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20编码的氨基酸序列的变体、同源物和衍生物。

[0388] 另外，本发明涵盖使用SEQ ID No 1、SEQ ID No 10、SEQ ID No 17、SEQ ID No 12、SEQ ID No 27或SEQ ID No 28所示核苷酸序列；和编码SEQID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列的核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。

[0389] 例如，核苷酸序列(诸如SEQ ID No 1、SEQ ID No 10、SEQ ID No 17、SEQ ID No12、SEQ ID No 27或SEQ ID No 28；或编码SEQ ID No 14、SEQ IDNo 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20所示氨基酸序列的核苷酸序列)的变体、同源物或衍生物可包含多至30、21、15、9、6或3处核酸替代。

[0390] 例如，氨基酸序列(诸如SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20)的变体、同源物或衍生物可包含多至10、7、5、3、2或1处氨基酸替代。

[0391] 不希望受理论束缚，木糖异构酶中的两个氨基酸残基(即D296和D339)可涉及活性位点中二价金属离子的结合(Meng，M.et al，1993)。在一个实施方案中，D296和D339对于活性位点中二价金属离子的结合是重要的。如此，在一个实施方案中，氨基酸序列(诸如SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ IDNo 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No20)的变体、同源物或衍生物包含SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No
13、SEQID No 19和SEQ ID No 20残基296处的氨基酸天冬氨酸(D)和/或残基339处的氨基酸天冬氨酸(D)或其它合适氨基酸序列中的等同替代。

[0392] 另外，不希望受理论束缚，木糖异构酶中的氨基酸残基(组氨酸101)可涉及活性位点(Lee et al 1989)。在一个实施方案中，H101对于活性位点是重要的。如此，在一个实施方案中，氨基酸序列(诸如SEQ ID No 14、SEQID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20)的变体、同源物或衍生物包含SEQ ID No 14、SEQ ID No11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19和SEQ ID No 20残基101处的氨基酸组氨酸(H)或其它合适氨基酸序列中的等同替代。

[0393] 在一个实施方案中，氨基酸序列(诸如SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQ ID No 20)的变体、同源物或衍生物包含SEQ ID No 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No13、SEQ ID No 19和SEQ ID No 20残基
391处的氨基酸精氨酸(R)和/或残基407处的氨基酸赖氨酸(K)或其它合适氨基酸序列中的等同替代。

[0394] 在一个实施方案中，核苷酸序列(诸如SEQ ID No 1、SEQ ID No 10、SEQ ID No17、SEQ ID No 12、SEQ ID No 27或SEQ ID No 28；或编码SEQ IDNo 14、SEQ ID No 11、SEQ ID No 18、SEQ ID No 13、SEQ ID No 19或SEQID No 20所示氨基酸序列的核苷酸序列)的变体、同源物或衍生物包含沉默密码子序列变化，使得序列为表达该序列的特定宿主细胞的密码子偏爱而优化。例如，序列中的密码子选择可以基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura et al.，2000)的酵母密码子选择表而优化。

[0395] 在本文中，术语“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有特定同源性的实体。在本文中，术语“同源性”可等同同一性。

[0396] 在本发明的语境中，同源序列理解为包括与主题序列可以至少75、80、85或90％相同，优选至少95、96、97、98或99％相同，及在高度优选的实施方案中，与主题序列至少98、99或99.5％相同的氨基酸序列。通常，同源物会包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本发明的语境中优选根据序列同一性来表述同源性。

[0397] 在本发明的语境中，同源序列理解为包括与编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)可以至少75、80、85或90％相同，优选至少95、96、97、98或99％相同，及在高度优选的实施方案中，至少98、99或99.5％相同的核苷酸序列。通常，同源物会包含与主题序列相同的编码活性位点等的序列。虽然也可以根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但是在本发明的语境中优选根据序列同一性来表述同源性。

[0398] 可以通过目视，或者更通常地，借助于容易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些商品化的计算机程序能在两种或更多种序列之间计算％同一性。

[0399] 可以在连续的序列里计算％同一性，即比对一种序列与另一种序列，并且直接比较一种序列中的每个氨基酸与另一种序列中的相应氨基酸，每次一个残基。这称作“无缺口的”比对。通常，仅在相对较短数目的残基里实施此类无缺口比对。

[0400] 虽然这是非常简单而一致的方法，但是它没有考虑到例如，在其它方面相同的一对序列中，一处插入或删除会引起随后的氨基酸残基比对不成，如此在实施总体比对时潜在地导致％同源性的大大降低。因此，将大多数序列比较方法设计成产生最佳比对，其考虑到有可能的插入和删除，而不过度地对总体同源性得分进行罚分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化来实现的。

[0401] 然而，这些更加复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽可能少的缺口(反映两种所比较序列之间的更高关联性)的序列比对会比具有许多缺口的序列比对达到更高的得分。通常使用“仿射缺口代价”，其对缺口的存在处以相对较高的代价，而对缺口中的每个随后的残基处以较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然会产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序容许对缺口罚分进行修改。然而，优选在使用此类软件比较序列时使用缺省值。例如在使用GCG Wisconsin最佳拟合包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是针对缺口的-12和针对每个延伸的-4。

[0402] 因此，最大限度％同源性的计算首先要求产生考虑到缺口罚分的最佳比对。适合于实施此类比对的一种计算机程序是GCG Wisconsin最佳拟合包(Devereux et al1984Nuc.Acids Research 12p387)。能实施序列比较的其它软件的例子包括但不限th
于 BLAST 包 ( 参 见 Ausubel et al，1999Short Protocols inMolecular Biology，4 Ed-Chapter 18)、FASTA(Altschul et al，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套件。BLAST和FASTA两者都可进行离线和在线搜索(参见Ausubel et al，1999，Short Protocols in MolecularBiology，pages 7-58to 7-60)。然而，对于有些应用，优选使用GCG最佳拟合程序。一种称作BLAST 2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999177(1)：
187-8和[e-mail])。

[0403] 虽然可以根据同一性测量最终的％同源性，但是比对过程自身通常并不是基于全有或全无的成对比较。代替地，一般使用定标的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个配对比较。通常使用的此类矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的缺省矩阵。GCGWisconsin程序一般使用公共缺省值或自定义符号比较表，若提供的话(关于进一步的详情参见用户手册)。对于有些应用，优选使用GCG包的公共缺省值，或者在其它软件的情况中，使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。

[0404] 或者，可使用DNASISTM(Hitachi Software)中的多重比对特征来计算百分比同源性，其基于与CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法。

[0405] 一旦软件产生最佳比对，便有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分进行，并产生数值结果。

[0406] 序列还可以具有产生沉默变化和导致功能等同物质的氨基酸残基删除、插入或替代。可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性来进行有意的氨基酸替代，只要物质的二级(secondary)结合活性得到保留。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性首基(headgroup)、具有相似的亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。

[0407] 可以例如依照下表来进行保守的替代。第二栏中同一块中的和优选地第三栏中同一行中的氨基酸可以彼此替代：

[0408]

[0409] 本发明还涵盖可发生的同源替代(替代和替换都在本文中用于表示现有氨基酸残基用备选残基置换)，即相似替代，诸如碱性的对碱性的、酸性的对酸性的、极性的对极性的等。非同源替代也可发生，即一类残基变成另一类，或者涉及包括非天然氨基酸，诸如鸟氨酸(下文称作Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称作B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称作O)、吡啶基丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩基丙氨酸(thienylalanine)、萘基丙氨酸(naphthylalanine)和苯基甘氨酸(phenylglycine)。

[0410] 替换也可用非天然氨基酸来进行，包括：α*和α-双取代的*氨基酸，N-烃基/烷基氨基酸*，乳酸*，天然氨基酸的卤化物衍生物，诸如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物诸如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苯甲基)*。记号*用于上文讨论的目的(涉及同源或非同源替代)，用于指示衍生物的疏水性质，而#用于指示衍生物的亲水性质，#*指示两亲特征。

[0411] 变体氨基酸序列可包括合适的间隔物基团，其可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，在氨基酸间隔物诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，包括烃基/烷基，诸如甲基、乙基或丙基。另一种形式的变异涉及类肽形式的一个或多个氨基酸残基的存在，本领域技术人员会完全理解这一点。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基在残基的氮原子而非α-碳上。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ el al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biolechnol.(1995)13(4)，132-134。

[0412] 供本发明中使用的核苷酸序列可在其内包括合成的或经修饰的核苷酸。对寡核苷酸进行的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在所述分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法来修饰本文所述核苷酸序列。可以实施此类修饰以增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

[0413] 本发明还涵盖使用与本文所述序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或衍生物。如果序列与其片段互补，那么该序列可作为探针用于在其它生物体中鉴定相似的编码序列等。

[0414] 可以以许多方式来获得与本文所述序列不是100％同源的多核苷酸。可以通过例如探查DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。另外，可获得其它同源物，而且此类同源物及其片段一般会能够与本文序列表中所示序列选择性杂交。可以通过在中等至高严格性条件下用包含所附序列表中任一种序列的整个或部分的探针探查cDNA文库来获得此类序列。

[0415] 也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR会使用设计用于靶向变体和同源物内如下序列的引物，所述序列编码本文所述序列内的保守氨基酸序列。可以通过例如比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来实施序列比对。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。

[0416] 简并PCR中使用的引物会含有一个或多个简并位置，并且会在如下的严格条件使用，所述严格条件低于那些用于用针对已知序列的单一序列引物克隆序列的严格条件。

[0417] 或者，可以通过对已表征序列的定点诱变来获得此类多核苷酸。这在如下情况中可以是有用的，即例如需要沉默密码子序列变化来针对表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱。其它序列变化可能是想要的，以便引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能。

[0418] 可以使用本文所描述的多核苷酸(核苷酸序列)来生成引物，例如PCR引物，用于备选(alternative)扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规手段用显示标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆入载体中。此类引物、探针和其它片段的长度会是至少15个，优选至少20个，例如至少25个、30个或40个核苷酸，并且也包括在术语“多核苷酸”内，如本文中所使用的。

[0419] 可以以重组方式、合成方式、或者通过本领域技术人员可用的任何手段来生成本文所述多核苷酸诸如DNA多核苷酸和探针。它们也可以通过标准技术来克隆。

[0420] 一般地，会通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制备想要的核酸序列，每次一个核苷酸。用于使用自动化技术实现此制备的技术是本领域容易获得的。

[0421] 一般地，会使用重组手段例如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来生成较长的多核苷酸。引物可以设计成含有合适的限制酶识别位点，使得能将所扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。

[0422] 现在会借助实施例进一步描述本发明，实施例意图用来帮助本领域普通技术人员实施本发明而非意图以任何方式限制本发明的范围。实施例

[0423] 一般重组DNA方法学技术

[0424] 除非另外指明，本发明采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力之内。文献中解释了此类技术。参见例如J.B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolationand Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IrI Press；D.M.J.Lilleyand J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress；Sambrook J.，et al(1989)Molecular Cloning：
A Laboratory Manual，2nded.，Vol.1-3.Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel F.M.，et al(1995(and periodic supplements))Current Protocols in Molecular Biology，Vol.ch.9，13and 16.John Wiley & Sons，New York，N.Y.。通过述及将每一篇这些通用教科书收入本文。

[0425] 生物体：

[0426] 乳球菌属是一组常常遍及世界许多部分找到的革兰氏阳性细菌。这组的菌株具有安全用于乳制品发酵，用于生产例如奶酪的较长历史。这些实施例中使用了这样一种菌株，乳酸乳球菌菌株DSM 20175，其可以自保藏机构DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得。

[0427] 糖酵母属是一组常常遍及世界许多部分找到的酵母菌株。它们具有安全用于烘焙、酿造和酿酒目的的较长历史，而且是当前表征最充分的真核生物体。因此，它是分子生物学和微生物学实验室中用于实验用途的一种非常受欢迎的生物体。本文实施例中使用了菌株酿酒酵母BY4741。该菌株可以自Euroscarf(EUROpean Saccharomyces Cerevisiae ARchive for FunctionalAnalysis，即欧洲用于功能分析的酿酒酵母存档，德国)获得。

[0428] 下述实施例中使用的酿酒酵母菌株T0040、酿酒酵母菌株T0028、酿酒酵母菌株T0049和酿酒酵母菌株T0004都是自得自Euroscarf的BY4741构建的同基因变体。

[0429] 大肠杆菌是一种常常在高等动物和人类的下段肠中找到的革兰氏阴性细菌。该生物体的许多菌株具有在微生物学和分子生物学实验室中安全使用的较长历史。下述实施例中使用的菌株是常常在分子生物学实验室中用于克隆和扩增遗传材料的大肠杆菌DH5-α菌株。该菌株可以自公司InVitrogen(In Vitrogen Corporation，California，USA)获得。

[0430] 热厌氧杆菌属是一组嗜热、厌氧生长的革兰氏阳性细菌菌株。下述实施例中使用的酶的来源，两种菌株，热硫化氢热厌氧杆菌(DSM no.15750)和热产硫磺热厌氧杆菌(ATCC 33743)都最初分离自温泉，DSM no.15750在土耳其Ayas，而ATCC 33743在美国黄石国家公园。它们可以自DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得。然而，实施例中使用的编码来自这些菌株的酶的遗传材料是基于序列表中SEQ ID No 15和SEQ ID No 16所示氨基酸序列的回译而合成制备的。

[0431] 树干毕赤氏酵母是一种自昆虫幼虫的肠和铝热剂(thermites)分离的酵母物种。下述实施例中使用的基因的来源树干毕赤氏酵母菌株是菌株树干毕赤氏酵母DSM no.3651，其可以自DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得。

[0432] 假单胞菌属是一组常常在水中及在植物种子和植物组织中找到的多样的杆状、好氧革兰氏阴性细菌。在这些实施例中使用的菌株是最初自受伤的植物组织分离的丁香假单胞菌菌株DSM 50315。该菌株可以自保藏机构DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得。

[0433] 实施例1-表达木糖乳杆菌XI和树干毕赤氏酵母木酮糖激酶的酿酒酵母菌株的构建。

[0434] 实施例1a-使用基于NCBI登录码AF092042(SEQ ID No 1)的引物序列自木糖乳杆菌(乳酸乳球菌，菌株DSM 20175)TOPO克隆D-木糖异构酶基因。

[0435] 使用由SEQ ID No 2和SEQ ID No 3鉴定的引物自得自菌株DSM 20175的DNAPCR扩增完整木糖乳杆菌D-木糖异构酶基因(Lx XI)。使用SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示引物通过对乳酸乳球菌菌株DSM 20175的PCR而克隆的木糖异构酶基因的编码区显示于SEQ ID No 17。在Lx XI基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自木糖乳杆菌菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1339bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt 2LxXI。

[0436] 实施例1b-含有在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下的木糖乳杆菌木糖异构酶(LxXI)基因的质粒LxXI-2a的构建。

[0437] 用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg et al.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2LxXI(实施例1a中描述的)释放编码基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码ThXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为LxXI-2a的质粒。

[0438] 实施例1c-基于NCBI登录码AF127802自树干毕赤氏酵母菌株DSM3651TOPO克隆D-木酮糖激酶基因。

[0439] 使用由SEQ ID No 4和SEQ ID No 5鉴定的引物自得自菌株DSM3651的DNAPCR扩增完整树干毕赤氏酵母D-木酮糖激酶基因(PsXKS)。在PsXKS基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自树干毕赤氏酵母菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1891bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-BluntII-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt2P.stip XKS。

[0440] 实施例1d-含有在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下的树干毕赤氏酵母D-木酮糖激酶(PsXKS)基因的质粒PsXKS-14a的构建。

[0441] 用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P425-GPD(Mumberg et al.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2P.stip XKS(实施例1c中描述的)释放编码树干毕赤氏酵母木酮糖激酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P425-GPD和编码PsXKS的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PsXKS-14a的质粒。

[0442] 实施例1e-含有LxXI-2a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株的构建。

[0443] 将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker and Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media)(SC-Ura，Leu)(Rose et al.，1990)上进行对经所有两种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，Leu上再划线，并获得经过质粒LxXI-1a和PsXKS-14a转化的菌株T0004的一个菌落。

[0444] 实施例2-表达热硫化氢热厌氧杆菌XI和树干毕赤氏酵母木酮糖激酶的酿酒酵母菌株的构建。

[0445] 实施例2a-基于NCBI登录码D00756构建编码热硫化氢热厌氧杆菌木糖异构酶的合成木糖异构酶基因。

[0446] 由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成和装配完整热硫化氢热厌氧杆菌木糖异构酶基因(ThXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura et al.，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。通过对两条链的测序来确定ThXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的ThXI的核苷酸序列鉴定为SEQ ID No 6，其显示合成DNA序列并在核苷酸序列上面显示编码区的氨基酸翻译。包含的质粒命名为0717046pGA14。

[0447] 实施例2b-含有在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下的热硫化氢热厌氧杆菌木糖异构酶(ThXI)基因的质粒ThXI-5a的构建。

[0448] 用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg et al.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体0717046pGA14(实施例2a中描述的)释放编码热硫化氢热厌氧杆菌木糖异构酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码ThXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为ThXI-5a的质粒。

[0449] 实施例2c-含有ThXI-5a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株的构建。

[0450] 将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker and Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media)(SC-Ura，Leu)(Rose et al.，1990)上进行对经所有两种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，Leu上再划线，并获得经过质粒ThXI-5a和PsXKS-14a转化的菌株T0049的一个菌落。

[0451] 实施例3-表达热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶和树干毕赤氏酵母木酮糖激酶的酿酒酵母菌株的构建。

[0452] 实施例3a-基于NCBI登录码J05650构建编码热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶的合成木糖异构酶基因。

[0453] 由Geneart AG(Regensburg，Germany)合成和装配完整热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶基因(TsXI)。序列中的密码子选择是基于来自Kazusa密码子选择数据库(Nakamura et al.，2000)的酵母密码子选择表而优化的。在合成的构建物中在可读框的侧翼包括靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。通过对两条链的测序来确定TsXI合成基因的完整性。包括侧翼限制性位点的TsXI的核苷酸序列鉴定为SEQ ID No 7，其显示合成DNA序列并在核苷酸序列上面显示编码区的氨基酸翻译。包含的质粒命名为0717047pGA18。

[0454] 实施例3b-含有在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下的热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶(TsXI)基因的质粒TsXI-28a的构建。

[0455] 用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg et al.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体0717047pGA18(实施例3a中描述的)释放编码热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码TsXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为TsXI-28a的质粒。

[0456] 实施例3c-含有TsXI-28a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株的构建。

[0457] 将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker and Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media)(SC-Ura，Leu)(Rose et al.，1990)上进行对经所有两种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，Leu上再划线，并获得经过质粒TsXI-28a和PsXKS-14a转化的菌株T0028的一个菌落。

[0458] 实施例4-表达丁香假单胞菌XyIA(PsXI)和树干毕赤氏酵母木酮糖激酶的酿酒酵母菌株的构建。

[0459] 实施例4a-自丁香假单胞菌番茄致病变种TOPO克隆D-木糖异构酶基因(PsXI)[0460] 使用由SEQ ID No 8和SEQ ID No 9鉴定的引物自得自菌株DSM 50315的DNA PCR扩增完整丁香假单胞菌D-木糖异构酶基因(Ps XI)。在PsXI基因侧翼导入靠近ATG起始密码子的NheI限制性位点和远离终止密码子的XhoI限制性位点。作为模板，以0.2ng/μl PCR反应的浓度使用来自丁香假单胞菌菌株的DNA。使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy，Finland)实施PCR，30个循环的30秒96℃、30秒50℃、和150秒72℃，接着是最终温育10分钟72℃。通过电泳将PCR产物在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离1323bp片段。依照制造商的用法说明将DNA片段TOPO克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体(Invitrogen，USA)，并将所得质粒用于转化大肠杆菌TOP10。质粒命名为pCR-Blunt2PsXI。

[0461] 实施例4b-含有在来自酿酒酵母的GPD启动子和CYC1终止子控制下的丁香假单胞菌木糖异构酶(PsXI)基因的质粒PsXI-34a的构建。

[0462] 用SpeI和XhoI消化大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体P426-GPD(Mumberg et al.，1995)，并用碱性磷酸酶将所得末端去磷酸化。类似地，通过用NheI和XhoI消化来自载体pCR-Blunt 2PsXI(实施例4a中描述的)释放编码丁香假单胞菌木糖异构酶基因的DNA片段。通过电泳将所得线性化质粒P426-GPD和编码PsXI的DNA片段在1％低熔点琼脂糖凝胶上分开，并分离。将两个DNA片段连接到一起，产生命名为PsXI-34a的质粒。

[0463] 实施例4c-含有PsXI-34a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株的构建。

[0464] 将200ng每一种质粒组合并使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔用于转化酿酒酵母酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)。依照标准方案(Becker and Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(solid synthetic complete dropout media)(SC-Ura，Leu)(Rose et al.，1990)上进行对经所有两种质粒转化的克隆的选择。将中等大小的原代克隆在SC-Ura，Leu上再划线，并获得经过质粒PsXI-34a和PsXKS-14a转化的菌株T0040的一个菌落。

[0465] 实施例5-通过在酿酒酵母中表达四种不同细菌木糖异构酶获得的木糖异构酶比活性的测定和比较。

[0466] 将四种不同菌株(含有PsXI-34a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株T0040，含有TsXI-28a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株T0028，含有ThXl-5a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株T0049，和含有LxXI-2a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株T0004)在板上划线并在遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的固体合成完全失落培养基(SC-Ura，Leu)(Rose et al.，1990)上培养过夜。

[0467] 然后给装有10ml遗漏尿嘧啶和亮氨酸且补充有2％D-葡萄糖的合成完全失落培养基(SC-Ura，Leu)(Rose et al，1990)的50ml管接种来自划线板的菌落，调至OD600为0.1并在200rpm摇动下于30C培养18小时。通过4000rpm离心15分钟来收获培养物，通过在2ml水中重悬浮并再次旋转下来来清洗。溶解细胞，即添加300μl CelLytic Y Plus试剂盒(Sigma-Aldrich)，接着在温和摇动下于室温温育30分钟，并以16000xg离心10分钟以除去细胞碎片。分离上清液并用于测定木糖异构酶活性和蛋白质含量。木糖异构酶活性使用如Dische和Borenfreund(Dische and Borenfreund，1951)记载的半胱氨酸-咔唑法来测定。蛋白质含量通过使用商品化基于双辛可宁酸测定法的蛋白质测定法(BCA测定试剂盒)(Pierce Biotechnology inc.，USA)来测定。

[0468] 结果显示于图5。通过表达木糖乳杆菌木糖异构酶获得的最高总木糖异构酶活性每mg总酵母蛋白质比通过表达来自热硫化氢热厌氧杆菌的木糖异构酶获得的第二好的结果要高约10倍。显然木糖乳杆菌木糖异构酶远远优于其它细菌异构酶。为两种嗜热细菌获得的结果(即木糖异构酶单位/mg酵母蛋白质)与使用来自嗜热细菌的木糖异构酶获得的其它结果一致(Walfriedsson et al，1996； et al，2003)，而且木糖乳杆菌异构酶比活性等于或高于通过使用来自真菌Piromyces sp.EII(Kuyper et al，2003)的木糖异构酶获得的比活性。

[0469] 实施例6-表达LxXI-2a和PsXKS-14a的酿酒酵母菌株(菌株T0004)以木糖作为碳源的生长。

[0470] 实施例1e中描述的酿酒酵母菌株T0004包含含有SEQ ID No 15(其编码木糖异构酶)的表达盒和含有编码树干毕赤氏酵母木酮糖激酶的核苷酸序列的表达盒。

[0471] 使实施例1e中描述的菌株T0004逐渐适应在木糖上生长，即连续稀释葡萄糖含量，接着在作为唯一碳源的木糖上生长。这使用下述规程来进行：

[0472] 不含尿嘧啶和亮氨酸的合成完成生长培养基(SC-Ura，Leu培养基)的配方：6.7g/l不含氨基酸的细菌-酵母氮碱基；补充有40mg/l除亮氨酸外的所有氨基酸；且补充有40mg/l对氨基苯甲酸。

[0473] 给装有10ml含2％木糖+0.5％葡萄糖的SC-Ura，Leu培养基的第一培养管接种菌株T0004。将该管在150rpm旋转摇动下于30℃温育，直至OD600达到1.5。此培养物在本文中称作“1号培养物”。

[0474] 给装有9ml含2％木糖的SC-Ura，Leu培养基的第二培养管接种1ml上文所述“1号培养物”。将该培养管在150rpm旋转摇动下于30℃温育，直至OD600达到1.0。此培养物在本文中称作“2号培养物”。

[0475] 给装有9ml含2％木糖的SC-Ura，Leu培养基的第三培养管接种1ml上文所述“2号培养物”。将该培养管在150rpm旋转摇动下于30℃温育，直至OD600介于0.5和1.0之间。此培养物在本文中称作“3号培养物”。

[0476] 给装有50ml含2％木糖的SC-Ura，Leu培养基的250ml带挡板的摇瓶接种一定量的“3号培养物”，OD600值达到0.05。将该培养管在150rpm旋转摇动下于30℃温育，并通过贯穿240小时培养期的OD600测量来跟踪生长。

[0477] 菌株T0004以木糖作为碳源的生长可见于图6。在菌株没有其它修饰的情况中，在延滞期后，最大生长速率达到0.05/h。

[0478] 实施例7-通过乳球菌属异构酶的三种天然存在变体和两种人工变体的胞内表达在酿酒酵母细胞中展现高木糖异构酶活性。

[0479] 在酿酒酵母菌株BY4741(Euroscarf，Germany)中胞内表达具有SEQ IDNo 13、SEQ ID No 14和SEQ ID No 18所示氨基酸序列的天然存在木糖异构酶。另外，生成(如下文详述的)并也表达两种在任何生物体中没找到的相关变体。这两种变体的氨基酸序列显示于SEQ ID No 19和SEQ ID No 20。除氨基酸位置391(精氨酸或赖氨酸)、位置407(谷氨酸或赖氨酸)或位置416(酪氨酸或组氨酸)处的变异外，所有变体具有相同的氨基酸序列。这意味着在与SEQ ID No 18比较时，SEQ ID No 13具有第391位处的氨基酸K、第407位处的氨基酸K和第416位处的氨基酸H。SEQ ID No 13中的这些氨基酸在序列表中标有下划线。与SEQ ID No 18比较时，SEQ ID No 14具有第391位处的氨基酸K。SEQ ID No
14中的这个氨基酸在序列表中标有下划线。与SEQID No 18比较时，SEQ ID No 19具有第
407位处的氨基酸K和第416位处的氨基酸H。SEQ ID No 19中的这些氨基酸在序列表中标有下划线。与SEQ ID No18比较时，SEQ ID No 20具有第407位处的氨基酸K。SEQ ID No 20中的这个氨基酸在序列表中标有下划线。

[0480] 这个实施例中使用的编码氨基酸序列SEQ ID No 13、SEQ ID No 14、SEQID No 19和SEQ ID No 20的DNA序列都是通过对SEQ ID No 17所示DNA序列的定点诱变而生成的，使用如实施例1a所述获得的构建物作为初始模板。(氨基酸序列SEQ ID No 18由SEQ ID No 17编码。)定点诱变通过使用“QuickChange”试剂盒(Stratagene，La Jolla，USA)来进行，以分别改变编码氨基酸残基391、407和416的密码子。该试剂盒依照制造商的方案来使用。所使用的诱变性DNA引物的序列显示于SEQ ID No 21和SEQ ID No 22(R391K替代和消除Psp1406I限制性位点)，SEQ ID No 23和SEQ ID No 24(E407K替代和添加HindIII限制性位点)及SEQ ID No 25和SEQ ID No 26(组合E407K和Y416H替代和添加HindIII限制性位点)。限制性位点的添加或消除容许容易地鉴定经过突变的载体。所生成的DNA构建物的正确整体DNA序列随后通过DNA测序来确认。

[0481] 将大肠杆菌/酿酒酵母高拷贝穿梭载体pRS426-gpd(Mumberg et al.，1995)的一种经过修饰的形式用于木糖异构酶变体的胞内表达。载体是通过使用标准分子生物学亚克隆技术用来自载体pAG35(Euroscarf，Germany)的诺尔丝菌素抗性标志更换pRS426-gpd中的URA3标志而修饰的。所得穿梭载体将诺尔丝菌素抗性赋予酿酒酵母。

[0482] 依照实施例1b所述分离五种不同木糖异构酶基因并插入经过修饰的表达载体中。所得质粒构建物分别命名为pRS426gpd_nat::XI13、pRS426gpd_nat::XI14、pRS426gpd_nat::XI18、pRS426gpd_nat::XI19和pRS426gpd_nat::XI20。

[0483] 使用Biorad Gene Pulser II系统(Biorad，USA)依照制造商的用法说明依靠电穿孔将每一种变体质粒构建物转化入酿酒酵母BY4741菌株(Euroscarf，Germany)中。依照标准方案(Becker and Guarente，1991)将酵母细胞制成感受态。在含100mg/l诺尔丝菌素的YPD板(20g/l胰蛋白胨，10g/l酵母提取物和20g/l葡萄糖及15g/l为凝固而添加的细菌琼脂)上进行对经过转化的克隆的选择。

[0484] 获得了五种细胞系，每一种表达变体乳球菌属木糖异构酶之一。

[0485] 如实施例5所述一式两份地测定并比较每一种细胞系的木糖异构酶比活性，只是用于酵母生长的培养基是补充有100mg/l诺尔丝菌素的YPD(20g/l胰蛋白胨，10g/l酵母提取物和20g/l葡萄糖)。

[0486] 对五种菌株获得的一式两份测定的平均木糖异构酶比活性(以木糖异构酶单位/mg总的提取的酵母蛋白质来计算)显示于图7。

[0487] 所有测试的乳球菌属木糖异构酶变体在酿酒酵母中表达时高度有活性。因此，这可以被看作是对于在乳球菌属中编码活性木糖异构酶的乳球菌属木糖异构酶基因是一般性的。根据SEQ ID No 19和SEQ ID No 20的活性比较，看来Y416H替代在活性方面造成的差异很小。相反，K391R替代和E407K替代都将酵母中的比活性提高了大约15-20％，如果这两处替代像在SEQ ID No19和SEQ ID No 20中那样组合的话，该效果看来是加性的。

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[0517] 序列表

[0518] SEQ ID No.1：

[0519] 乳酸乳球菌乳亚种(木糖乳杆菌)菌株NRRL-4449木糖异构酶基因的编码区，如记载于登录号AF092042。由此核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQID No 14所示。

[0520] M A Y F N D I A P I K Y E G T K

[0521] 1 ATG GCT TAC TTT AAC GAC ATC GCA CCT ATC AAA TAC GAA GGT ACA AAA[0522] T K N M F A F R H Y N P E E V V

[0523] 49 ACT AAA AAT ATG TTT GCC TTT CGC CAT TAT AAT CCA GAA GAA GTA GTT[0524] A G K T M E E Q L H F A L A F W

[0525] 97 GCT GGT AAA ACA ATG GAA GAA CAA CTT CAT TTT GCC CTT GCA TTT TGG[0526] H T I T M D G S D P F G G A T M

[0527] 145 CAT ACA ATT ACA ATG GAT GGG TCA GAT CCC TTT GGG GGA GCA ACA ATG[0528] E R P W D L E G G S E L D R A H

[0529] 193 GAA CGC CCT TGG GAT TTG GAA GGT GGT TCT GAA CTT GAC CGT GCT CAC[0530] R R V D A F F E I A E K L G V K

[0531] 241 CGT CGA GTA GAT GCT TTC TTT GAA ATT GCT GAA AAA TTA GGT GTT AAA[0532] Y Y C F H D I D I A P T G N S L

[0533] 289 TAT TAT TGT TTC CAT GAT ATT GAT ATT GCA CCT ACT GGA AAT TCT TTG[0534] K E F Y A N L D E I T D H L L E

[0535] 337 AAA GAA TTT TAT GCT AAT TTG GAC GAA ATT ACT GAC CAC CTT CTT GAA[0536] K Q K A T G I K L L W N T A N M

[0537] 385 AAA CAA AAA GCA ACA GGG ATT AAA TTA CTT TGG AAT ACA GCA AAC ATG[0538] F S N P R Y M N G V S T S N R A

[0539] 433 TTT TCA AAT CCC CGC TAT ATG AAT GGT GTT TCA ACT TCT AAT CGT GCT[0540] E V F A Y G A A Q V K K G L E L

[0541] 481 GAA GTC TTT GCT TAT GGT GCT GCA CAA GTT AAA AAA GGT CTT GAA CTT[0542] S K K L G G E N Y V F W G G R E

[0543] 529 TCT AAA AAA CTC GGT GGT GAA AAT TAC GTC TTC TGG GGT GGT CGT GAA[0544] G Y E S L L N T D M G L E M D H

[0545] 577 GGT TAT GAA TCA CTT TTG AAT ACA GAT ATG GGT CTT GAA ATG GAT CAT[0546] M A K F F H L A I D Y A K S I N

[0547] 625 ATG GCA AAA TTC TTC CAT TTG GCA ATT GAT TAT GCA AAA TCA ATC AAC[0548] H L P I F L I E P K P K E P M T

[0549] 673 CAC TTG CCC ATT TTC TTG ATT GAA CCA AAA CCA AAA GAA CCA ATG ACT[0550] H Q Y D F D S A T A L A F L Q K

[0551] 721 CAC CAA TAT GAT TTT GAC TCA GCA ACA GCT CTT GCT TTC TTG CAA AAA[0552] Y D L D K Y F K L N L E T N H A

[0553] 769 TAT GAT TTG GAC AAA TAT TTC AAA CTC AAT CTT GAA ACA AAT CAT GCT[0554] W L A G H T F E H E L N T A R T

[0555] 817 TGG TTG GCT GGA CAC ACT TTT GAA CAC GAA TTA AAT ACT GCT CGT ACT[0556] F N A L G S I D A N Q G N Y L L

[0557] 865 TTC AAT GCT TTG GGT TCT ATT GAT GCC AAT CAA GGA AAT TAC TTG CTT[0558] G W D T D E F P T L V I D I T L

[0559] 913 GGT TGG GAT ACA GAT GAA TTC CCA ACA CTT GTT ATT GAT ATC ACA CTT[0560] A M H Q I L L N G G L G K G G I

[0561] 961 GCG ATG CAC CAA ATT CTT TTG AAC GGT GGA CTT GGC AAA GGT GGA ATT[0562] N F D A K V R R T S F K A E D L

[0563] 1009 AAC TTT GAT GCG AAA GTA CGT CGT ACA AGT TTC AAA GCA GAA GAT TTA[0564] I L A H I A G M D T Y A R A L K

[0565] 1057 ATT CTT GCT CAT ATT GCA GGG ATG GAT ACT TAT GCG CGT GCT TTG AAA[0566] G A A A I I E D K F L S D I V D

[0567] 1105 GGT GCA GCA GCA ATC ATT GAA GAT AAA TTC TTG TCT GAT ATT GTT GAC[0568] E R Y S S Y K N T E V G Q S I E

[0569] 1153 GAA CGT TAT AGT TCA TAC AAA AAT ACA GAA GTT GGT CAA TCC ATT GAA[0570] N G T A T F E S L A A F A L E Y

[0571] 1201 AAT GGA ACA GCA ACT TTT GAA AGT CTT GCC GCA TTT GCA CTT GAA TAT[0572] G D D I E L D S N H L E Y I K S

[0573] 1249 GGT GAT GAT ATT GAA CTT GAT TCT AAT CAC TTG GAA TAC ATC AAA TCA[0574] V L N D Y L V ＊

[0575] 1297 GTA TTG AAT GAC TAT CTT GTT TAA

[0576] SEQ ID No.2：

[0577] GCTAGCCATGGCTTACTTTAACGACATCGCACCTATC

[0578] SEQ ID No.3：

[0579] CTCGAGCCTAGGCTAAACAAGATAGTCATTCAATACTGATTTG

[0580] SEQ ID No.4：

[0581] GCTAGCCATGGCCACTACCCCATTTGATGCTCCAGATAAG

[0582] SEQ ID No.5：

[0583] CTCGAGCCTAGGCTAGTGTTTCAATTCACTTTCCATCTTGGCC

[0584] SEQ ID No.6：

[0585] 带N端和C端侧翼区的人工热硫化氢热厌氧杆菌木糖异构酶基因。编码区基于来自GenBank登录码D00756的氨基酸序列。由编码核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID No 15所示。

[0586] 1 GAATTCCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGAGCTAGCC

[0587] M E Y F K N V P Q I K Y E G P K

[0588] 49 ATG GAA TAT TTC AAA AAC GTG CCA CAG ATC AAG TAT GAA GGT CCT AAA[0589] S N N P Y A F K F Y N P D E I I

[0590] 97 AGC AAT AAC CCT TAT GCA TTT AAG TTC TAT AAC CCA GAT GAA ATT ATA[0591] D G K P L K E H L R F S V A Y W

[0592] 145 GAT GGA AAA CCA TTA AAA GAA CAC TTA AGA TTT AGC GTA GCC TAC TGG[0593] H T F T A N G T D P F G A P T M

[0594] 193 CAT ACA TTT ACC GCT AAC GGA ACG GAT CCA TTT GGT GCA CCG ACT ATG[0595] Q R P W D H F T D P M D I A K A

[0596] 241 CAG CGT CCT TGG GAT CAT TTT ACC GAC CCT ATG GAC ATA GCA AAA GCA[0597] R V E A A F E L F E K L D V P F

[0598] 289 CGT GTG GAA GCC GCA TTC GAG CTT TTT GAA AAA TTG GAT GTT CCA TTC[0599] F C F H D R D I A P E G E T L R

[0600] 337 TTC TGT TTT CAT GAC AGA GAT ATA GCT CCG GAA GGT GAA ACA TTG AGA[0601] E T N K N L D T I V A M I K D Y

[0602] 385 GAA ACC AAC AAA AAC TTA GAT ACT ATC GTT GCT ATG ATT AAA GAC TAC[0603] L K T S K T K V L W G T A N L F

[0604] 433 TTA AAA ACG TCA AAG ACT AAA GTT CTT TGG GGC ACT GCT AAT TTG TTT[0605] S N P R F V H G A A T S C N A D

[0606] 481 TCT AAT CCA CGT TTC GTG CAT GGC GCT GCC ACA TCA TGT AAT GCA GAC[0607] V F A Y A A A Q V K K A L E I T

[0608] 529 GTA TTT GCT TAT GCA GCC GCT CAA GTT AAA AAG GCC TTA GAG ATT ACC[0609] K E L G G Q N Y V F W G G R E G

[0610] 577 AAA GAG TTA GGA GGC CAG AAT TAT GTT TTC TGG GGT GGT CGT GAG GGA[0611] Y E T L L N T D M E L E L D N L

[0612] 625 TAT GAG ACA CTT TTA AAT ACT GAT ATG GAG TTG GAA TTA GAT AAT TTA[0613] A R F L H M A V E Y A Q E I G F

[0614] 673 GCA AGA TTC TTA CAC ATG GCA GTA GAA TAT GCT CAG GAA ATT GGT TTT[0615] E G Q F L I E P K P K E P T K H

[0616] 721 GAA GGA CAG TTC TTG ATC GAG CCT AAA CCA AAG GAA CCA ACA AAG CAT[0617] Q Y D F D A A S V H A F L K K Y

[0618] 769 CAG TAT GAT TTC GAC GCT GCT TCT GTA CAC GCC TTT TTG AAG AAG TAT[0619] D L D K Y F K L N I E A N H A T

[0620] 817 GAT TTG GAT AAA TAC TTT AAG TTG AAC ATA GAG GCT AAT CAC GCA ACG[0621] L A G H D F Q H E L R Y A R I N

[0622] 865 TTG GCA GGT CAC GAT TTT CAA CAC GAA TTG AGA TAC GCC CGT ATT AAT[0623] N M L G S I D A N M G D M L L G

[0624] 913 AAC ATG TTA GGT TCC ATA GAT GCC AAC ATG GGT GAC ATG TTG CTG GGT[0625] W D T D Q Y P T D I R M T T L A

[0626] 961 TGG GAT ACT GAT CAA TAC CCA ACG GAT ATT AGA ATG ACA ACT TTA GCA[0627] M Y E V I K M G G F N K G G L N

[0628] 1009 ATG TAC GAG GTC ATT AAA ATG GGA GGT TTT AAC AAA GGA GGT TTG AAT[0629] F D A K V R R A S F E P E D L F

[0630] 1057 TTC GAT GCT AAA GTG CGT CGT GCC TCT TTT GAA CCT GAA GAC CTT TTT[0631] L G H I A G M D A F A K G F K V

[0632] 1105 CTT GGA CAT ATT GCC GGA ATG GAT GCA TTT GCA AAA GGT TTC AAG GTC[0633] A Y K L V K D G V F D R F I E E

[0634] 1153 GCT TAT AAG CTT GTT AAG GAT GGT GTA TTT GAT AGA TTC ATT GAA GAG[0635] R Y K S Y R E G I G A E I V S G

[0636] 1201 AGA TAC AAA TCC TAT CGT GAA GGT ATA GGT GCT GAA ATC GTT TCA GGT[0637] K A N F K T L E E Y A L N N P K

[0638] 1249 AAG GCC AAT TTT AAG ACT TTA GAG GAA TAT GCA TTG AAT AAC CCA AAA[0639] I E N K S G K Q E L L E S I L N

[0640] 1297 ATC GAA AAC AAA AGC GGT AAA CAG GAA CTG CTG GAA TCT ATT TTG AAT[0641] Q Y L F S E ＊

[0642] 1345 CAA TAT TTG TTC TCT GAA TAG CCTAGGCTCGAGGAATTC

[0643] SEQ ID No.7：

[0644] 带N端和C端侧翼区的人工热产硫磺热厌氧杆菌木糖异构酶基因。编码区基于来自GenBank登录码J05650的氨基酸序列，只是第二个氨基酸从N变成A以能够使用“Kozak共有序列”来进行真核表达。热产硫磺假丝酵母(C.thermosulfurogenes)是热产硫磺热厌氧杆菌的另一个名称(Lee et al 1993)。由此核苷酸序列的编码区编码的氨基酸序列如SEQ ID No 16所示。

[0645] 1 GAATTCCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGGAGCTAGCC

[0646] M A K Y F E N V S K I K Y E G P

[0647] 49 ATG GCC AAG TAT TTT GAG AAT GTT TCC AAG ATT AAG TAT GAA GGT CCT[0648] K S N N P Y S F K F Y N P E E V

[0649] 97 AAG TCA AAC AAC CCT TAC TCC TTC AAA TTC TAT AAT CCA GAA GAA GTT[0650] I D G K T M E E H L R F S I A Y

[0651] 145 ATA GAC GGT AAA ACG ATG GAG GAA CAC TTA AGA TTT TCT ATT GCT TAC[0652] W H T F T A D G T D Q F G K A T

[0653] 193 TGG CAC ACA TTT ACT GCC GAC GGC ACA GAC CAA TTC GGA AAG GCT ACT[0654] M Q R P W N H Y T D P M D I A K

[0655] 241 ATG CAA AGA CCG TGG AAC CAT TAC ACT GAT CCA ATG GAC ATA GCC AAA[0656] A R V E A A F E F F D K I N A P

[0657] 289 GCC AGA GTG GAG GCT GCA TTC GAG TTC TTC GAT AAG ATA AAC GCC CCT[0658] Y F C F H D R D I A P E G D T L

[0659] 337 TAC TTC TGC TTC CAT GAT CGT GAC ATT GCT CCG GAA GGC GAT ACC TTG[0660] R E T N K N L D T I V A M I K D

[0661] 385 AGA GAA ACC AAC AAA AAT CTT GAC ACC ATT GTC GCA ATG ATA AAA GAT[0662] Y L K T S K T K V L W G T A N L

[0663] 433 TAT TTG AAG ACG TCT AAA ACC AAA GTT TTG TGG GGT ACG GCA AAC TTA[0664] F S N P R F V H G A S T S C N A

[0665] 481 TTT TCT AAT CCG AGA TTT GTT CAT GGT GCT TCC ACA TCC TGC AAC GCA[0666] D V F A Y S A A Q V K K A L E I

[0667] 529 GAT GTC TTT GCT TAT TCC GCT GCT CAA GTC AAA AAG GCT CTT GAG ATA[0668] T K E L G G E N Y V F W G G R E

[0669] 577 ACC AAA GAA TTA GGT GGT GAA AAC TAC GTT TTC TGG GGT GGC AGA GAA[0670] G Y E T L L N T D M E F E L D N

[0671] 625 GGT TAT GAG ACT CTT TTA AAT ACA GAT ATG GAA TTT GAA CTT GAC AAT[0672] F A R F L H M A V D Y A K E I G

[0673] 673 TTC GCA AGA TTC TTG CAC ATG GCT GTC GAT TAT GCC AAG GAG ATA GGT[0674] F E G Q F L I E P K P K E P T K

[0675] 721 TTT GAA GGC CAG TTC TTG ATT GAA CCG AAA CCA AAG GAA CCT ACC AAA[0676] H Q Y D F D V A N V L A F L R K

[0677] 769 CAT CAG TAT GAC TTT GAT GTC GCA AAT GTT TTG GCT TTC TTG AGA AAA[0678] Y D L D K Y F K V N I E A N H A

[0679] 817 TAC GAT TTA GAT AAG TAT TTC AAA GTA AAT ATT GAA GCT AAT CAT GCA[0680] T L A F H D F Q H E L R Y A R I

[0681] 865 ACG TTG GCC TTC CAT GAT TTC CAG CAC GAG TTG AGA TAC GCT AGA ATC[0682] N G V L G S I D A N T G D M L L

[0683] 913 AAT GGA GTC TTA GGA TCT ATC GAT GCT AAT ACC GGT GAT ATG CTG CTG[0684] G W D T D Q F P T D I R M T T L

[0685] 961 GGA TGG GAT ACT GAT CAA TTT CCG ACC GAT ATT CGT ATG ACT ACC CTG[0686] A M Y E V I K M G G F D K G G L

[0687] 1009 GCA ATG TAT GAA GTT ATT AAG ATG GGT GGA TTT GAT AAA GGC GGT CTG[0688] N F D A K V R R A S F E P E D L

[0689] 1057 AAC TTC GAT GCA AAA GTA AGA AGA GCT TCT TTT GAA CCT GAA GAT TTG[0690] F L G H I A G M D A F A K G F K

[0691] 1105 TTT TTA GGA CAC ATC GCT GGC ATG GAC GCA TTT GCT AAA GGT TTT AAG[0692] V A Y K L V K D R V F D K F I E

[0693] 1153 GTA GCC TAT AAG CTT GTA AAA GAT AGA GTG TTC GAC AAA TTC ATC GAA[0694] E R Y A S Y K D G I G A D I V S

[0695] 1201 GAG AGA TAT GCT TCT TAT AAG GAC GGA ATA GGA GCC GAT ATA GTT TCC[0696] G K A D F R S L E K Y A L E R S

[0697] 1249 GGT AAG GCC GAT TTC AGA TCT CTT GAG AAA TAC GCC TTG GAA AGA TCA[0698] Q I V N K S G R Q E L L E S I L

[0699] 1297 CAA ATC GTG AAC AAA TCA GGC CGT CAA GAA TTG TTA GAA TCA ATT CTT[0700] N Q Y L F A E ＊

[0701] 1345 AAT CAA TAC CTG TTC GCT GAA TAG CCTAGGCTCGAGGAATTC

[0702] SEQ ID No.8：

[0703] TAGCTAGCATGTCGTACTTCCCCACTGTCGAC

[0704] SEQ ID No.9：

[0705] ATAAGCTTTCAGGTGTAGATAAAGCGGTTGACC

[0706] SEQ ID No.10：

[0707] 乳酸乳球菌乳亚种菌株KF147木糖异构酶基因。基于GenBank登录号EU255918。由此核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID No 11所示。

[0708] 1 atg gct tac ttt aac gac atc gca cct atc aaa tac gaa ggt aca aaa[0709] 49 act aaa aat atg ttt gcc ttt cgt cat tat aat cca gaa gaa gta gtt[0710] 97 gct ggt aaa aca atg gaa gaa caa ctt cat ttt gcc ctt gca ttt tgg[0711] 145 cat aca att acg atg gat ggg tca gat ccc ttt ggg gga gca aca atg[0712] 193 gaa cgt cct tgg gat ttg gaa ggt ggt tct gaa ctt gac cgt gct cac[0713] 241 cgt cga gta gat gct ttc ttt gaa att gct gaa aaa tta ggt gtt aaa[0714] 289 tat tat tgt ttc cat gat att gat att gca cct act gga aat tct ttg[0715] 337 aaa gaa ttt tat gct aat ttg gac gaa att act gac cac ctt ctt gaa[0716] 385 aaa caa aaa gca aca ggc att aaa tta ctt tgg aat aca gca aac atg[0717] 433 ttt tca aat ccc cgc tat atg aat ggt gtt tca act tct aat cgt gct[0718] 481 gaa gtc ttt gct tat ggt gct gca caa gtt aaa aaa ggt ctt gaa ctt[0719] 529 tct aaa aaa ctc ggt ggt gaa aat tat gtc ttc tgg ggt ggt cgt gaa[0720] 577 ggt tat gaa tca ctt ttg aat aca gat atg ggt ctt gaa atg gat cat[0721] 625 atg gca aaa ttc ttc cat ttg gca att gat tat gca aaa tca atc aac[0722] 673 cac ttg cct att ttc ttg att gaa cca aaa cca aaa gaa cca atg act[0723] 721 cac caa tat gat ttt gac tca gca aca gct ctt gct ttc ttg caa aaa[0724] 769 tat gac ttg gac aaa tac ttc aaa ctc aat ctt gaa aca aat cat gct[0725] 817 tgg ttg gct ggg cac act ttt gaa cac gaa tta aat act gca cgt act[0726] 865 ttc aat gct ttg ggt tct att gat gcc aat caa gga aat tac ttg ctt[0727] 913 ggt tgg gat aca gat gaa ttc cca aca ctt gtt att gat atc aca ctt[0728] 961 gcg atg cac caa att ctt ttg aac ggt gga ctt ggc aaa ggt gga att[0729] 1009 aac ttt gat gcg aaa gta cgt cgt aca agt ttc aaa gca gaa gat tta[0730] 1057 att ctt gct cat att gca ggg atg gat act tat gcg cgt gct ttg aaa[0731] 1105 ggt gca gca gca atc att gaa gat aaa ttc ttg tct gat att gtt gac[0732] 1153 gaa cgt tat agt tca tac aaa aat aca gaa gtt ggt caa tcc att gaa[0733] 1201 aat gga aca gca act ttt gaa agt ctt gct gca ttt gca ctt gaa cat[0734] 1249 ggt gac gat att gaa ctt gat tct aat cac ttg gaa tac atc aaa tca[0735] 1297 gta ttg aat gac tat ctt gtt taa

[0736] SEQ ID No.11：

[0737] 乳酸乳球菌乳亚种菌株KF147木糖异构酶基因。基于GenBank登录号ABX75758。由核苷酸序列SEQ ID No 10编码的氨基酸序列。

[0738] MAYFNDIAPIKYEGTKTKNMFAFRHYNPEEVVAGKTMEEQLHFALAFWHTITMDGSDPFGGATMERPWDLEGGSELDRAHRRVDAFFEIAEKLGVKYYCFHDIDIAPTGNSLKEFYANLDEITDHLLEKQKATGIKLLWNTANMFSNPRYMNGVSTSNRAEVFAYGAAQVKKGLELSKKLGGENYVFWGGREGYESLLNTDMGLEMDHMAKFFHLAIDYAKSINHLPIFLIEPKPKEPMTHQYDFDSATALAFLQKYDLDKYFKLNLETNHAWLAGHTFEHELNTARTFNALGSIDANQGNYLLGWDTDEFPTLVIDITLAMHQILLNGGLGKGGINFDAKVRRTSFKAEDLILAHIAGMDTYARALKGAAAIIEDKFLSDIVDERYSSYKNTEVGQSIENGTATFESLAAFALEHGDDIELDSNHLEYIKSVLNDYLV

[0739] SEQ ID No 12：

[0740] 乳酸乳球菌乳亚种菌株IO-1木糖异构酶基因。基于GenBank登录号AF092041。由此核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID No 13所示。

[0741] 1 atg gct tac ttt aac gac atc gca cct atc aaa tac gaa ggt aca aaa[0742] 49 act aaa aat atg ttt gcc ttt cgc cat tat aat cca gaa gaa gta gtt[0743] 97 gct ggt aaa aca atg gaa gaa caa ctt cat ttt gcc ctt gca ttt tgg[0744] 145 cat aca att aca atg gat ggg tca gac ccc ttt ggg gga gca aca atg[0745] 193 gaa cgt cct tgg gat ttg gaa ggt ggt tct gaa ctt gac cgt gct cac[0746] 241 cgt cga gta gat gct ttc ttt gaa att gct gaa aaa tta ggt gtt aaa[0747] 289 tat tat tgt ttc cat gat att gat att gca cct act gga aat tct ttg[0748] 337 aaa gaa ttt tat gct aat ttg gac gaa att act gac cac ctt ctt gaa[0749] 385 aaa caa aaa gca aca ggg att aaa tta ctt tgg aat aca gca aac atg[0750] 433 ttt tca aat ccc cgc tat atg aat ggt gtt tca act tct aac cgt gct[0751] 481 gaa gtc ttt gct tat ggt gct gca caa gtt aaa aaa ggt ctt gaa ctt[0752] 529 tct aaa aaa ctc ggt ggt gaa aat tac gtc ttc tgg ggt ggt cgt gaa[0753] 577 ggt tat gaa tca ctt ttg aat aca gat atg ggt ctt gaa atg gat cat[0754] 625 atg gca aaa ttc ttc cat ttg gca att gat tat gca aaa tca atc aac[0755] 673 cac ttg ccc att ttc ttg atc gaa cca aaa cca aaa gaa cca atg act[0756] 721 cac caa tat gat ttt gac tca gca aca gct ctt gct ttc ttg caa aaa[0757] 769 tat gat ttg gac aaa tat ttc aaa ctc aat ctt gaa aca aat cat gct[0758] 817 tgg ttg gct gga cac act ttt gaa cac gaa tta aat act gct cgt act[0759] 865 ttc aat gct ttg ggt tct att gat gcc aat caa gga aat tac ttg ctt[0760] 913 ggt tgg gat aca gat gaa ttc cca aca ctt gtt att gat atc aca ctt[0761] 961 gcg atg cac caa att ctt ttg aac ggt gga ctt ggc aaa ggt gga att[0762] 1009 aac ttt gat gcg aaa gta cgt cgt aca agt ttc aaa gca gaa gat tta[0763] 1057 att ctt gct cat att gca ggg atg gat act tat gcg cgt gct ttg aaa[0764] 1105 ggt gca gca gca atc att gaa gat aaa ttc ttg tct gat att gtt gac[0765] 1153 gaa cgt tat agt tca tac aaa aat aca gaa gtt gga caa tcc att gaa[0766] 1201 aat gga aca gca act ttt aaa agt ctt gcc gca ttt gca ctt gaa cat[0767] 1249 ggt gac gat att gaa ctt gat tct aat cac ttg gaa tac atc aaa tca[0768] 1297 gta ttg aat gac tat ctt gtt taa

[0769] SEQ ID No 13：

[0770] 乳酸乳球菌乳亚种菌株IO-1木糖异构酶。基于GenBank登录号AAD20249。由核苷酸序列SEQ ID No 12编码的氨基酸序列。与SEQ ID No 18不同的氨基酸标有下划线。

[0771] MAYFNDIAPIKYEGTKTKNMFAFRHYNPEEVVAGKTMEEQLHFALAFWHTITMDGSDPFGGATMERPWDLEGGSELDRAHRRVDAFFEIAEKLGVKYYCFHDIDIAPTGNSLKEFYANLDEITDHLLEKQKATGIKLLWNTANMFSNPRYMNGVSTSNRAEVFAYGAAQVKKGLELSKKLGGENYVFWGGREGYESLLNTDMGLEMDHMAKFFHLAIDYAKSINHLPIFLIEPKPKEPMTHQYDFDSATALAFLQKYDLDKYFKLNLETNHAWLAGHTFEHELNTARTFNALGSIDANQGNYLLGWDTDEFPTLVIDITLAMHQILLNGGLGKGGINFDAKVRRTSFKAEDLILAHIAGMDTYARALKGAAAIIEDKFLSDIVDERYSSYKNTEVGQSIENGTATFKSLAAFALEHGDDIELDSNHLEYIKSVLNDYLV

[0772] SEQ ID No 14：

[0773] 由核苷酸序列SEQ ID No 1编码的氨基酸序列。与SEQ ID No 18不同的氨基酸标有下划线。

[0774] M A Y F N D I A P I K Y E G T K[0775] T K N M F A F R H Y N P E E V V[0776] A G K T M E E Q L H F A L A F W[0777] H T I T M D G S D P F G G A T M[0778] E R P W D L E G G S E L D R A H[0779] R R V D A F F E I A E K L G V K[0780] Y Y C F H D I D I A P T G N S L[0781] K E F Y A N L D E I T D H L L E[0782] K Q K A T G I K L L W N T A N M[0783] F S N P R Y M N G V S T S N R A[0784] E V F A Y G A A Q V K K G L E L[0785] S K K L G G E N Y V F W G G R E[0786] G Y E S L L N T D M G L E M D H[0787] M A K F F H L A I D Y A K S I N[0788] H L P I F L I E P K P K E P M T[0789] H Q Y D F D S A T A L A F L Q K[0790] Y D L D K Y F K L N L E T N H A[0791] W L A G H T F E H E L N T A R T[0792] F N A L G S I D A N Q G N Y L L[0793] G W D T D E F P T L V I D I T L[0794] A M H Q I L L N G G L G K G G I[0795] N F D A K V R R T S F K A E D L[0796] I L A H I A G M D T Y A R A L K[0797] G A A A I I E D K F L S D I V D[0798] E R Y S S Y K N T E V G Q S I E[0799] N G T A T F E S L A A F A L E Y[0800] G D D I E L D S N H L E Y I K S[0801] V L N D Y L V

[0802] SEQ ID No 15：

[0803] GenBank登录号BAA00652。由核苷酸序列SEQ ID No 6的编码区编码的氨基酸序列。

[0804] M E Y F K N V P Q I K Y E G P K[0805] S N N P Y A F K F Y N P D E I I[0806] D G K P L K E H L R F S V A Y W[0807] H T F T A N G T D P F G A P T M[0808] Q R P W D H F T D P M D I A K A[0809] R V E A A F E L F E K L D V P F[0810] F C F H D R D I A P E G E T L R[0811] E T N K N L D T I V A M I K D Y[0812] L K T S K T K V L W G T A N L F[0813] S N P R F V H G A A T S C N A D[0814] V F A Y A A A Q V K K A L E I T[0815] K E L G G Q N Y V F W G G R E G[0816] Y E T L L N T D M E L E L D N L[0817] A R F L H M A V E Y A Q E I G F[0818] E G Q F L I E P K P K E P T K H[0819] Q Y D F D A A S V H A F L K K Y[0820] D L D K Y F K L N I E A N H A T[0821] L A G H D F Q H E L R Y A R I N[0822] N M L G S I D A N M G D M L L G[0823] W D T D Q Y P T D I R M T T L A[0824] M Y E V I K M G G F N K G G L N[0825] F D A K V R R A S F E P E D L F[0826] L G H I A G M D A F A K G F K V[0827] A Y K L V K D G V F D R F I E E[0828] R Y K S Y R E G I G A E I V S G[0829] K A N F K T L E E Y A L N N P K[0830] I E N K S G K Q E L L E S I L N[0831] Q Y L F S E

[0832] SEQ ID No 16：

[0833] GenBank登录号AAA23285。由核苷酸序列SEQ ID No 7的编码区编码的氨基酸序列。

[0834] M A K Y F E N V S K I K Y E G P[0835] K S N N P Y S F K F Y N P E E V[0836] I D G K T M E E H L R F S I A Y[0837] W H T F T A D G T D Q F G K A T[0838] M Q R P W N H Y T D P M D I A K[0839] A R V E A A F E F F D K I N A P[0840] Y F C F H D R D I A P E G D T L[0841] R E T N K N L D T I V A M I K D[0842] Y L K T S K T K V L W G T A N L[0843] F S N P R F V H G A S T S C N A[0844] D V F A Y S A A Q V K K A L E I[0845] T K E L G G E N Y V F W G G R E[0846] G Y E T L L N T D M E F E L D N[0847] F A R F L H M A V D Y A K E I G[0848] F E G Q F L I E P K P K E P T K[0849] H Q Y D F D V A N V L A F L R K[0850] Y D L D K Y F K V N I E A N H A[0851] T L A F H D F Q H E L R Y A R I[0852] N G V L G S I D A N T G D M L L[0853] G W D T D Q F P T D I R M T T L[0854] A M Y E V I K M G G F D K G G L[0855] N F D A K V R R A S F E P E D L[0856] F L G H I A G M D A F A K G F K[0857] V A Y K L V K D R V F D K F I E[0858] E R Y A S Y K D G I G A D I V S[0859] G K A D F R S L E K Y A L E R S[0860] Q I V N K S G R Q E L L E S I L[0861] N Q Y L F A E

[0862] SEQ ID No 17：

[0863] 使用SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示引物通过PCR自称作DSM 20175的乳酸乳球菌菌株克隆的木糖异构酶基因的编码区。

[0864] 1 atg gct tac ttt aac gac atc gca cct atc aaa tac gaa ggt aca aaa[0865] 49 act aaa aat atg ttt gcc ttt cgc cat tat aat cca gaa gaa gta gtt[0866] 97 gct ggt aaa aca atg gaa gaa caa ctt cat ttt gcc ctt gca ttt tgg[0867] 145 cat aca att aca atg gat ggg tca gat ccc ttt ggg gga gca aca atg[0868] 193 gaa cgc cct tgg gat ttg gaa ggt ggt tct gaa ctt gac cgt gct cac[0869] 241 cgt cga gta gat gct ttc ttt gaa att gct gaa aaa tta ggt gtt aaa[0870] 289 tat tat tgt ttc cat gat att gat att gca cct act gga aat tct ttg[0871] 337 aaa gaa ttt tat gct aat ttg gac gaa att act gac cac ctt ctt gaa[0872] 385 aaa caa aaa gca aca ggg att aaa tta ctt tgg aat aca gca aac atg[0873] 433 ttt tca aat ccc cgc tat atg aat ggt gtt tca act tct aat cgt gct[0874] 481 gaa gtc ttt gct tat ggt gct gca caa gtt aaa aaa ggt ctt gaa ctt[0875] 529 tct aaa aaa ctc ggt ggt gaa aat tac gtc ttc tgg ggt ggt cgt gaa[0876] 577 ggt tat gaa tca ctt ttg aat aca gat atg ggt ctt gaa atg gat cat[0877] 625 atg gca aaa ttc ttc cat ttg gca att gat tat gca aaa tca atc aac[0878] 673 cac ttg ccc att ttc ttg att gaa cca aaa cca aaa gaa cca atg act[0879] 721 cac caa tat gat ttt gac tca gca aca gct ctt gct ttc ttg caa aaa[0880] 769 tat gat ttg gac aaa tat ttc aaa ctc aat ctt gaa aca aat cat gct[0881] 817 tgg ttg gct gga cac act ttt gaa cac gaa tta aat act gct cgt act[0882] 865 ttc aat gct ttg ggt tct att gat gcc aat caa gga aat tac ttg ctt[0883] 913 ggt tgg gat aca gat gaa ttc cca aca ctt gtt att gat atc aca ctt[0884] 961 gcg atg cac caa att ctt ttg aac ggt gga ctt ggc aaa ggt gga att[0885] 1009 aac ttt gat gcg aaa gta cgt cgt aca agt ttc aaa gca gaa gat tta[0886] 1057 att ctt gct cat att gca ggg atg gat act tat gcg cgt gct ttg aaa[0887] 1105 ggt gca gca gca atc att gaa gat aaa ttc ttg tct gat att gtt gac[0888] 1153 gaa cgt tat agt tca tac aga aat aca gaa gtt ggt caa tcc att gaa[0889] 1201 aat gga aca gca act ttt gaa agt ctt gcc gca ttt gca ctt gaa tat[0890] 1249 ggt gat gat att gaa ctt gat tct aat cac ttg gaa tac atc aaa tca[0891] 1297 gta ttg aat gac tat ctt gtt taa

[0892] SEQ ID No 18：

[0893] 由SEQ ID No 17编码的氨基酸序列。

[0894] MAYFNDIAPIKYEGTKTKNMFAFRHYNPEEVVAGKTMEEQLHFALAFWHTITMDGSDPFGGATMERPWDLEGGSELDRAHRRVDAFFEIAEKLGVKYYCFHDIDIAPTGNSLKEFYANLDEITDHLLEKQKATGIKLLWNTANMFSNPRYMNGVSTSNRAEVFAYGAAQVKKGLELSKKLGGENYVFWGGREGYESLLNTDMGLEMDHMAKFFHLAIDYAKSINHLPIFLIEPKPKEPMTHQYDFDSATALAFLQKYDLDKYFKLNLETNHAWLAGHTFEHELNTARTFNALGSIDANQGNYLLGWDTDEFPTLVIDITLAMHQILLNGGLGKGGINFDAKVRRTSFKAEDLILAHIAGMDTYARALKGAAAIIEDKFL SDIVDERYS SYRNTEVGQSIENGTATFESLAAFALEYGDDIELDSNHLEYIKSVLNDYLV

[0895] SEQ ID No 19：

[0896] 乳球菌属木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID No 18)的人工变体。与SEQ IDNo 18不同的氨基酸标有下划线。编码此氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.27所示。

[0897] MAYFNDIAPIKYEGTKTKNMFAFRHYNPEEVVAGKTMEEQLHFALAFWHTITMDGSDPFGGATMERPWDLEGGSELDRAHRRVDAFFEIAEKLGVKYYCFHDIDIAPTGNSLKEFYANLDEITDHLLEKQKATGIKLLWNTANMFSNPRYMNGVSTSNRAEVFAYGAAQVKKGLELSKKLGGENYVFWGGREGYESLLNTDMGLEMDHMAKFFHLAIDYAKSINHLPIFLIEPKPKEPMTHQYDFDSATALAFLQKYDLDKYFKLNLETNHAWLAGHTFEHELNTARTFNALGSIDANQGNYLLGWDTDEFPTLVIDITLAMHQILLNGGLGKGGINFDAKVRRTSFKAEDLILAHIAGMDTYARALKGAAAIIEDKFLSDIVDERYSSYRNTEVGQSIENGTATFKSLAAFALEHGDDIELDSNHLEYIKSVLNDYLV

[0898] SEQ ID No 20：

[0899] 乳球菌属木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID No 18)的人工变体。与SEQ IDNo 18不同的氨基酸标有下划线。编码此氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.28所示。

[0900] MAYFNDIAPIKYEGTKTKNMFAFRHYNPEEVVAGKTMEEQLHFALAFWHTITMDGSDPFGGATMERPWDLEGGSELDRAHRRVDAFFEIAEKLGVKYYCFHDIDIAPTGNSLKEFYANLDEITDHLLEKQKATGIKLLWNTANMFSNPRYMNGVSTSNRAEVFAYGAAQVKKGLELSKKLGGENYVFWGGREGYESLLNTDMGLEMDHMAKFFHLAIDYAKSINHLPIFLIEPKPKEPMTHQYDFDSATALAFLQKYDLDKYFKLNLETNHAWLAGHTFEHELNTARTFNALGSIDANQGNYLLGWDTDEFPTLVIDITLAMHQILLNGGLGKGGINFDAKVRRTSFKAEDLILAHIAGMDTYARALKGAAAIIEDKFLSDIVDERYSSYRNTEVGQSIENGTATFKSLAAFALEYGDDIELDSNHLEYIKSVLNDYLV

[0901] SEQ ID No 21：

[0902] R391K有义引物：

[0903] GTTGACGAACGATATAGTTCATACAAAAATACAGAAGTTGG

[0904] SEQ ID No 22：

[0905] R391K反义引物：

[0906] CCAACTTCTGTATTTTTGTATGAACTATATCGTTCGTCAAC

[0907] SEQ ID No 23：

[0908] E407K有义引物：

[0909] ACAGCAACTTTTAAAAGCTTAGCCGCATTTGCACTTGAATATGGTGATGATATTG

[0910] SEQ ID No 24：

[0911] E407K反义引物：

[0912] CAATATCATCACCATATTCAAGTGCAAATGCGGCTAAGCTTTTAAAAGTTGCTGT

[0913] SEQ ID No 25：

[0914] E407K-Y416H有义引物：

[0915] ACAGCAACTTTTAAAAGCTTAGCCGCATTTGCACTTGAACATGGTGATGATATTG

[0916] SEQ ID No 26：

[0917] E407K-Y416H反义引物：

[0918] CAATATCATCACCATGTTCAAGTGCAAATGCGGCTAAGCTTTTAAAAGTTGCTGT

[0919] SEQ ID No 27：

[0920] 编码SEQ ID No.19所示氨基酸序列的核苷酸序列

[0921] 1 atg gct tac ttt aac gac atc gca cct atc aaa tac gaa ggt aca aaa[0922] 49 act aaa aat atg ttt gcc ttt cgc cat tat aat cca gaa gaa gta gtt[0923] 97 gct ggt aaa aca atg gaa gaa caa ctt cat ttt gcc ctt gca ttt tgg[0924] 145 cat aca att aca atg gat ggg tca gat ccc ttt ggg gga gca aca atg[0925] 193 gaa cgc cct tgg gat ttg gaa ggt ggt tct gaa ctt gac cgt gct cac[0926] 241 cgt cga gta gat gct ttc ttt gaa att gct gaa aaa tta ggt gtt aaa[0927] 289 tat tat tgt ttc cat gat att gat att gca cct act gga aat tct ttg[0928] 337 aaa gaa ttt tat gct aat ttg gac gaa att act gac cac ctt ctt gaa[0929] 385 aaa caa aaa gca aca ggg att aaa tta ctt tgg aat aca gca aac atg[0930] 433 ttt tca aat ccc cgc tat atg aat ggt gtt tca act tct aat cgt gct[0931] 481 gaa gtc ttt gct tat ggt gct gca caa gtt aaa aaa ggt ctt gaa ctt[0932] 529 tct aaa aaa ctc ggt ggt gaa aat tac gtc ttc tgg ggt ggt cgt gaa[0933] 577 ggt tat gaa tca ctt ttg aat aca gat atg ggt ctt gaa atg gat cat[0934] 625 atg gca aaa ttc ttc cat ttg gca att gat tat gca aaa tca atc aac[0935] 673 cac ttg ccc att ttc ttg att gaa cca aaa cca aaa gaa cca atg act[0936] 721 cac caa tat gat ttt gac tca gca aca gct ctt gct ttc ttg caa aaa[0937] 769 tat gat ttg gac aaa tat ttc aaa ctc aat ctt gaa aca aat cat gct[0938] 817 tgg ttg gct gga cac act ttt gaa cac gaa tta aat act gct cgt act[0939] 865 ttc aat gct ttg ggt tct att gat gcc aat caa gga aat tac ttg ctt[0940] 913 ggt tgg gat aca gat gaa ttc cca aca ctt gtt att gat atc aca ctt[0941] 961 gcg atg cac caa att ctt ttg aac ggt gga ctt ggc aaa ggt gga att[0942] 1009 aac ttt gat gcg aaa gta cgt cgt aca agt ttc aaa gca gaa gat tta[0943] 1057 att ctt gct cat att gca ggg atg gat act tat gcg cgt gct ttg aaa[0944] 1105 ggt gca gca gca atc att gaa gat aaa ttc ttg tct gat att gtt gac[0945] 1153 gaa cgt tat agt tca tac aga aat aca gaa gtt ggt caa tcc att gaa[0946] 1201 aat gga aca gca act ttt aaa agc tta gcc gca ttt gca ctt gaa cat[0947] 1249 ggt gat gat att gaa ctt gat tct aat cac ttg gaa tac atc aaa tca[0948] 1297 gta ttg aat gac tat ctt gtt taa

[0949] SEQ ID No 28：

[0950] 编码SEQ ID No.20所示氨基酸序列的核苷酸序列

[0951] 1 atg gct tac ttt aac gac atc gca cct atc aaa tac gaa ggt aca aaa[0952] 49 act aaa aat atg ttt gcc ttt cgc cat tat aat cca gaa gaa gta gtt[0953] 97 gct ggt aaa aca atg gaa gaa caa ctt cat ttt gcc ctt gca ttt tgg[0954] 145 cat aca att aca atg gat ggg tca gat ccc ttt ggg gga gca aca atg[0955] 193 gaa cgc cct tgg gat ttg gaa ggt ggt tct gaa ctt gac cgt gct cac[0956] 241 cgt cga gta gat gct ttc ttt gaa att gct gaa aaa tta ggt gtt aaa[0957] 289 tat tat tgt ttc cat gat att gat att gca cct act gga aat tct ttg[0958] 337 aaa gaa ttt tat gct aat ttg gac gaa att act gac cac ctt ctt gaa[0959] 385 aaa caa aaa gca aca ggg att aaa tta ctt tgg aat aca gca aac atg[0960] 433 ttt tca aat ccc cgc tat atg aat ggt gtt tca act tct aat cgt gct[0961] 481 gaa gtc ttt gct tat ggt gct gca caa gtt aaa aaa ggt ctt gaa ctt[0962] 529 tct aaa aaa ctc ggt ggt gaa aat tac gtc ttc tgg ggt ggt cgt gaa[0963] 577 ggt tat gaa tca ctt ttg aat aca gat atg ggt ctt gaa atg gat cat[0964] 625 atg gca aaa ttc ttc cat ttg gca att gat tat gca aaa tca atc aac[0965] 673 cac ttg ccc att ttc ttg att gaa cca aaa cca aaa gaa cca atg act[0966] 721 cac caa tat gat ttt gac tca gca aca gct ctt gct ttc ttg caa aaa[0967] 769 tat gat ttg gac aaa tat ttc aaa ctc aat ctt gaa aca aat cat gct[0968] 817 tgg ttg gct gga cac act ttt gaa cac gaa tta aat act gct cgt act[0969] 865 ttc aat gct ttg ggt tct att gat gcc aat caa gga aat tac ttg ctt[0970] 913 ggt tgg gat aca gat gaa ttc cca aca ctt gtt att gat atc aca ctt[0971] 961 gcg atg cac caa att ctt ttg aac ggt gga ctt ggc aaa ggt gga att[0972] 1009 aac ttt gat gcg aaa gta cgt cgt aca agt ttc aaa gca gaa gat tta[0973] 1057 att ctt gct cat att gca ggg atg gat act tat gcg cgt gct ttg aaa[0974] 1105 ggt gca gca gca atc att gaa gat aaa ttc ttg tct gat att gtt gac[0975] 1153 gaa cgt tat agt tca tac aga aat aca gaa gtt ggt caa tcc att gaa[0976] 1201 aat gga aca gca act ttt aaa agc tta gcc gca ttt gca ctt gaa tat[0977] 1249 ggt gat gat att gaa ctt gat tct aat cac ttg gaa tac atc aaa tca[0978] 1297 gta ttg aat gac tat ctt gtt taa