降血压多肽及其用途

摘要

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血压多肽及其用途。本发明所要解决的技术问题是提供新的降血压多肽。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种降血压多肽。该降血压多肽：(1)是具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列的多肽；或者为：(2)是在所述SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列基础上经过取代、缺失、或者添加一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。通过体内外试验证明该多肽其具有良好的降血压作用，能够制备成为降血压药物，为降血压领域提供了一种新的有效选择。

权利要求

1.多肽，其特征在于：氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的多肽。

2.权利要求1所述的多肽的编码基因。

3.含有权利要求2所述的编码基因的载体。

4.含有权利要求3所述的载体的宿主细胞。

5.权利要求1所述的多肽在制备降血压药物中的用途。

6.降血压药物，其特征在于：含有权利要求1所述的多肽作为有效成分。

7.根据权利要求6所述的降血压药物，其特征在于：为口服制剂。

8.根据权利要求7所述的降血压药物，其特征在于：所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、滴丸、口服液或颗粒剂。

说明书

降血压多肽及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降血压多肽及其用途。

背景技术

[0002] 猪血，有着悠久的药用历史，自汉代起，历代本草均把猪血单独列出，记载了它的药用功效：“补血养心，熄风镇惊，下气，止血”等等；同时还收录了大量的验方。民间也广泛食用猪血预防、治疗疾病。现代研究亦表明，猪血不仅含有人体所必需的8种氨基酸在内的18种氨基酸，具有较高的营养价值，还能够治疗贫血、白血病，降低血脂，促进伤口愈合等。
然而现在，人们主要利用了该品种的食用性，很大程度上忽略了它的药用功效。这主要是因为猪血药用功能物质基础不明，对它的药用基础性研究还十分薄弱。

[0003] 国外特别是日本以猪血为原料，研究酶解后的的生物活性肽，多肽的部分功能与本草记载相符。我国猪血资源丰富，年产量约为10亿公斤，但仅有一小部分应用于食品、饲料产业，绝大部分成为废弃物。与我国历史背景类似的日本对猪血的开发利用率为50～60％左右(主要根据本草记载利用现代生物技术进行深度加工后开发为药品)，究其原因主要是国内对该资源重视度不够，有效成分不明确，难以深度利用。国内该资源的丰富性与低水平的利用现状以及本草记载使用的历史与现今国外研究利用的热度，促使我们应该对这一资源引起重视。

[0004] 国外由蛋白质酶解获得的活性肽，是功能性食品、药品开发研究最活跃的领域之一。研究者从食品蛋白质的酶解物中发现了一些小分子肽，这些肽按生理功能主要可分为：吗啡样活性肽、抗高血压肽、免疫调节肽、促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽、促进DNA合成和细胞生长的肽、抗菌肽、抗癌肽、促进双歧杆菌生长的肽等。

[0005] 以猪血为蛋白源的生物活性肽是通过现代生物技术酶解后将猪血中的血红蛋白转化为小分子肽。研究表明，小分子猪血肽不仅有很好的溶解性、低粘度，最新研究表明，饮食中的寡肽(2～3个氨基酸)和多肽(10～51个氨基酸)能够完整地通过肠道吸收，作为生物活性肽在组织水平上引起机体的生物学效应。而且，蛋白质利用率高，它还具有低抗原性，不会产生过敏反应。

[0006] 1977年Dardenne和Pleau等从猪血清中分离和精制了免疫调节激素-胸腺肽(TF)，并进行了结构分析，得到了其氨基酸，分子量857Da。我国冯启浩等通过药理研究表明，从猪血中得到的TF具有显著的免疫活性。越来越多的研究关注以猪血蛋白为来源的功能性多肽。Kazue Mito等人酶解猪血珠蛋白得到了4种具有抑制ACE活性的多肽。张艳梅等对猪血中抗菌肽类物质进行分离纯化和抗菌活性研究；王延卓从猪血中分离得到分子量为6kDa的多肽，其对大肠杆菌质控株ATCC25922抗菌活性最好。方俊等对猪血蛋白多肽抗氧化功能进行研究。目前需要在猪血中发现新的活性多肽，以为本领域提供新的选择。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供新的功能多肽。

[0008] 本发明解决技术问题的技术方案是提供一种新的功能多肽。该功能多肽：

[0009] (1)是具有SEQ ID No.2所述的氨基酸序列的多肽；

[0010] 或者为：

[0011] (2)是在所述SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上经过取代、缺失、或者添加一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。

[0012] 上述多肽的功能为降血压。

[0013] 本发明还提供了上述多肽的编码核苷酸序列。

[0014] 本发明还提供了含有上述的编码核苷酸序列的载体。

[0015] 本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞。

[0016] 本发明另外也提供了上述多肽在制备降血压药物中的用途。

[0017] 当然，本发明也提供了一种新的降血压药物。该降血压药物含有上述的多肽作为有效成分。

[0018] 进一步的，上述的降血压药物的剂型为口服制剂。

[0019] 更进一步的，上述的口服制剂主要为胶囊剂、片剂、滴丸、含片、分散片、片剂或颗粒剂等。

[0020] 本发明以猪血为起始的研究材料。首先制得猪血脱色液，然后对猪血脱色液进行进一步的酶解。对酶种类进行比较后，最后仍选用胃蛋白酶进行酶解为佳，通过胃蛋白酶酶解，然后超滤，得到分子量＜3kDa的酶解液MC。

[0021] 随后再将酶解液MC通过凝胶层析分离、反向高效液相色谱法分离、体外ACE抑制活性跟踪得到6个新多肽，Genebank多肽数据库查询表明这6种肽均为首次从猪血中分离得到。并通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定序列，其中一种的氨基酸序列为YTVF，其对ACE活性抑制的IC50为0.226mg/ml。

[0022] 对YTVF多肽进行了胃蛋白酶和胰蛋白酶消化实验，被消化后活性增强，说明这种肽能够经口服给药。推测该ACE活性抑制肽为前体型抑制剂(Prodrug-type inhibitor)。药理实验表明，该多肽对自发性高血压大鼠(SHR)有显著的降血压作用。能够在给药后1～
36小时内发挥药效，给药后3小时降血压作用最强。初证实了其降血压效果。

[0023] 该多肽可以作为活性成分再添加本领域的其他辅助性成分，或再添加其他具有抗血压活性的成分制成制剂使用。其剂型最好为口服制剂，如：胶囊剂、片剂、滴丸、含片、分散片、口服液、片剂或颗粒剂等常见的口服制剂。

[0024] 本发明首次获得了具有良好降压活性的多肽YTVF(SEQ ID No 2)，并通过体内外试验证明其合成肽具有良好的降血压作用，能够制备成为降血压药物，并且能够口服使用，为降血压领域提供了一种新的有效选择，具有很好的市场前景。

附图说明

[0025] 图1猪血脱色液SDS-PAGE(Tris-Glycine体系)电泳图谱。M：标准品1：胃蛋白酶酶解液2：胰蛋白酶酶解液3：1394蛋白酶酶解液4：木瓜蛋白酶酶解液。

[0026] 图2猪血脱色液SDS-PAGE(Tris-Tricine体系)电泳图谱。M：标准品1：胃蛋白酶酶解液2：胃蛋白酶酶解液超滤后3：胰蛋白酶酶解液4：胰蛋白酶酶解液分子量超滤后5：木瓜蛋白酶酶解液6：木瓜蛋白酶酶解液超滤后7：1394蛋白酶酶解液8：1394蛋白酶酶解液分子量超滤后

[0027] 图3Sephadex G-25凝胶色谱分离图谱。I，II，III，IV，V，VI分别代表组分(管号)I，II，III，IV，V，VI。

[0028] 图4 P1、P2、P3的SHRs一次给药血压变化图。SHRs一次给药SBP(收缩压)变化如上所述，垂直条代表标准偏差。其中：●代表空白对照组(纯净水)，△代表P1组，◇代表P2组，□代表P3组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，p＜0.05。

[0029] 图5P4的SHRs一次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。其中：●代表空白对照组(纯净水)，■代表P4组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，p＜0.05。

[0030] 图6P5的SHRs一次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。其中：▲代表空白对照组(纯净水)，■代表P5组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，p＜0.05。

[0031] 图7P6的SHRs一次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。▲代表空白对照组(纯净水)，■代表P6组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，p＜0.05。

具体实施方式

[0032] 下面结合附图通过实施例对本发明方法作进一步的描述，但并不因此将本发明保护的范围限定在实施例的范围之中。

[0033] 实施例一模拟体内代谢的猪血体外酶解

[0034] 猪血干燥后的主要成分为蛋白质，含量近20％，其中血细胞中的血红蛋白占全血蛋白总量的75％。血红蛋白经水解后，降解成为不同链长的小分子肽类化合物。猪血中显色与腥臭味物质主要为血红素，它对有效物质的提取分离、含量测定、分子量检测等研究严重干扰。猪血的入人体首先被消化酶降解成较稳定的多肽(分子量范围是0.1kDa～10kDa)，分子量小于3kDa的小肽通常具有生物活性，这类小肽也易被人体吸收。这类小肽也是猪血起效的共性性物质。因此选择合适的方法将猪血脱色成为寻找猪血降压活性成分的首要任务。

[0035] 本发明通过酶解结合活性炭脱色，脱色产物采用消化酶体外模拟体内消化条件，对脱色液进行进一步的酶解，并对酶解液进行超滤，得到分子量小于3kDa的多肽粗品(MC)。全过程用Tricine-SDS-PAGE对蛋白、多肽的分子量范围进行跟踪。为进一步分离纯化降压肽奠定基础。

[0036] 1、实验材料与仪器

[0037] 猪血(采集于温江屠宰场)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶，德阳生化厂；粉末活性炭(重庆吉元化学有限公司)；五水硫酸铜，无水碳酸钠，柠檬酸三钠，乙酸，甘油，氢氧化钠，羧甲基淀粉钠，成都市科龙化工试剂厂；福林酚试剂；十二烷基硫酸钠；Acrylamide(丙烯酰胺)，N，N-Methylene bisacrylamide(甲叉双丙烯酰胺)，Tris(三羟甲基氨基甲烷)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，Glycin(甘氨酸)，美国sigma公司；以上皆为分析纯。

[0038] 紫外可见分光光度计(France Anthelie)；冷冻离心机(Biofugo primor)；pH计(DD-15)；涡旋混合仪(WH-3)；恒温水浴锅；3kD、10kD Millipore超滤离心筒；电泳仪(Mini-protean III)；制冰机(SIM-F124)；冷冻离心机(Biofuge primor)；凝胶电泳分析系统(170-8101)

[0039] 2、猪血脱色研究

[0040] 2.1实验流程

[0041] 新鲜猪血→加入柠檬酸三钠抗凝→离心→取下层→酶解→调pH＝3.0→加吸附剂脱色→离心→取上清液→补足到同一体积→综合评价脱色效果

[0042] 2.2实验方法

[0043] 2.2.1血红素测定

[0044] 用紫外分光光度计对脱色液进行全波长扫描，得到两个最大吸收峰OD280和OD415，OD280为蛋白质的特征峰，OD415为血红素的特征峰。

[0045] 本实验选用OD415进行血红素的测定。脱色率按照以下公式计算：

[0046]

[0047] As-酶解液脱色前在OD415的吸光度值

[0048] A0-酶解液脱色后在OD415的吸光度值

[0049] 2.2.2蛋白质含量测定

[0050] 采用lowry法[53]测定脱色液样、猪血原样的蛋白浓度，计算蛋白质得率(PR)。计算方法如下式：

[0051]

[0052] 2.2.3响应值计算

[0053] 脱色效果采用响应值评价，既保证较高的脱色率，又保证较高的蛋白质得率，响应值越小越好，计算方法如下式：

[0054]

[0055] 2.2.4酶活力测定

[0056] 采用中华人民共和国专业标准ZBX66030-87《蛋白酶活力测定法》规定的方法。

[0057] 2.2.5脱色条件优化

[0058] 采用4因素5水平均匀设计法进行脱色条件优化。

[0059] 2.3结果分析

[0060] 2.3.1脱色剂选择

[0061] 选取粉末活性炭、羧甲基淀粉钠(CMS)、羧甲基纤维素钠(CMC)为脱色剂，评价指标为蛋白质得率、脱色率、响应值、色泽、气味、除去难易(以离心除去时间考察)，考虑脱色剂成本、再生问题。使用胃蛋白酶酶解液，脱色条件为吸附剂加入量4％、pH＝3.0、温度55℃、反应30min、8000g离心。脱色评价见表1。

[0062] 表1不同脱色剂脱色效果评价

[0063]脱色剂 色泽度 气味 响应值R 离心时间(min)
CMS +++++棕黄 淡 640 35
活性炭 ++浅黄 淡 123 20

[0064] 注：“+”代表色泽度，越多代表颜色越深，以下表格中“+”均代表此意义，不做重复说明。

[0065] 在实验中由于CMC溶解速度非常慢，反应时间内几乎不能溶解，不适用于脱色，放弃使用。

[0066] 按响应值综合评价CMS与活性炭的脱色效果，活性炭略优于CMS，易离心除去，再考虑到活性炭成本较低，所以以下实验均选用活性炭为脱色剂。

[0067] 2.3.2脱色酶解酶种类选择

[0068] 选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶四种酶酶解猪血蛋白，酶解条件为6.0％加酶量、12.0％底物浓度、3h作用时间、温度40℃、pH为各酶最适pH值(见表2)，脱色剂均为活性炭，采用单因素分析，比较脱色效果，见表3。

[0069] 表2各种酶最适作用条件

[0070]酶种类 pH值 酶活力U
1394酶 7.2 131200
胰蛋白酶 7.2 40400
胃蛋白酶 2.5 94600
木瓜蛋白酶 8.0 140000

[0071] 表3不同酶种类脱色效果评价

[0072]酶种类 色泽度 气味度 响应值R
1394酶 ++ 淡 34887
胰蛋白酶 + 无 7232
胃蛋白酶 ++++ 淡 1317
木瓜蛋白酶 +++ 浓 1867

[0073] 从表3中可知，除了木瓜蛋白酶，均没有腥臭味；经胃蛋白酶酶解后，脱色液色泽较其他酶深，但总体颜色都比较浅，差异不大，呈浅黄色；并且胃蛋白酶脱色液蛋白质含量高，按响应值R综合评价，脱色效果明显优于其他三种酶。胃蛋白酶为主要的消化酶，并且它在酸性环境pH＝3.0左右下发挥作用，此pH值下球蛋白与血红素结合最疏松，所以选用胃蛋白酶为进行酶解。

[0074] 2.3.3胃蛋白酶脱色条件优化

[0075] 对胃蛋白酶脱色条件进行优化，选取pH＝3、温度55℃、4％脱色剂加入量、活性炭脱色。设置温度、时间、加酶量、底物浓度4个指标，5个水平(见表4)，进行均匀设计(见表5)。

[0076] 表4影响酶解效果的4因素5水平设计

[0077]

[0078] 表5优化试验方案与结果

[0079]

[0080] 样品1～5号的色泽度、气味度区分不大，感官不能判断，总体来说色泽为淡黄色、无腥臭味。

[0081] 以响应值R为均匀设计试验结果(见表5)，进行统计学处理：

[0082] R＝0.999F＝190.706P＝0.053＜0.1，在实际工作中可选择P＜0.1。

[0083] 把均匀表的各水平数换为具体的水平值，计算逐步回归方程得：

[0084] Y＝5454.517-65.457x2-166.771x4-437.4x1

[0085] 由回归方程各项为负号，可以看出，最优点的近似估计为x1＝2.0x2＝45x3＝0.5x4＝14.4所以，脱色最优方案为：加酶量8.0％、温度45℃、酶解时间0.5h、底物浓度
18.0％。

[0086] 3、体外酶解模拟体内代谢

[0087] 3.1实验流程

[0088] 脱色液→酶解→高温灭酶→离心(4000g×40min)→取上清液→用10kDa、3kDa的millipore滤膜先后进行超滤

[0089] 用SDS-PAGE电泳(Tris-Tricine，Tris-Glycine系统)，lowry法两种方法分别进行分子量范围追踪和含量检测。

[0090] 3.2方法

[0091] 3.2.1超滤分离

[0092] 为除去大分子的干扰，得到分子量＜3kDa的肽，选择10kDa和3kDa的滤膜进行分段超滤。取灭酶后的酶解液各10ml，先用10kDa的滤膜进行超滤去除大分子的干扰，接着将分子量＜10kDa的滤液用3kDa的滤膜进行超滤，得到分子量＜3kDa的酶解液MC，分别记录体积并留样。

[0093] 3.2.2多肽含量测定

[0094] 采用lowry法测定灭酶酶解液、多肽分子量＞3kDa的超滤液的多肽含量，计算分子量＜3kDa多肽得率PR值，以PR值作为主要评价指标，比较各个酶的酶解效果。计算方法如下式：

[0095] PR＝[(W1-W2)/W1]×100％

[0096] W1——灭酶酶解液的多肽含量

[0097] W2——分子量＞3kDa/10kDa超滤液的多肽含量

[0098] 3.2.3多肽分子量范围测定

[0099] 本实验以分子量＜3kDa的多肽作为目标肽群，所以采用常规SDS-PAGE，Tris-Glycine电泳系统超低分子量SDS-PAGE，Tris-Trcine电泳系统对酶解液的多肽分子量进行检测分析。电泳条件见表6

[0100] 表6Tris-Glycine\Tris-Trcine系统电泳条件

[0101]

[0102] 3.3结果分析

[0103] 3.3.1多肽分子量范围测定

[0104] 选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶四种酶的酶解液，进行SDS-PAGE(Tris-Glycine系统)电泳，由图1可知酶解液电泳图谱未见条带，表明酶解后样品分子量均小于14.4kDa，说明酶解都比较彻底。

[0105] 选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶四种酶酶解液与3kDa超滤后样品进行SDS-PAGE Tris-Tricine系统电泳，由图2可知各蛋白酶酶解液中多肽分子量分布均在14.4kDa以下，进一步说明酶解比较彻底。通过3kDa超滤后，分子量分布均在3.3kDa以下。并且，为蛋白酶酶解液超滤前后条带颜色均比较深，说明其多肽浓度较高。

[0106] 3.3.2多肽含量分析

[0107] 选取胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶四种酶酶解脱色液，酶解条件为6％加酶量、12％底物浓度、6小时作用时间、温度40℃、pH为各酶最适pH值(见表2)，用小于3kDa多肽得率作为主要评价指标，综合比较各个酶的酶解效果。(见表7)[0108] 表7不同酶解条件＜3kDa多肽得率

[0109]酶种类 多肽总含量(mg) 多肽得率(％)
胃蛋白酶 1982.37 88.86
胰蛋白酶 802.56 98.56
木瓜蛋白酶 816.0 66.21
1394酶 561.79 93.21

[0110] 由表7可知经胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶酶解后，分子量＜3kDa的多肽得率都较高，木瓜蛋白酶分子量＜3kDa的多肽得率相对较低。胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、1394酶的多肽总含量较少，胃蛋白酶含量较高，说明胃蛋白酶的酶解效果比较好。木瓜蛋白酶是植物蛋白酶，1394是微生物蛋白酶，猪血在人体内发挥作用，需经消化道酶分解，胃蛋白酶是人体内主要的消化酶，综合评价，胃蛋白酶为最适蛋白酶。

[0111] 通过单因素实验，考察出胃蛋白酶脱色效果比较好，其脱色条件为加酶量8.0％、温度45℃、酶解时间0.5h、底物浓度18.0％，吸附剂为活性炭。在此条件下得到的脱色液颜色浅黄色，无腥味，蛋白质含量较高。除去显色物质(腥臭物质)，可有效降低其对功能性多肽的提取分离、含量测定等实验的影响。猪血脱色液的进一步酶解，对酶种类进行比较，综合评价最后仍选用胃蛋白酶进行酶解，通过胃蛋白酶酶解得到分子量＜3kDa的多肽总含量最高，达到20％，且分子量＜3kDa的多肽得率高，达到88.86％。

[0112] 本发明选择消化道酶胃蛋白酶进行酶解脱色，不但简化了脱色步骤、取得很好的脱色效果、保证多肽的得率，并为下一步利用消化道酶模拟体内代谢奠定基础。

[0113] 实施例二猪血降血压功能性多肽分离与鉴定

[0114] 高血压的发病机制通常认为是血管紧张素酶(ACE)使血管紧张素I(Ang I)过度转换成使血压升高的血管紧张素II(AngII)，同时ACE降解缓激肽，使之失活。所以通过抑制ACE的活性来降低血管紧张素II的生成，阻抗缓激肽的降解(失活)从而降低血压。Cushman最早从兔肺里提出ACE，建立了ACE抑制活性的测定方法，后来许多科研人员在此基础上进行改动。本实验通过体外模拟体内对ACE的抑制作用，筛选出猪血降血压功能性多肽。

[0115] 本实验通过凝胶过滤分离后，采用RP-HPLC精分离，分离过程采用ACE活性跟踪，得到的多肽采用基质辅助激光解析电离飞行时间质(MALDI-TOF-MS)测定序列，结果可靠准确。以获得猪血酶解的降血压功能性多肽及其氨基酸序列，并对多肽的基本性质进行了初步的研究。

[0116] 1、实验材料与仪器

[0117] 分子量3kDa酶解液MC；HHL、ACE、TNBS(Sigma Chemical Co.)；Captopril(成都市药检所)；冰乙酸(分析纯)，三水乙酸钠(分析纯)，乙腈(色谱纯)、亚硫酸钠、硼酸、硼酸钠、甲醇(色谱纯)葡聚糖凝胶Sephadex G-25(Amersham Biosciences)。

[0118] 自发性高血压大鼠(SHR)(上海斯莱克动物中心)，SD大鼠(成都中医药大学实验动物中心)。

[0119] 紫外可见分光光度计(France Anthelie)；冷冻离心机(Biofugo primor)；pH计(DD-15)；涡旋混合仪(WH-3)；恒温水浴锅；蠕动泵；分步收集器；酶标仪(Varioskan)；制冰机(SIM-F124)；高效液相色谱仪(LC-20A，日本岛津公司)；色谱柱(4.6mm×150mm)(Shim-pack VP-ODSC18column)。

[0120] 2、降血压活性肽的分离

[0121] 2.1降血压活性肽的层析分离

[0122] 2.1.1凝胶层析柱条件

[0123] 装柱：凝胶层析柱1.6cm×60cm，取10g Sephadex G-25填料，加入蒸馏水搅拌加热溶胀1.5h，取出冷却至室温，加入0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNacl预处理，抽滤，用蒸馏水反复清洗干净；湿法装柱；

[0124] 预平衡：用流动相预平衡30min，流速1.5ml/min；

[0125] 柱效检测：取1％体积的丙酮上样，流速1.5ml/min，检测波长280nm。

[0126] 2.1.2样品初步分离

[0127] 取2ml(3.3％v/v)分子量小于3kDa酶解液MC上样，用乙酸-乙酸钠(0.05mol/L，pH＝5.0)进行洗脱，检测波长215nm，分步收集。

[0128] 2.2降血压活性肽的RP-HPLC分离

[0129] 取初步分离的活性最强的组分，用0.45μm的水相滤膜过滤，上样。

[0130] 高效液相法分离降血压多肽柱温37℃，检测波长215nm，采用水-乙腈梯度洗脱分离，流动相A：水(含5％乙腈)；流动相B：乙腈(含5％水)；梯度洗脱：1％-100％B 60分钟。

[0131] 2.3降血压活性检测

[0132] 参 考 Matsui T(Matsui T，Matsufuji H，Osajima Y.Colorimetric measurement of angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity with trinitrobenzene sulfonate.Biosci Biotechnol Biochem.1992，56(3)：517-518.)和US2007/0141120A1-0084专利文献记载的方法，并适当改动。具体为：取用5mlEP管，按表加入待测样品，置于37℃保温20min，再加入相应试剂，再置于37℃保温20min，测定416nm下吸收度A，计算ACE抑制率，对ACE抑制率达到50％时的抑制剂浓度即为半抑制浓度，计为IC50。操作步骤如下表8。

[0133] 表8ACEI活性测定加样表

[0134]

[0135] Blank1为Control的空白对照，Blank2为Sample的空白对照，用来测定抑制率：

[0136]

[0137] 酶活单位定义(U)：1个单位酶活定义为在37℃、1min内催化HHL形成1umol马尿酸的酶量。

[0138] 2.4结果分析

[0139] 超滤得到的MC通过凝胶层析初步分离得到一系列活性组分，见表9；其中活性最强的为组分I，抑制率达到100％；组分I通过RP-HPLC分离得到6个多肽P1、P2、P3、P4、P5、P6，见图3。它们都有ACE抑制活性，见表10。

[0140] 表9活性组分

[0141]组分序号 同体积抑制率％
组分I 100％
组分II 61％
组分III 40％
组分IV 24％
组分V 33％
组分VI 19％

[0142] 表10分离得到的六个ACE活性多肽的纯化表

[0143]

[0144] 3、降血压活性肽的鉴定

[0145] 3.1降血压活性肽质谱分析

[0146] 液相条件：

[0147] nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱系统配备自动进样器。

[0148] 富集柱：Symmetry C18，180μmx20mm，5um颗粒。分析柱：nanoACQUITYUPLC超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEH C18，75um×250mm，1.7um颗粒。柱温度：35℃；流速：200nl/min。流动相A：含0.1％甲酸的水溶液，流动相B：含0.1％甲酸的乙氰。梯度：1％到40％B 65分钟，到85％B 5分钟，80％B停留10分钟，平衡10分钟到起始1％B。

[0149] 质谱条件

[0150] 质谱仪：Synapt High Definition Mass Spectrometry质谱仪(Waters公司)。源温：90℃。采集范围：MS：350-1600Da，MS/MS：50-2000Da。

[0151] 数据分析软件：PLGS v2.3处理后通过Mascot检索软件的MS MS离子方式检索数据库。检索条件：Trypsin酶切，M氧化和碘乙酰胺烷基化为可变修饰，漏切位点为1。MS和MS/MS的质量误差均为0.2Da。

[0152] 3.2Genebank多肽数据库考察

[0153] 质谱测序获得的6条多肽在Genebank多肽数据库查询(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/peptidome/resources/)，最终表明均无以上多肽注册信息，初步表明为首次获得。

[0154] 3.3降血压活性肽合成

[0155] 多肽合成由上海Bootech BioScience & Technology Co.，Ltd.公司合成。

[0156] 3.4结果分析

[0157] 对组分I中六个多肽进行鉴定，得到氨基酸序列，分别为：WVPSV、VVYPW、YTVF、WVPSVY、EGQLTL、VVLLGDV。它们的分子量均在1000Da以下，最大749Da，最小528Da。P1、P2、P3、P4、P5、P6均为首次从猪血中分离的ACE活性抑制肽，其中，P3(VVYPW)比以前文献报道的ACE活性抑制肽VVYPWY(IC50是0.62mg/ml)的少一个氨基酸Y(SEQ IDNo.7)，IC50也明显要小(IC50越小其ACE活性抑制功能越强)。

[0158] 4、降血压活性肽稳定性考察

[0159] 4.1热稳定性考察

[0160] 由于多肽来源酶解液MC是通过高温(T＝90℃)灭酶得到的，所以这些多肽具有较好的热稳定性。

[0161] 4.2对消化酶稳定性考察

[0162] 取胰蛋白酶和胃蛋白酶进行降血压肽的消化实验，考察其对胃肠道酶的稳定性。酶解前后的样品进行了ACE抑制活性测定。分别取1mg合成肽，各取一份加入100μl 3％的胃蛋白酶，另一份加入100μl 3％的胰蛋白酶溶液混匀。在37℃反应6h，取出，离心(8000g×10min)，取上清液测定ACE抑制活性。

[0163] 4.3结果分析

[0164] P1、P2、P3、P4、P5、P6消化前均有ACE抑制活性。P1、P2消化前活性不高，IC50值分别为5.2％、6.4％。P1经胃蛋白酶消化后，活性增强，IC50值0.336mg/ml；P2经胰蛋白酶消化后，活性增强，IC50值0.210mg/ml。P3经胃、胰蛋白酶消化后，活性增强，IC50值为：0.248mg/ml。P4被胃蛋白酶消化后，活性增强，IC50值0.220mg/ml，P5被胃蛋白酶消化后，活性增强，IC50值：0.520mg/ml，P6被胃蛋白酶消化后，活性增强，IC50值：0.415mg/ml。

[0165] 初步表明P1、P2、P3这三种肽不易被胃蛋白酶降解而失去活性，能够适用于口服给药。它们在被消化后活性增强说明经消化后产生更小分子量的活性小肽片段，这就更利于体内肠粘膜细胞的吸收以及作用的发挥。P1的专属消化酶可能是胃蛋白酶，P2的专属消化酶可能是胰蛋白酶，P3对两种酶都有亲和性。

[0166] 实施例三降血压肽药理学验证

[0167] 经体外实验证实具有ACE抑制活性的降血压肽，在体内并不一定都具有降血压的效果。降血压肽必须进入血液循环才能发挥其降压作用，如果口服，容易被消化道内的酶分解或者被ACE先行降解，都可能会变成无活性的短肽或氨基酸。本发明获得的降血压肽能否成功通过胃肠道的屏障？通过体内实验如动物实验或者临床试验，能更准确判断降血压肽的效果。

[0168] 在前面的实验中，已经获得了具有ACE抑制活性的6个降血压肽。为了进一步验证这些降血压肽的实际降压效果，本实验选择P1、P2、P3、P4、P5、P6，对自发性高血压大鼠(SHR)进行了短期给药实验，研究降血压肽的降压功能。

[0169] 1、实验材料与仪器

[0170] 合成的多肽P1(SEQ ID No 1)、P2(SEQ ID No 2)、P3(SEQ ID No 3)、P4(SEQ ID No4)、P5(SEQ ID No 5)、P6(SEQ ID No 6)；无盐或低盐鼠粮(成都中医药大学动物实验中心)；

[0171] 自发性高血压雄性大鼠(SHR)；

[0172] BP-6动物无创血压测试仪(成都泰盟科技有限公司)。

[0173] 2、方法

[0174] 2.1实验动物前处理

[0175] 按照Michio Muguruma介绍的方法，稍许改动，具体为：

[0176] 动物分组：4只空白对照组，3只阳性对照组，18只平均分6组作为实验组，每组3只，每组分别记为BC、PC、SP1、SP2、SP3、SP4、SP5、SP6；

[0177] 动物饲养：把这些SHR鼠放置在空气恒温24±1℃，湿度50±10％的房间，让其接受12小时光照(早上7:00～晚上7:00)，12小时黑暗，轮流替换。饲料为常规低盐或者无盐鼠粮，水为过滤的自来水。喂养4周以后，这些SHR就可以准备给药。

[0178] 2.2动物给药

[0179] 将合成肽P1、P2、P3、P4、P5、P6分别配制成1mg/ml的水溶液；按10ml/kg的量分别对实验组SP1、SP2、SP3、SP4、SP5、SP6进行灌胃给药；空白对照组BC给同剂量的纯水。

[0180] 2.3血压测定

[0181] 用装鼠筒固定大鼠，露出尾巴；在容器中预热25min，恒温36℃，用无创血压测试仪从大鼠尾动脉测定血压。记录给药前，给药后3h，15h，24h的血压值(SBP)。

[0182] 2.4统计学处理

[0183] 给药前后SBP显著性差异用paired Student’s t-test进行分析。

[0184] 3、结果分析

[0185] 高血压大鼠血压变化情况

[0186] SHRs灌胃给药测定血压结果显示，6个合成肽P1、P2、P3、P4、P5、P6在实验动物体内都具有较强的降血压活性，见表11。在给药3小时后，SP1、SP2、SP3、SP4、SP5、SP6六个组降血压效果明显(p＜0.05)：SP1、SP2、SP3、SP4、SP5、SP6组的SBP(收缩压)分别下降22.5mmHg、18.5mmHg、15.1mmHg、18.5mmHg、5.85mmHg和4.6mmHg。这表明在给药多肽P1、P2、P3、P4、P5、P6在口服给药3小时后具有均有显著的降血压作用。给药15小时以后，SP1、SP2、SP4组的SBP(收缩压)下降仍然明显(p＜0.05)，但有所回升。SP3、SP5、SP6组的SBP回升较多，仍然处于负值，这表明多肽P1、P2、P4的在体内的药用能持续一段时间，而P3、P5、P6作用代谢较快。24小时以后，SP1、SP3、SP4、SP5、SP6的SBP均恢复初始水平，而SP2组在36小时以后恢复初始水平。说明P1、P2、P3、P4、P5、P6的一次性代谢时间为24～
36小时。六组SBP变化见图4、5、6、7。

[0187] 4、结论与讨论

[0188] 表11给药前后各组SHR的SBP值(mmHg)

[0189]样品号 给药前SBP 给药3h后 给药15h后 给药24h后 给药36h后
BC 165.75±0.35 168.75±3.18 164.50±2.12 164.75±1.77 165.30±2.24
P1 154.75±6.72 131.75±0.35 139.50±1.84 153.65±5.16 155.82±2.12
P2 163.55±5.73 144.70±2.97 146.15±2.62 155.5±4.24 162.03±4.33
P3 158.4±8.4 143.90±4.67 153.00±3.33 158.5±2.36 155.69±0.85
P4 156.6±6.4 138.1±4.41 147.85±2.11 155.7±2.47 157.6±4.1
P5 162.85±5.37 157.0±4.17 161.25±5.31 162.4±2.3 164.05±2.11
P6 159.2±5.7 154.6±2.11 157.3±2.17 158.8±3.25 161.2±3.11[0190] 药理实验表明，多肽P1、P2、P3、P4、P5、P6对自发性高血压大鼠(SHR)有显著的降血压作用。能够在给药后1～36小时内发挥药效，给药后3小时降血压作用最强。其中，P1降血压效果最明显，P2降血压效果持续时间最长，P3在体内代谢得最快。

[0191] 本发明通过体外消化实验表明本发明多肽肽分别在被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解后作用增强，结合药理实验推测六种肽在体内的降血压作用与参与反应的体内消化酶有关。通常情况，多肽口服进入人体以后，先被胃进行初步消化，胃中含有大量胃蛋白酶，在胃中停留的时间较短；然后进入小肠，经胰液以及小肠粘膜细胞分泌的多种消化酶消化然后被吸收，其中主要蛋白酶为胰蛋白酶。

[0192] P1、P4、P5、P6在进入消化系统的第一步，就能被胃蛋白酶消化成作用很强的小肽，直接被小肠吸收利用，且P1降压效果最明显。P2需要在小肠中经胰蛋白酶消化后才能更好的发挥作用，反应时间较长，所以作用持续时间也长。P3能够被胃肠道的酶同时消化，所以在体内的代谢很快。并且这几种多肽有可能为前体型抑制剂(Prodrug-type inhibitor)，该类多肽可被ACE或胃肠道酶水解为真正的抑制剂，这些多肽被自发性高血压大鼠口服后仍然保持着抗高血压的活性，其IC50与母体肽(消化酶处理前的原始多肽)相比变小，功效更好。