一种新型紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种含有两亲性聚氨基酸的新型紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法。该注射液含有紫杉醇、两亲性聚氨基酸、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、电位调节剂、抗氧剂、金属螯合剂、等渗调节剂及注射用水。所述两亲性聚氨基酸是由亲水链段与消旋聚疏水氨基酸组成的嵌段共聚物。本发明呈现出与传统脂质微球制剂不同的微观结构，从而具有比传统脂质微球制剂更优异的稳定性，制剂中不含聚氧乙烯蓖麻油，不大量使用VE，不引入有机溶剂，能耐受热压灭菌并且该制剂无刺激性、毒性小、稳定性好、成本低，适用于工业化大生产。

权利要求

1.一种含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，其成分按重量百分比计为：紫杉醇 0.03%~1.2%注射用油 2%~50%两亲性聚氨基酸 0.05%~1%乳化剂 1%~6%辅助乳化剂 0.2%~10%抗氧剂 0%~0.5%电位调节剂 0%~1%等渗调节剂 0.1%~10%金属螯合剂 0.001%~2%其余为注射用水；

所述的两亲性聚氨基酸为PEG5000-消旋聚亮氨酸3000嵌段共聚物；所述的乳化剂选自天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种；所述的辅助乳化剂选自泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物；

所述紫杉醇脂质微球注射液的制备方法包括如下步骤：(1)将处方量紫杉醇和乳化剂在60～80℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇，加入处方量注射用油与电位调节剂，60～80℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用；

(2)将处方量的两亲性氨基酸、辅助乳化剂、等渗调节剂、抗氧剂和金属螯合剂加入适量注射用水在60～80℃的条件下加热搅拌至全部溶解作为水相；

(3)利用组织捣碎机，缓慢将水相加入油相或将油相加入水相中，以每分钟10,000～-1 -1

20,000转搅拌3～5分钟，即得初乳，将初乳冷却，以0.1mol·L 氢氧化钠或0.1mol·L盐酸溶液调节pH值至4-7，用注射用水定容至全量；

(4)将初乳转移至高压乳匀机中，在600～1200bar，30℃～60℃条件下匀化3～10次；

(5)装瓶，充氮气，压盖密封，115℃下灭菌30min或121℃灭菌10min， 冷水浴迅速降温即得。

2.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其中所述注射用油选自红花油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油三酯、薏芢油、鸦胆子油或其混合物。

3.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其中所述的抗氧剂为L-半胱氨酸、抗坏血酸、dl-α-生育酚、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和无水亚硫酸氢钠中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其特征在于所述等渗调节剂为甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖或其混合物。

5.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其特征在于所述金属螯合剂为依地酸二钠，依地酸钠钙或其混合物。

6.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其特征在于所述的电位调节剂为油酸。

7.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其成分按重量百分比计为：紫杉醇 0.03%~0.12%注射用油 10%~30%两亲性聚氨基酸 0.1%~0.5%乳化剂 2%~5%辅助乳化剂 0.5%~6%抗氧剂 0%~0.5%电位调节剂 0%~0.1%等渗调节剂 2%~5%

金属螯合剂 0.001%~0.1%其余为注射用水。

8.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其特征在于该注射液的重量百分比为：紫杉醇, 0.06%注射用油:中链脂肪酸甘油三酯, 2%~20%两亲性聚氨基酸:聚乙二醇5000-消旋聚亮氨酸3000, 0.1%~0.5%乳化剂:大豆卵磷脂, 3%辅助乳化剂:泊洛沙姆188 , 0.20%辅助乳化剂：Tween-80, 0.20%电位调节剂：油酸, 0.05%等渗调节剂：甘油, 2.50%金属螯合剂：依地酸二钠, 0.02%其余为注射用水。

9.根据权利要求1所述的紫杉醇脂质微球注射液，其制备方法包括如下步骤：：(1)将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇，加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用；

(2)将处方量聚乙二醇5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌5分钟，制得初乳，将初乳-1 -1冷却，以0.1mol·L 氢氧化钠或0.1mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3，用注射用水定容至全量；

(4)将初乳转移至高压乳匀机中，30℃～60℃条件下，以800bar压力均质10次；

(5)装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

说明书

一种新型紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法，更具体的说是涉及一种含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法，属医药技术领域。

背景技术

[0002] 紫杉醇是从紫杉(红豆杉)的树皮中提取的一种抗癌药，对晚期卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、食管癌、生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、膀胱癌均有一定疗效。联合其它常用抗肿瘤药物，疗效可进一步提高。由于紫杉醇具有稳定细胞微管的独特作用机理，而且治疗效果好、广谱性强、副作用小，被国际上公认为首选的抗癌药物。但紫杉醇水溶性极差，目前临床用制剂，如Taxol [美国Bristol-Myers-Squibb(BMS) 公司]、Anzatax(澳大利亚Faulding 公司)以及国产的紫素、泰素等均为紫杉醇的聚氧乙烯蓖麻油(Cremphor -1EL)-无水乙醇( V :V = 50:50)溶液，临用稀释至0.3～1.2 g·L 静脉注射。但是，处方中的Cremphor EL及乙醇会引起体内组织胺释放，给药后数分钟，即造成部分病人出现药物性皮疹、呼吸急促、支气管痉挛、低血压等超敏反应，尽管目前临床上普遍通过预用激素等抗组胺类药的方法脱敏，但仍然仅能部分预防，且用药过程非常不便，需全程谨慎监测；此外注射液中的Cremphor EL与聚氯乙烯塑料管和输液袋接触可浸提出大量的塑化剂邻苯二甲酸二乙基乙酯，引起毒性；并且该制剂被稀释后极不稳定，放置超过24h，就会析出颗粒性沉淀，给临床使用带来很大危险（Panchagnula R, Pharmaceutical aspects of paclitaxel. Int J Pharm, 1998, 172: 1–15； Singla A K, Garg A, Aggarwal D. Paclitaxel and its formulations. Int J Pharm, 2002, 235: 179–192.）。另外，紫杉醇注射液还能引起中性粒细胞减少，骨髓抑制及室性心律不齐，关节痛/肌肉痛、心脏毒性、神经系统毒性及胃肠道反应（施斌, 裴元英. 紫杉醇及其制剂研究进展. 中国临床药学杂志, 2004, 13(6): 389-392.）。这些都严重限制了现有紫杉醇注射液的临床应用。所以，临床亟须安全、稳定、高效的新型紫杉醇制剂。

[0003] 基于上述原因，近十余年来，国内外药剂工作者开展了广泛深入的研究，开发了大量紫杉醇新型制剂。如环糊精包合物（CN1931368 含有环糊精紫杉醇包合物的药物组合物及其制备方法）、脂质体（CN101011357 一种紫杉醇脂质体制剂的制备方法）、聚合物纳米粒（CN101884618A 一种长循环紫杉醇纳米粒及其制备方法）等，这些新型制剂虽然从一定程度上改善了现有制剂的不足，但均存在各自的缺陷，如：环糊精本身存在极高的肾毒性；脂质体制剂包封率低、易泄漏、稳定性差；聚合物纳米粒载药量低、突释现象明显、有机溶剂不易除尽等。这些难以克服的缺陷严重阻碍了上述新型制剂的产业化发展和实际临床应用。

[0004] 随着研究的深入，以脂肪乳剂为水难溶性药物载体的新型药物制剂受到制剂领域越来越多的关注。通常所说的脂肪乳剂是指以脂肪酸甘油酯作为分散相，以卵磷脂为乳化剂的水包油型（oil in water，o/w）亚微乳剂。脂肪乳剂的特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物，特别是抗癌药物、麻醉药物及抗炎药物的良好载体。常采用的方法是将药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，由于该结构亦类似于微球，因此脂质微球（Lipid Microsphere，LM）的名称也应运而生。一般所说的脂质微球是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，平均粒径在200nm左右，LM的结构示意图见附图1。

[0005] LM具有许多物理化学及生物学上的优点：①是脂溶性药物的良好载体。临床不少药物水溶性差，必须依靠有机溶剂才能做成注射液，而有机溶剂不仅本身有毒性、刺激性，还可能干扰药物效果。②可有效增加药物的稳定性。含药脂质微球中，有相当一部分药物分布在油相或油水界面膜中，避免了直接与水接触。对于易水解或对pH变化敏感的药物，这种“隔离”起到了增加稳定性的作用。③可降低药物的刺激性。LM中药物被包裹于油相或界面膜中，避免了与体液的直接接触，因而降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。④LM中的药物在体内由油相中缓慢释放，可避免药物在注射用时由于初期浓度过高而引起的不良反应。⑤粒径在200 nm左右的小微粒能被机体的网状内皮系统的吞噬细胞所吞噬而滞留在网状内皮系统（如肝脏、肺等）中，具有靶向性，这种特点对于抗肿瘤药物提高药效、降低毒副作用尤为重要。

[0006] 正是由于上述特殊优点，近年来针对紫杉醇脂质微球制剂的开发非常活跃。如：陈卫等人（CN 101433533A 一种紫杉醇或多烯紫杉醇的静脉注射乳剂）、陈建明等人（CN
1634021A 一种新的静脉注射用紫杉醇乳剂及其制备方法）等。但是，由于紫杉醇是一种油-1 -1
水均难溶解的药物(水中溶解度约0.03 g·L ，油中溶解度约0.25 g·L )，使用上述传统的直接制备脂质微球的方法，载药量会受到极大限制，无法满足临床治疗要求，而由此导致的制剂稳定性问题也难以克服。

[0007] 为有效提高紫杉醇载药量及制剂稳定性，国内李时海等人（CN101204373A 紫杉醇脂质微球注射液及其制备方法）使用dl-α-生育酚为油相，制备了紫杉醇的脂质微球注射液（紫杉醇在α-生育酚中溶解度可达200mg/g）；国外Constantinides等人（Constantinides P P, Lambert K J, Tustian A K, Schneider B, Lalji S, Ma W W, Wentzel B, Kessler D, Worah D, Quay S C. Formulation development and antitumour activity of a filter-sterilizable emulsion of paclitaxel. Pharm Res, 2000, 17:175–182； Constantinides P P, Tustian A, Kessler D R. Tocol emulsions for drug solubilization and parenteral delivery. Adv Drug Deliv Rev, 2004, 56: 1243–
1255； Lambert K J, Constantinides P P, Quay S C. Emulsion vehicle for poorly soluble drugs. US Patent, 2002, 6458373.）所在的美国Sonus Pharmaceuticals公司也研制出了以dl-α-生育酚为油相的载药量高、稳定性好的紫杉醇维生素E型静脉注射乳剂(TOCOSOL®)。2005 年 1 月，美国FDA批准该紫杉醇乳剂用于非表皮尿路癌的治疗。由于维生素E被报道与化疗药物合用有减轻化疗不良反应的优势，该制剂被一致看好，也是Sonus公司的领军产品。2007 年下半年结束的该制剂III期临床试验结果没有达到预期的设想。III期临床试验结果显示TOCOSOL®对肿瘤的客观反应率(ORR)为37%，而紫杉醇注射液Taxol®的ORR为45% (P = 0.085)；并且，嗜中性白血球减少症的发生率是TOCOSOL®组显著高于Taxol®组；TOCOSOL®组也没有因为含有维生素E，就像预想的那样对化疗造成的周围神经病变具有保护作用。这样的临床试验结果不能符合美国新药上市的要求，Sonus公司已于 2007 年 9月宣布停止TOCOSOL®的临床试验（http://ir.sonuspharma.com/releases.cfm. Phase 3 Pivotal Trial of TOCOSOL Paclitaxel Does Not Meet Primary Endpoint®. Sep 24, 2007.）。此外，张洪瑶等人（张洪瑶. 紫杉醇注射液的研究. 沈阳药科大学硕士学位论文，2005）对紫杉醇维生素E型静脉注射乳剂进行了豚鼠急性毒性试验，试验结果表明：该制剂具有导致豚鼠死亡的毒性反应，且推测原因是dl-α-生育酚(VE)带来的。

[0008] 因此，大量使用维生素 E 以提高紫杉醇在油相中的溶解度，从而制备具有高载药量及良好稳定性的紫杉醇脂质微球制剂也是不可行的。

[0009] 刘玉玲等人（CN 101396346 紫杉醇脂质复合物； 10.CN 101396343 以紫杉醇脂质复合物为中间载体的亚微乳）运用将脂质复合物作为中间载体制备紫杉醇亚微乳的方法在避免大量使用维生素E的情况下，一定程度提高了药物的载药量（0.5～1mg/ml）。此专利在国内已公开（CN 011396346A；CN 011396343A）。但是，运用该方法制备紫杉醇亚微乳注射液存在一些缺陷：1.在紫杉醇脂质复合物的复合过程需要用丙酮，四氢呋喃等毒性较大的有机试剂，因此，微量的有机溶剂残留就会给健康带来巨大的隐患。2.脂质复合物在除去有机溶剂后的转移过程中，容易损失，使药物定量不准确。3.该方法制得的紫杉醇亚微乳注射液不能经受热压灭菌，不得不使用冷冻干燥法制成冻干制剂。这不仅提高了成本，而且复溶后药物的物理化学稳定性不易控制。4.该方法制得的制剂在常温（25℃）放置仅6个月，有关物质从0.9%升至3.3%，这远超过现有的紫杉醇注射液新药转正标准（WS1－(X－025)-2001Z）对紫杉醇有关物质的限量（2.5%）。虽然冷藏储存一定程度抑制了紫杉醇有关物质的增长，但是在6个月的冷藏储存中，有关物质增长幅度依旧很大（0.9-1.9%）。

[0010] 因此，现有技术均不能很好的解决紫杉醇脂质微球制剂载药量有限、稳定性差、难以耐受热压灭菌等诸多问题。这一方面是由于紫杉醇本身在油水两相中溶解度均有限，导致制剂稳定性差；另一方面，是由于以小分子磷脂为乳化剂的脂质微球制剂是一种由油水两相组成的热力学不稳定体系，灭菌和贮存过程中易发生破乳、聚集、合并和沉积等现象，最终导致油水分层或药物沉降。

发明内容

[0011] 基于此，本发明从两方面着手，制备了同时具备高载药量以及优良稳定性能的紫杉醇脂质微球制剂：一方面，预先将紫杉醇与磷脂直接在油性介质中复合制备紫杉醇磷脂复合物；另一方面，引入含消旋肽链的两亲性聚氨基酸，作为助乳化剂，从而大幅提高所制备乳剂的稳定性能。

[0012] 由于氨基酸本身即为人体必需的营养成分，所以加入的两亲性聚氨基酸，具有优良的生物相容性，对人体无毒害。与小分子磷脂相比，这种两亲性聚合物具有更强的乳化能力（临界胶束浓度远小于磷脂分子），与天然磷脂等其他表面活性剂复配更容易形成稳定的乳滴。而且，以此种两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的微观结构也不同于普通的脂质微球制剂：疏水的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能牢牢锚定于油相中；而亲水链段又要远长于磷脂分子的极性头部，故亲水链段能伸展于外周水相中，包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止了各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性，其结构示意图见附图2、图3。我们在实际研究中也证实了普通脂质微球和含有两亲性聚氨基酸的脂质微球在结构上的这种差异，两者的透射电镜照片分别见附图4和附图5。

[0013] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种不含聚氧乙烯蓖麻油，不大量使用VE，不引入有机溶剂，能耐受热压灭菌的紫杉醇脂质微球注射液。该制剂无刺激性、毒性小、稳定性好、成本低、适用于工业化大生产。

[0014] 本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。

[0015] 一种含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，该注射液含有紫杉醇、两亲性聚氨基酸、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、电位调节剂、抗氧剂、金属螯合剂、等渗调节剂及注射用水。

[0016] 本发明所述的两亲性聚氨基酸由亲水链段和疏水链段组成，其中所述疏水链段为消旋化的聚氨基酸链，选自亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸苄酯等疏水氨基酸单体组成的消旋化均聚物链，分子量1000～5000Da；所述亲水链段选自聚乙二醇、带正电的聚谷氨酸、带负电的聚赖氨酸等生物相容性聚合物，分子量2000～10000Da。

[0017] 优选的，所述疏水链段选自消旋聚亮氨酸；所述亲水链段选自聚乙二醇链(PEG)。

[0018] 更优选的，所述两亲性聚氨基酸为PEG5000-消旋聚亮氨酸3000嵌段共聚物。

[0019] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液，所述的乳化剂选自天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种；其中所述天然磷脂为大豆卵磷脂、大豆磷脂；所述合成磷脂为磷脂酰甘油酯或二硬脂酰磷脂酰胆碱。

[0020] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液，所述注射用油选自红花油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油三酯、薏芢油、鸦胆子油或其混合物。

[0021] 本发明所述的以两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液，所述的辅助乳化剂为泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物。

[0022] 本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，所述的抗氧剂为L-半胱氨酸、抗坏血酸、dl-α-生育酚、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和无水亚硫酸氢钠中的一种或几种的混合物。

[0023] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，所述的电位调节剂为油酸。

[0024] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，所述等渗调节剂为甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖或其混合物。

[0025] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的紫杉醇脂质微球注射液，所述金属螯合剂为依地酸二钠，依地酸钠钙或其混合物。

[0026] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液，该注射液的重量百分比优选为：

[0027]

[0028] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液，该注射液的重量百分比更优为：

[0029]

[0030] 本发明优选的一个实施例中，所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液，该注射液的重量百分比为：

[0031]

[0032] 一种制备本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液的方法，包括如下步骤：

[0033] （1）将处方量紫杉醇和乳化剂在60～80℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量注射用油与电位调节剂，60～80℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0034] （2）将处方量的两亲性氨基酸、辅助乳化剂、等渗调节剂、抗氧剂和金属螯合剂加入适量注射用水在60～80℃的条件下加热搅拌至全部溶解作为水相。

[0035] （3）利用组织捣碎机，缓慢将水相加入油相或将油相加入水相中，以每分钟10，-1000～20，000转搅拌3～5分钟，即得初乳。将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或-1
0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至4-7左右，用注射用水定容至全量。

[0036] （4）将初乳转移至高压乳匀机中，在600～1200bar， 30℃～60℃条件下匀化3～10次.

[0037] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，115℃下灭菌30min或121℃灭菌10min。冷水浴迅速降温即得。

[0038] 优选的，本发明所述的制备方法，包含以下步骤：

[0039] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0040] （2）将处方量聚乙二醇5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0041] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0042] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0043] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0044] 本发明所述的含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液中紫杉醇在油水两相的界面膜中分布为20～80％，其余部分紫杉醇分布于水相及油相中。

[0045] 本发明所述的的脂质微球注射液中两亲性聚氨基酸分子包绕在乳滴周围，药物分布于油水两相界面，从而大大提高了制剂的物理和化学稳定性，相比于传统脂质微球制剂，其不易析出和氧化，避免了灭菌及储存过程中稳定性不好、有关物质超标，及用药过程易产生二次污染和析出药物等多种问题。本发明所述含有两亲性聚氨基酸的脂质微球注射液含有两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液中不含VE即可使紫杉醇脂质微球注射液的有关物质控制在较小的范围内（<2%）。本发明所制备的含有紫杉醇脂质微球注射液在121℃高压蒸汽灭菌10min后，物理、化学稳定性均良好，样品经6个月 加速（25℃）及长期（4℃）试验，各项物理、化学稳定性指标均未发生显著改变。说明本品具有较传统脂质微球制剂更为优良的稳定性。大鼠静脉注射低剂量（3mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图6、大鼠静脉注射中剂量（6mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图7、大鼠静脉注射高剂量（12mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图8、大鼠静脉注射低，中，高三个剂量紫杉醇脂质微球注射液后血药浓度-时间曲线(n=6) 见图9 。

附图说明

[0046] 图1 传统脂质微球结构示意图 1为水相 2为油相 3为磷脂分子

[0047] 图2 以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球结构示意图 2-1为水相 2-2为油相 2-3为磷脂分子 4为两亲性聚氨基酸分子

[0048] 图3 为两亲性聚氨基酸分子结构示意图 5为亲水链段 6为疏水链段[0049] 图4 普通脂质微球的透射电镜照片

[0050] 图5 含两亲性聚氨基酸的脂质微球透射电镜照片

[0051] 图6 大鼠静脉注射低剂量（3mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）1为紫杉醇脂质微球注射液 2为紫杉醇溶液型注射液

[0052] 图7 大鼠静脉注射中剂量（6mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）1为紫杉醇脂质微球注射液 2为紫杉醇溶液型注射液

[0053] 图8 大鼠静脉注射高剂量（12mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）1为紫杉醇脂质微球注射液 2为紫杉醇溶液型注射液

[0054] 图9 大鼠静脉注射低，中，高三个剂量紫杉醇脂质微球注射液后血药浓度-时间曲线(n=6) 1为高剂量（12mg/kg） 2为中剂量（6mg/kg） 3为低剂量（3mg/kg）。

具体实施方式

[0055] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，实例仅为提供解释性说明，不意味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。

[0056] 下述实施例中制备的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂具有与传统脂质微球制剂不同的微观结构：传统脂质微球制剂以小分子磷脂为乳化剂，具有以脂肪油为软基质而被磷脂分子组成的单层膜包裹的球状微观结构，示意图见图1，其中1为水相 2为油相 3为磷脂分子。由于这种结构由油水两相组成，属于热力学不稳定体系，因此灭菌和贮存过程中易发生破乳、聚集、合并和沉积等现象，并最终导致油水分层或药物沉降；而本发明实施例中制备得到的以两亲性聚氨基酸分子为稳定剂的脂质微球制剂，其结构示意图见图2、图3。在两亲性聚氨基酸分子4中，疏水链段6的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能插入并牢牢锚定于油相2-2中，而亲水链段5又要远长于磷脂分子
2-3的极性头部，故能伸展于外周水相2-1中，并包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性。传统脂质微球制剂与以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的透射电镜照片分别见附图4和附图5。

[0057] 大鼠静脉注射低剂量（3mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图6，1为紫杉醇脂质微球注射液 ， 2为紫杉醇溶液型注射液。

[0058] 大鼠静脉注射中剂量（6mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图7，1为紫杉醇脂质微球注射液 ， 2为紫杉醇溶液型注射液。

[0059] 大鼠静脉注射高剂量（12mg/kg）紫杉醇两种制剂后的血药浓度—时间曲线（n=6）见图8，1为紫杉醇脂质微球注射液 ，2为紫杉醇溶液型注射液。

[0060] 大鼠静脉注射低，中，高三个剂量紫杉醇脂质微球注射液后血药浓度-时间曲线(n=6) 见图9 ，1为高剂量（12mg/kg） ， 2为中剂量（6mg/kg） ，3为低剂量（3mg/kg）。

[0061] 实施例1 制备含有两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液

[0062] 【处方1】 规格：30mg/50ml

[0063] 紫杉醇 0.06%

[0064] 中链甘油三酯（MCT） 15%

[0065] PEG5000-消旋聚亮氨酸3000 0.1%

[0066] 大豆卵磷脂 3%

[0067] 吐温80 0.1%

[0068] 泊洛沙姆188 0.3%

[0069] 甘油 2.5%

[0070] 依地酸二钠 0.02%

[0071] 注射用水加至 100%

[0072] 制备方法：

[0073] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0074] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0075] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0076] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0077] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0078] 【处方2】 同处方1 规格：30mg/50ml

[0079] 制备方法：

[0080] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在60℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，60℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0081] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 60℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0082] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0083] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0084] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0085] 【处方3】 规格：60mg/50ml

[0086] 紫杉醇 0.12%

[0087] PEG2000-消旋聚亮氨酸1000 0.2%

[0088] 中链甘油三酯（MCT） 15%

[0089] 大豆卵磷脂 3%

[0090] 吐温80 0.1%

[0091] 泊洛沙姆188 0.3%

[0092] 甘油 2.5%

[0093] 依地酸二钠 0.02%

[0094] 注射用水加至 100%

[0095] 制备方法：

[0096] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在60℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，60℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0097] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 60℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0098] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0099] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0100] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0101] 【处方4】 同处方3 规格：60mg/50ml

[0102] 制备方法：

[0103] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在80℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，80℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0104] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 80℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0105] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0106] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0107] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0108] 【处方5】规格：30mg/50ml

[0109] 紫杉醇 0.06 %

[0110] 中链甘油三酯（MCT） 10%

[0111] PEG5000-消旋聚苯丙氨酸2000 0.1%

[0112] 大豆磷脂 2%

[0113] 吐温80 0.1%

[0114] 泊洛沙姆188 0.3%

[0115] 油酸 0.05%

[0116] 甘油 2.5%

[0117] 依地酸二钠 0.02%

[0118] 注射用水加至 100%

[0119] 制备方法：

[0120] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在60℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，60℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0121] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 60℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0122] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0123] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0124] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0125] 【处方6】规格：15mg/50ml

[0126] 紫杉醇 0.03%

[0127] 中链甘油三酯（MCT） 5%

[0128] PEG5000-消旋聚谷氨酸苄酯2000 0.05%

[0129] 大豆油（LCT） 5%

[0130] 大豆卵磷脂 1.5%

[0131] 聚山梨酯-80 0.2%

[0132] 泊洛沙姆188 0.2%

[0133] 甘油 2.5%

[0134] 依地酸二钠 0.01%

[0135] 注射用水加至 100%

[0136] 制备方法：

[0137] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0138] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0139] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0140] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质8次；

[0141] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0142] 【处方7】规格：60mg/50ml

[0143] 紫杉醇 0.12%

[0144] 大豆油（LCT） 30%

[0145] 聚谷氨酸4000-消旋聚亮氨酸1000 0.3%

[0146] 蛋黄卵磷脂 5%

[0147] 聚山梨酯-80 0.5%

[0148] 泊洛沙姆188 0.4%

[0149] 油酸 0.1%

[0150] 甘油 2.5%

[0151] 依地酸二钠 0.05%

[0152] 注射用水加至 100%

[0153] 制备方法：

[0154] （1）将处方量紫杉醇和蛋黄卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0155] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0156] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0157] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0158] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，115℃高压蒸汽旋转灭菌30min，冷水浴迅速降温即得。

[0159] 【处方8】规格：30mg/50ml

[0160] 紫杉醇 0.06%

[0161] 中链甘油三酯（MCT） 15%

[0162] 聚谷氨酸4000-消旋聚苯丙氨酸1000 0.15%

[0163] 大豆卵磷脂 2%

[0164] 油酸 0.05%

[0165] 聚山梨酯-80 0.2%

[0166] 泊洛沙姆188 0.3%

[0167] 甘油 2.5%

[0168] 依地酸二钠 0.02%

[0169] 注射用水加至 100%

[0170] 制备方法：

[0171] （1）将处方量紫杉醇和大豆卵磷脂在60℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，60℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0172] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 60℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0173] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0174] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0175] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0176] 【处方9】规格：30mg/50ml

[0177] 紫杉醇 0.06%

[0178] 中链甘油三酯（MCT） 10%

[0179] 聚赖氨酸4000-消旋聚苯丙氨酸1000 0.15%

[0180] 蛋黄卵磷脂 2%

[0181] 油酸 0.1%

[0182] 聚山梨酯-80 0.2%

[0183] 泊洛沙姆188 0.2%

[0184] 甘油 2.5%

[0185] 依地酸二钠 0.02%

[0186] 注射用水加至 100%

[0187] 制备方法：

[0188] （1）将处方量紫杉醇和蛋黄卵磷脂在75℃加热搅拌下，溶解在无水乙醇后，挥干无水乙醇。加入处方量中链油脂肪酸三酯与油酸，75℃加热搅拌，氮气流下继续挥干乙醇，得到澄清的含药油相备用。

[0189] （2）将处方量PEG5000-消旋聚亮氨酸3000、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中， 75℃加热搅拌至完全溶解，制得水相；

[0190] （3）在高速组织捣碎机搅拌下，将油相加入至水相，继续搅拌约5分钟，制得初乳。-1 -1
将出初乳冷却，以0.1 mol·L 氢氧化钠或0.1 mol·L 盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量。

[0191] （4）将初乳转移至高压均质机中，30℃～60℃条件下，以800 bar压力均质10次；

[0192] （5）装瓶，充氮气，压盖密封，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

[0193] 【处方10】 规格：60mg/50ml

[0194] 紫杉醇 0.12%

[0195] 中链甘油三酯（MCT） 25%

[0196] 聚赖氨酸4000-消旋聚亮氨酸1000 0.15%

[0197] 大豆磷脂 4%

[0198] 油酸 0.05%

[0199] 聚山梨酯-80 0.5%

[0200] 泊洛沙姆188 0.5%

[0201] 甘油 2.5%

[0202] 依地酸二钠 0.02%

[0203] 注射用水加至 100%

[0204] 制备方法：同制备方法9

[0205] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

[0206] 实施例2

[0207] 含有两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液处方（处方4）

[0208] 6个月加速与长期稳定性考察

[0209] 由于本品是热力学不稳定体系，属于对热敏感的剂型。按照中国药典2005版原料药与药物制剂稳定性试验指导原则的说明：对热敏感的药物加速试验在25±2℃条件下放置6个月；在6±2℃条件下放置12个月，考察物理化学稳定性的变化，目前本实验进行了6个月，给出6个月考察的结果。

[0210] 表1 25±2℃加速6个月试验结果

[0211]

[0212] 表2 6±2℃长期留样试验结果

[0213]

[0214] 经6个月加速试验各质量指标均在合格范围之内。长期留样6个月试验结果亦显示各项指标均合格且保持稳定。

[0215] 实施例3

[0216] 本发明紫杉醇脂质微球注射液大鼠血浆药代动力学研究

[0217] 给药方案：

[0218] 36只大鼠随机分成6组，每组6只，实验前禁食一夜。分别于右后股静脉注射市售紫杉醇注射液与本发明所述含有两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液，分组及给药情况如下表：

[0219]

[0220] 分别于给药前（0时），5 min，15 min，30 min，60 min，90min，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h眼眶取血0.3 mL，置预先肝素化的1.5 mL尖底离心试管中，4000 rpm离心15 min，精密吸取上层血浆100μL，置另一干净尖底离心试管中，冰箱中冷冻保存，测定前加入25.4 μg·mL-1内标溶液20 μL，涡旋3 min混匀，然后加叔丁基甲醚2.5mL，涡旋1min后震荡
10min，4 000 r·min-1离心10 min，取上层（有机层）液2mL置塑料离心试管中，40℃氮气吹干。残余物加1ml甲醇涡旋溶解，涡旋震荡5 min，14000 r/min离心10 min，取上清液5ul进样测定，以当日的标准曲线计算各时间点样品中紫杉醇的浓度。

[0221] 实验结果：

[0222] 实验动物各时间点血药浓度的平均值与时间的关系见图5-图8。

[0223] 用DAS软件统计的结果表明，紫杉醇低，中，高不同剂量两种制剂在大鼠体内的药动学过程符合三隔室模型(权重1/C2)。血药浓度数据采用统计矩计算，用统计矩分析药物的体内过程属于一种非隔室的分析方法，它不需对药物设定专门的隔室。采用梯形法计算AUC值，由药时曲线尾部4个点的血药浓度数据的对数对时间t进行线性回归，用统计矩估算药物动力学参数结果见表3，4，5。

[0224] 表3统计矩估算低剂量（3mg/kg）紫杉醇脂质微球注射液(T)与桂利嗪注射液(R)的各项药动学参数

[0225]

[0226] 表4统计矩估算中剂量（6mg/kg）紫杉醇脂质微球注射液(T)与桂利嗪注射液(R)的各项药动学参数

[0227]

[0228] 表5统计矩估算高剂量（12g/kg）紫杉醇脂质微球注射液(T)与桂利嗪注射液(R)的各项药动学参数

[0229]

[0230] 分别静脉注射相同剂量的市售紫杉醇注射液和紫杉醇脂质微球两种制剂后的大鼠血药浓度—时间曲线（见图5，6，7）形状相似，各项药动学参数也无显著性差异（P＞0.05）。可见将紫杉醇做成脂质微球注射液后并没有显著改变其在动物体内的代谢过程。随着给药剂量的增加，紫杉醇的AUC(0-t) 基本成线性增加（见图8）

[0231] 实施例4

[0232] 本发明含有两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液血管刺激性试验

[0233] 剂量分组：

[0234] 第一组 含有两亲性聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液，6mg (10ml) /kg/次×1次×7d

[0235] 第二组 0.9%氯化钠注射液，10ml/kg/次×1次×7d

[0236] 试验方法：

[0237] 取家兔6只,按体重、性别均衡分成两组,每组3只。第一组左耳给药6mg (10ml)/kg/次；第二组左耳给等容积氯化钠注射液作对照,连续给药7天,每天1次,每次给药之前对动物和注射部位进行肉眼观察有无红肿、丘斑形成等。末次给药后48小时,处死动物,在进针部位下1cm和5cm处,剪取兔耳,肉眼观察、记录。而后以10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察血管内皮、皮下组织及血栓形成情况。

[0238] 试验结果：

[0239] 肉眼所见：给药组和对照组家兔给药局部仅见轻微发红、未见明显红肿、渗出、淤血及组织坏死等病理改变。

[0240] 镜下所见：紫杉醇脂质微球注射液组家兔耳缘静脉距进针部位下1cm处可见：血管内有多少不等红血球，未见血栓，血管内皮细胞未见肿胀增生，血管外周围组织未见组织坏死等病理改变；5cm处血管内可见多少不等红血球，血管外周围组织未见炎性细胞浸润和组织坏死等。0.9%氯化钠注射液组：1cm和5cm处血管及周围组织均未见明显异常。

[0241] 结论：

[0242] 含聚氨基酸的紫杉醇脂质微球注射液临床用量对家兔耳缘静脉未见明显刺激作用。