胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体

摘要

本发明涉及胃癌靶向STAT3基因的siRNA表达载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术为主，针对STAT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒STAT3-siRNA1/2。本发明胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体能高效的特异性的抑制STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的胃癌的基因药物。

权利要求

1.靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，其特征是，以购自GenePharma公司Catalog no：E-07的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector为载体，针对信号转导子和转录激活子3（STAT3）编码区上游的一段序列，在较高表达STAT3的胃癌细胞系HGC-27中发挥RNA干扰作用；STAT3特异性RNA干涉靶序列为：5'－GCAACAGATTGCCTGCATTGG－3’，起始于956位；是用于STAT3基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：（1）RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成

选择STAT3基因编码区的一段序列5'－GCAACAGATTGCCTGCATTGG－3’，设计并体外合成一对互补的寡核苷酸序列，序列如下：STAT3寡核苷酸序列1：

正义链：

5’-CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’反义链：

5’-GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’（2）合成的寡核苷酸与线性载体pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector连接、转化、扩增及质粒的提取将步骤（1）合成的一对寡核苷酸等量混匀，95℃作用3分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养;用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；

（3）质粒的鉴定

将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒中。

说明书

胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体

技术领域

[0001] 本发明涉及表达STAT3（signal transducer and activator of transcription3）基因的胃癌的基因治疗药物，具体涉及靶向胃癌STAT3基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

[0002] 胃癌是常见的癌症之一，全世界每年新诊断病例约930 000例，每年死于胃癌的患者约700 000人。虽然手术治疗和辅助化疗技术不断改进，胃癌患者的生存率仍然不能令人满意。

[0003] 近年来，信号传导途经在肿瘤的发病机制和防治手段的研究中越来越受到人们的重视。其中，信号转导子和转录激活子家族（STATs）信号传导途经的研究尤为突出。JAK/STATs信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡密切相关，该通路异常活化可导致细胞异常增殖与恶性转化。STAT由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b及STAT6等7个成员组成，其中STAT3与肿瘤的关系最为密切。

[0004] 研究显示，STAT3过度激活后将生成同源二聚体，进入细胞核，识别并结合到靶基因DNA特异的反应元件上，进而调控抗凋亡基因Bcl-XL、Survivin和细胞周期控制基因c-Myc和cyclinD1以及血管内皮生长因子（VEGF）等的表达，从而有利于肿瘤细胞的生长。有研究发现，STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号汇聚的焦点，因此理论上阻断肿瘤细胞STAT3信号传导通路就有可能起到治疗肿瘤的作用。尽管STAT3也参与正常细胞因子信号的调节，但是在正常细胞中阻断STAT3信号通路后并不影响正常细胞的增殖和存活。因而阻断STAT3途径可以抑制肿瘤细胞的生长而对正常细胞呈现出低毒性的损害，这使STAT3成为肿瘤治疗的新靶点。

[0005] 多项研究表明STAT3与胃癌的关系十分密切。Jackson等证实胃癌细胞胞浆和胞核中都存在STAT3的过表达。Kim等也发现STAT3的表达与胃癌局域淋巴结转移密切相关。Bronte-Tinkew DM等发现STAT3信号路径的异常活化促进了胃癌的发生发展。Deng J等人认为STAT3与胃癌发展和预后密切相关，是预测胃癌预后的一个重要的分子生物学指标。
我们的前期工作也证实胃癌组织中存在STAT3高表达，并与胃癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分级密切相关。

[0006] RNA干扰是由双链RNA（dsRNA）诱导的在植物、动物和许多真菌中均存在的序列特异性基因沉默现象。RNA干扰具有高度特异性，在RNAi过程中，dsRNA能够特异性诱导其同源基因mRNA的降解，形成21～23个核苷酸（21～23nts）的小核苷酸片段，再在此基础上进一步降解，其他基因几乎不受影响。此外，RNA干扰具有高效性，研究发现，细胞仅需要几个分子的小干扰RNA（small interference RNA,siRNA），即可产生类似于缺失突变体表型的RNAi效应。RNAi可能的作用机制如下：不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物或线虫细胞内，与Dicer的C末端结构域结合产生21～23nt siRNAs片段。每个片段的3ˊ端都有2nt核苷酸突出；Dicer通过PAZ结构域与含有PAZ结构域的Argonaute蛋白互相作用，核酸内外切酶、解旋酶与Argonaute蛋白相连进而与siRNA一起形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物（RNA-inducing silencing complex,RISC）。RISC中的解旋酶应用ATP解开siRNA双链，使其反义链互补结合到靶向mRNA上与之相匹配的特异性序列，RISC中的核酸酶降解mRNA，降解的mRNA随后迅速的被细胞其他的RNA酶所降解。从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。Brummelkamp等发现通过向细胞质导入可以表达siRNA的质粒，可以使RNA干扰稳定地维持2个月。

[0007] 肿瘤是多基因疾病，在基因治疗领域RNA干扰特别适合用于某个基因过度表达或由于体内突变基因表达所致的疾病。利用RNA干扰相关技术可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、生长因子及其受体以及部分关键酶等，在不影响正常基因功能的前提下抑制突变基因表达或基因的过量表达，从而达到治疗肿瘤的目的。

发明内容

[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一种胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。

[0009] 术语说明：

[0010] STAT3（signal transducer and activator of transcription3）:信号转导子和转录激活子3。

[0011] 本发明以利用RNA干涉技术为主，针对STAT3基因的不同靶序列，构建了两个能在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector1/2,以下简称STAT3-siRNA1/2。其示意图谱见图1，能高效的特异性的抑制STAT3基因表达，可用于制备治疗高表达STAT3基因的胃癌的基因药物。

[0012] 本发明的技术方案如下：

[0013] 靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector为载体，针对信号转导子和转录激活子3（STAT3）编码区上游、中游的两段序列，在可较高表达STAT3胃癌细胞系HGC-27中发挥RNA干扰作用。这两段STAT3特异性RNA干涉靶序列分别为：①5'－GCAACAGATTGCCTGCATTGG－3’，起始于956位；②5'－GCGTCCAGTTCACTACTAAAG－3’，起始于1243位，是用于STAT3基因相关性胃癌的治疗性物质，由以下方法制得：

[0014] （1）RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成

[0015] 选择STAT3基因编码区的两段序列①5'－GCAACAGATTGCCTGCATTGG－3’②5'－GCGTCCAGTTCACTACTAAAG－3’，设计并分别体外合成两对互补的寡核苷酸序列，序列如下：

[0016] ①STAT3寡核苷酸序列1：

[0017] 正义链：

[0018] 5’-CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’[0019] 反义链：

[0020] 5’-GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’[0021] ②STAT3寡核苷酸序列2：

[0022] 正义链：

[0023] 5’-CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’[0024] 反义链：

[0025] 5’-GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’[0026] （2）合成的寡核苷酸分别与线性载体PGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector连接、转化、扩增及质粒的提取。

[0027] 首先将步骤（1）合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用3分钟后缓慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。用质粒提取试剂盒提取纯化质粒DNA；质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。

[0028] （3）质粒的鉴定

[0029] 将步骤（2）提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒中。

[0030] 本发明的胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体在制备治疗表达STAT3的胃癌的基因药物中的应用。

[0031] 为了对STAT3基因siRNAs表达质粒对STAT3基因的抑制效果及对胃癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，RT－PCR法测定对STAT3mRNA表达水平的抑制作用，western blotting测定抑制STAT3后对STAT3蛋白表达水平的影响，MTT法检测抑制STAT3基因后对肿瘤细胞生长的影响。

[0032] 本发明针对STAT3基因构建的两种siRNAs表达质粒是可用于高表达STAT3的胃癌的治疗物质，其中STAT3-siRNA1抑制胃癌细胞STAT3表达的效率较高，可用于进一步研究STAT3基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。

[0033] 下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法：

[0034] （1）RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成沿mRNA序列寻找连续两个AA及后面的19个核苷酸，通过同源性比较，选择与其他任何基因无同源性的序列即作为潜在的siRNA靶位点（靶位点不含有3个以上的相同序列，GC含量在30%—50%左右）。按照载体试剂盒说明，针对STAT3基因的编码序列,为找到具有最佳沉默效果的靶位点，选取两段靶序列，分别从中上游选择两个符合条件的靶位点，分别为：

[0035] ①STAT3-1 956 GCAACAGATTGCCTGCATTGG

[0036] ②STAT3-2 1243 GCGTCCAGTTCACTACTAAAG

[0037] 设计并合成两对互补的寡核苷酸序列，每一正向单链寡核苷酸内，21nt的寡核苷酸以正反向组合，以UUCAAGAGA为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体（pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector）上相互补BamH I和Bbs I限制性酶切位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。

[0038] （2）合成的寡核苷酸分别与线性载体pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector连接、转化、扩增及质粒的提取。

[0039] 首先将合成的两对寡核苷酸等量混匀，95℃作用3分钟后慢慢冷却至室温，然后将结合的双链寡核苷酸与线性化的pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector质粒载体连接，最后转化到JM109大肠杆菌，经卡那霉素筛选，挑选单个菌落大量培养。质粒的提取纯化按照试剂盒说明书进行操作。

[0040] 连接反应体系：

[0041]

[0042] （3）质粒的鉴定质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片断测序。

[0043] 本发明的胃癌靶向STAT3基因的siRNAs表达载体的生物学活性的鉴定主要包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT－PCR检测STAT3基因的表达、western blotting测定抑制STAT3后对STAT3蛋白表达水平的影响，MTT法检测抑制STAT3基因后肿瘤细胞生长情况。

[0044] 质粒生物学活性鉴定方法如下：

[0045] 1.胃癌细胞培养及质粒的转染HGC-27细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，取质粒4μg加入250μl opti-MEM，轻轻混匀，按LipofectamineTM2000转染试剂（Invitrogen）说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分三组，分别为空白对照组，8μl：4μg组,10μl:4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物，6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后72h于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。

[0046] 2.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测

[0047] （1）提取总RNA取转染后的胃癌细胞HGC-27，用PBS漂洗2次，按106－107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管,加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。

[0048] （2）cDNA的合 成 和PCR反应 使 用Takara公司 的RT-PCR试 剂盒，先 按50℃30min，99℃5min,5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10X RTBuffer1μl，dNTPs 混 合 物 1μl，RNase Inhibitor0.25μl，AMV Reverse Transcriptase0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR仪（PE5700）中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，
56℃30sec,72℃1min共36个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR buffer5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa Ex Taq HS酶0.125μl，STAT3上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。

[0049] 目的基因PCR引物序列及扩增片段长度

[0050]

[0051] 3.蛋白水平验证STAT3表达的变化

[0052] （1）培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS Loading buffer裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA10-15s，降低样本粘滞度。95～100℃加热10min，冰上冷却，4℃离心
11000×4min。吸取上清至0.5m lEp管中，-80℃保存。

[0053] （2）蛋白样品电泳步骤：先灌入约4ml的分离胶，凝固约30min；接着灌入约1ml的浓缩胶，凝固约20min。将胶板放入电泳槽中，加满电泳液。将蛋白样品加入到孔里，4℃90v电压电泳1.5～2h。

[0054] （3）转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10s，去离子水浸泡5min，1×转移缓冲液浸泡15min。（剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜）。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。（膜的大小≥滤纸的大小>胶的大小；各层之间不能出现气泡），4℃稳流50mA转移12～14h。

[0055] （4）抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5min。室温用封闭缓冲液孵育膜1h（摇床上摇）。25ml TBST洗膜3次×5min/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5min/次。HRP-标记的二抗稀释液（用封闭液稀释）室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5min/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。

[0056] 4.细胞的增殖活性变化

[0057] 采用MTT比色法来测定细胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透过细胞膜而进入细胞内，活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不溶于水的蓝紫色甲月替（Formazam）结晶颗粒，此结晶可被酸性异丙醇,SDS，DMSO等有机溶剂溶解，依颜色深浅可通过分光光度计测定出各吸光度值，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度（A）值的大小可反映活细胞的数量及活性，而死亡细胞没有线粒体脱氢酶活性，与MTT不起反4
应。将HGC-27细胞接种于96孔培养板中,细胞终密度约为3×10/ml,体积100μl,接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h,72h后每孔加入20μl MTT液(5mg／m1)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100μl DMSO液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A490。

[0058] 抑制率=(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)×100%。每个时间点测定5孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。

[0059] 所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下：

[0060] 1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于5000bp和6000bp之间，已知构建好的质粒大小约为5200bp左右。

[0061] 2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。

[0062] 紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和纯度

[0063]

[0064] 3.测序结果通过测序（图3）验证了插入序列与所合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了STAT3-siRNA1/2。

[0065] 4.转染率计算结果在转染后72h于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8μl：4μg转染效果最好（见图4所示转染率为85%），且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体/质粒载体更大时（10μl：4μg）,转染率没有显著增加。

[0066] 5.RT-PCR结果转染后72小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示,各组均可见STAT3基因的特异性条带（317bp）和内参β-actin主带（511bp）,与空载体对照的条带比较可发现STAT3-siRNA1和STAT3-siRNA2的STAT3条带亮度都有所减弱，其中以STAT3-siRNA1更为明显，抑制率为53%，说明该质粒抑制STAT3的效率较高。

[0067] 6.Western bloting检测STAT3-siRNA干扰质粒对STAT3表达水平的影响转染后72小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western bloting检测，在约79kD位置出现了目的蛋白表达,STAT3和GAPDH的灰度比值显示，STAT3-siRNA1和STAT3-siRNA2的STAT3条带亮度都有所减弱，其中以STAT3-siRNA1更为明显，抑制率为60%，说明该质粒抑制STAT3的效率较高。（见图6）。

[0068] 7.细胞的增殖活性变化（MTT法）结果以抑制率较高的STAT3-siRNA1转染HGC-27细胞,转染后分别在0h、24h、48h、72h测定各孔A490每个时间点测定5孔求平均值,计算抑制率，抑制率=(1-实验组A值平均值/空白对照组A值平均值)×100%,以时间为横轴,以抑制率为纵轴绘制曲线(图7)。可见与空载体组相比STAT3-siRNA1能够显著抑制HGC-27细胞的生长。

[0069] 本发明靶向STAT3基因的siRNAs表达载体，能显著抑制肿瘤细胞内高表达的STAT3，进而影响其生物活性，在制备治疗高表达STAT3的胃癌的基因药物中应用。

[0070] 本发明的优良效果如下：

[0071] 本发明针对STAT3基因，利用RNA干扰技术结合基因重组技术成功构建了CMV启动子驱动的两种siRNAs表达质粒，并通过在胃癌细胞株HGC-27中表达STAT3特异性siRNAs分子，特异性的抑制了STAT3基因的表达，并筛选出抑制率高的一种siRNA表达质粒，以达到特异性、有效阻断STAT3表达及治疗胃癌的目的。

[0072] I.本发明构建的两种STAT3特异性siRNAs表达质粒可有效抑制STAT3基因的表达。主要有如下优点：①本质粒可在大肠杆菌JM109中大量扩增，即可不断获得表达siRNAs的载体；②针对STAT3编码区中、上游分别设计了RNA干扰的靶位点，从而找到了对STAT3基因抑制效率较高的位点；③安全性高，无插入突变危险，亦无免疫毒性反应。

[0073] II.本发明构建、筛选的特异性siRNAs表达质粒针对STAT3基因，抑制效果明显。本发明针对STAT3基因的siRNAs表达质粒是可用于STAT3相关胃癌的治疗物质，能显著抑制肿瘤细胞生长并能诱导其凋亡。

[0074] III.本发明所采用的siRNA技术能够在mRNA和蛋白水平上干扰基因的表达。siRNA是近几年发现的一种非编码的单链RNA，其长度为19-25nt。在进化上具有高度的保守性，能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，在基因调控中扮演着重要的角色。本发明所构建的质粒siRNA干扰表达载体采用CMV启动子，能够促进目的基因的表达和转录。该质粒首先通过体内转录的方式合成一个约53nt的具有茎-环结构的shRNA，在特异性核酸内切酶Dicer的作用下，生成发夹状的单链siRNA分子，能与靶序列特异性的结合，从而降解靶mRNA，阻止其蛋白翻译，即RNA干扰（RNA interference）。

附图说明

[0075] 图1STAT3-siRNA1/2载体图谱。

[0076] 图2质 粒DNA琼 脂 糖 凝 胶 电 泳图：①DNA Marker；② 空 载 体 对 照；③STAT3-siRNA1；④STAT3-siRNA2。

[0077] 图3插入片段的基因测序图：A：质粒STAT3-siRNA1测序图；B：质粒STAT3-siRNA2测序图；

[0078] 图4荧光显微镜检测转染率：A：Hochest染色B：转染后的实验组（脂质体/质粒载体为8μl：4μg）。

[0079] 图5RT-PCR检测转染STAT3-siRNA1/2后72小时后对HGC-27细胞STAT3mRNA表达水平的抑制作用。

[0080] 图6Western bloting检测转染STAT3-siRNA1/2后72小时后对HGC-27细胞STAT3蛋白表达的抑制效果。

[0081] 图7MTT法测定转染STAT3-siRNA1后对HGC-27生长的抑制。

具体实施方式

[0082] 下面结合实例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。本发明所有试剂及原料均可通过市场购买。

[0083] 一、主要试剂

[0084] 1.载 体pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector 购 自 GenePharma 公 司（Catalog no：E-07）

[0085] 2.工程菌JM109购自于promega公司（Catalog no：L1001）

[0086] 3.T4连接酶购于NEW ENGLAND公司（Catalog no：M0202）；质粒的提取和纯化试剂盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）购自于QIAGEN公司（Cat No：27104）

[0087] 4.STAT3和β-actin特异性PCR引物合成、STAT3特异性siRNA寡核苷酸链合成和DNA序列测定(南京金斯瑞生物科技有限公司)

[0088] 5.转染试剂Lipofectamine2000(Cat.No：11668-027，Invitrogen)[0089] 6.TRzol Reagent(Cat.No.152476-026,Invitrogen)RT-PCR试剂盒RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0(Code No.DRR019A,Takara)

[0090] 7.stat3rabbit mAb(目录号4904,cell signaling)

[0091] 8.Mouse Anti-GAPDH Monoclonal antibody(目录号TA-09，北京中杉金桥生物技术公司)

[0092] 9.HRP标记的山羊抗鼠IgG（目录号ZB-2305，北京中杉金桥生物技术公司）[0093] 10.HRP标记的山羊抗兔IgG（目录号ZB-2301，北京中杉金桥生物技术公司）[0094] 11.浓缩型DAB显色试剂盒(目录号ZLI-9032，北京中杉金桥生物技术公司)[0095] 12.预染蛋白marker（目录号SM0671，Fermentas）

[0096] 二、主要仪器

[0097] 1.紫外分光光度计（GeneQuant Pro）：Amersham Biosciences

[0098] 2.凝胶成像系统（ChemilmagerTM4400）：Alpha Innotech

[0099] 3.生物安全柜（Hfsafe1200）：上海力申科学仪器公司

[0100] 4.二氧化碳培养箱（HF90）：上海力申科学仪器公司

[0101] 5.荧光显微镜（ECLIPSE TE2000-S）：Nikon

[0102] 6.CCD（penguin150CL）：美国pixera公司

[0103] 7.台式冷冻离心机（TGL-16G）：上海安亭科学仪器厂

[0104] 8.PCR仪（PE5700）：ABI

[0105] 9.全自动酶标仪（Multiskan Mk3）：Thermo Labsystems

[0106] 三、质粒的制备方法及其生物学活性鉴定

[0107] 1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成

[0108] 1.1选 择 靶序 列 选 取 两 段靶 序 列，这 两 段序 列 分 别 为：①5' －GCAACAGATTGCCTGCATTGG－3’，起始于956位；②5'－GCGTCCAGTTCACTACTAAAG－3’，起始于1243位。

[0109] 1.2设计寡核苷酸每一正向单链寡核苷酸内21nt的寡核苷酸以正反向组合，以UUCAAGAGA为发夹环序列间隔，使寡核苷酸形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补；每对寡核苷酸两端分别带有与线性化载体（pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector）上相互补BamH I和Bbs I限制性酶切位点，这是连接线性化载体所必需的。按以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。

[0110] 按照以上所述，两个靶序列设计后的寡核苷酸序列如下：

[0111] ①STAT3寡核苷酸序列1：

[0112] 正义链：

[0113] 5’-CACCGCAACAGATTGCCTGCATTGGTTCAAGAGACCAATGCAGGCAATCTGTTGCTTTTTTG-3’[0114] 反义链：

[0115] 5’-GATCCAAAAAAGCAACAGATTGCCTGCATTGGTCTCTTGAACCAATGCAGGCAATCTGTTGC-3’[0116] ②STAT3寡核苷酸序列2：

[0117] 正义链：

[0118] 5’-CACCGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTTCAAGAGACTTTAGTAGTGAACTGGACGCTTTTTTG-3’[0119] 反义链：

[0120] 5’-GATCCAAAAAAGCGTCCAGTTCACTACTAAAGTCTCTTGAACTTTAGTAGTGAACTGGACGC-3’[0121] 2.构建pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector STAT3干扰真核表达载体[0122] 2.1退火用高压去离子水重悬STAT3的寡核苷酸干粉至浓度为100μM，上下游序列按下列反应体系以混合，95℃水浴3分钟，自然冷却至室温。

[0123]

[0124] 2.2连接将退火产物（浓度10μM）用DNase/RNase-free water做500倍稀释，稀释至浓度为20nM，彻底混匀，-20℃保存。将稀释好的STAT3双寡核苷酸1/2分别与pGPU6/GFP/Neo siRNA Expression Vector（载体图谱见图1），用T4DNA连接酶连接。16℃过夜孵育。

[0125] 连接反应体系：

[0126]

[0127] 2.3转化

[0128] ①取感受态细胞JM1093管（50μl/每EP管），冰上融化10min.

[0129] ②分别加入各连接产物5μl混匀，冰上放置30min,每隔5min轻轻摇动EP管。

[0130] ③42℃水浴中放置30秒，勿晃动。迅速取出置于冰中，静置2min.[0131] ④每管加入250μl的37℃预热的SOC培养基，37℃振摇（约225转）1小时左右。

[0132] ⑤取不同体积菌液（50μl-200μl）涂布于含有卡那霉素（终浓度为50μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜。

[0133] 2.4阳性重组子小量扩增与分离纯化

[0134] ①挑选上述含卡那霉素的LB平板中的单个克隆，种在4ml含卡那霉素（终浓度为50μg/ml）的LB液中，37℃振摇（约170转）14-16小时。每组都分别挑选5个克隆。

[0135] ②实验组各取1ml菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行插入片段测序。另用甘油保存余下菌液，置-80℃保存备用。

[0136] ③取出测序正确的菌种，划线接种在含卡那霉素的LB平板上，37℃孵育14-16小时。挑单个菌落接种在4ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振摇（约170转）14-16小时。

[0137] ④质粒的小量提取：取3ml菌液按QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)说明书提取质粒。

[0138] 1)收集菌液与离心管中，室温下10000rpm离心5min;收集菌体，重悬于250μl的细胞悬浮液P1；

[0139] 2)加入250μl碱裂解液P2,盖紧管口,颠倒旋转离心管4-6次以混匀,室温静置5min;

[0140] 3)加入350μl缓冲液N3,立即温和颠倒离心管5～10次,室温下13000rpm离心10min;

[0141] 4)将上清液小心移入吸附柱，室温下10000rpm离心1min，倒掉收集管的液体，将吸附柱放于同一收集管中；

[0142] 5)在吸附柱中加入750μl洗涤液PE，室温10000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，重复洗涤一遍；

[0143] 6)倒掉收集管中液体，讲吸附柱放入同一收集管中。室温10000rpm离心1min，去除残留洗液；

[0144] 7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附模中央加入50μl洗脱液EB，静置1min，室温离心1min；

[0145] 8)质粒保存在－70℃

[0146] 3.质粒DNA的检测

[0147] 3.1琼脂凝胶电泳分析：配制0.8%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭），取1μl质粒DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA。

[0148] 3.2紫外分光光度计分析：取1μl质粒DNA用69μl超纯水稀释，在自动紫外分光光度计下检测A260nm和A280nm处的吸光值，以测定质粒DNA的浓度和纯度。

[0149] 4.胃癌细胞培养及质粒的转染HGC-27细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置5
于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×10个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板TM
后24小时，取质粒4μg加入250μl opti-MEM，轻轻混匀，按Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）说明书方法进行瞬时转染。剂量配比在其建议范围内选择设计，按照脂质体与质粒配比分三组，分别为空白对照组，8μl：4μg组,10μl:4μg组，分别制备脂质体/质粒转染复合物6孔板中加入500μl转染复合物，来回移动培养板，使转染复合物与细胞充分接触。于37℃培养6h后，补加新鲜的含10％胎牛血清的DMEM，继续孵育。在转染后
72h于荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。

[0150] 5.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测

[0151] 5.1提取总RNA取转染后的胃癌细胞HGC-27，用PBS漂洗2次，按106－107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管,加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。

[0152] 5.2cDNA的 合成 和PCR 反应 使 用Takara公 司 的RT-PCR试 剂 盒，先 按50℃30min，99℃5min,5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10X RTBuffer1μl，dNTPs 混 合 物 1μl，RNase Inhibitor0.25μl，AMV Reverse Transcriptase0.5μl，Oligo dT-Adaptor Primer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR仪（PE5700）中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，
56℃30sec,72℃1min共36个循环，反应总体系为20μl，包括5X PCR buffer5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRa Ex Taq HS酶0.125μl，STAT3上、下游引物各1μl，内参β-actin上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列下表。

[0153] 目的基因PCR引物序列及扩增片段长度

[0154]

[0155] 6.蛋白水平验证STAT3表达的变化

[0156] 6.1培养细胞蛋白提取步骤：取出培养细胞，弃去旧培养液，冰预冷PBS洗1次。加1×SDS Loading buffer裂解细胞，用细胞刮子将细胞刮下来，并转移至Ep管中，保持在冰上。剪切DNA10-15s，降低样本粘滞度。95～100℃加热10min，冰上冷却，4℃离心
11000×4min。吸取上清至0.5m lEp管中，-80℃保存。

[0157] 6.2蛋白样品电泳步骤：先灌入约4ml的分离胶，凝固约30min；接着灌入约1ml的浓缩胶，凝固约20min。将胶板放入电泳槽中，加满电泳液。将蛋白样品加入到孔里，4℃90v电压电泳1.5～2h。

[0158] 6.3转膜步骤：PVDF膜处理：甲醇浸泡10s，去离子水浸泡5min，1×转移缓冲液浸泡15min。（剪膜时戴手套，防止手上沾染的蛋白污染膜）。由负极到正极，按照三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸的顺序放好。（膜的大小≥滤纸的大小>胶的大小；各层之间不能出现气泡），4℃稳流50mA转移12～14h。

[0159] 6.4抗体孵育步骤：转膜后用25ml TBS洗膜，室温5min。室温用封闭缓冲液孵育膜1h（摇床上摇）。25ml TBST洗膜3次×5min/次。一抗稀释液孵育膜轻微振荡4℃过夜。TBST洗膜3次×5min/次。HRP-标记的二抗稀释液（用封闭液稀释）室温孵育膜1h。TBST洗膜3次×5min/次。将滤膜放在瓶皿中，加入适量的新鲜配置的DAB底物溶液，5-15分钟即可显色，用水冲洗终止反应并照相。

[0160] 7.细胞的增殖活性变化我们采用的是MTT比色法来测定细胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透过细胞膜而进入细胞内，活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不溶于水的蓝紫色甲月替（Formazam）结晶颗粒，此结晶可被酸性异丙醇,SDS，DMSO等有机溶剂溶解，依颜色深浅可通过分光光度计测定出各吸光度值，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度（A）值的大小可反映活细胞的数量及活性，而死亡细胞没有线粒体脱氢酶活性，与MTT不起反应。将HGC-27细胞接种于96孔培养板中,细胞终密度约为3×104/ml,体积100μl,接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h,72h后每孔加入20μl MTT液(5mg／m1)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100μl DMSO液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A490。抑制率=(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)×100%。每个时间点测定5孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。

[0161] 四、结果

[0162] 1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图2示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于6000bp和5000bp之间，已知构建好的质粒大小约为5200bp左右。

[0163] 2.紫外分光光度计检测结果如下表所示各质粒浓度如下；各质粒的A260/A280比值均在1.80左右，结合琼脂糖凝胶电泳结果，确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。

[0164] 紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和纯度

[0165]

[0166] 3.测序结果通过测序（图3）验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了STAT3-siRNA1/2。

[0167] 4.转染率计算结果在转染后72h于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果显示以脂质体/质粒载体为8μl：4μg转染效果最好（见图4所示转染率为85%），且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例。当脂质体体积更大时（10μl：4μg）,转染率没有显著增加。

[0168] 5.RT-PCR结果转染后72小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示,各组均可见STAT3基因的特异性条带（317bp）和内参β-actin主带（511bp）,与空载体对照的条带比较可发现STAT3-siRNA1/2的STAT3条带亮度都有所减弱，其中以STAT3-siRNA1更为明显，抑制率为53%，说明该质粒抑制STAT3的效率较高。

[0169] 6.Western bloting检测STAT3-siRNA干扰质粒对STAT3表达水平的影响转染后72小时，提取各实验组细胞总蛋白，Western bloting检测，在约79kD位置出现了目的蛋白表达,STAT3和GAPDH的灰度比值显示，STAT3-siRNA1/2的STAT3条带亮度都有所减弱，其中以STAT3-siRNA1更为明显，抑制率为60%，说明该质粒抑制STAT3的效率较高（见图6）。

[0170] 7.细胞的增殖活性变化（MTT法）结果以抑制率较高的STAT3-siRNA1转染HGC-27细胞，转染后分别在0h、24h、48h、72h测定各孔A490每个时间点测定5孔求平均值，计算抑制率，抑制率=(1-实验组A值平均值/空白对照组A值平均值)×100%，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线（如图7）。可见与空载体组相比STAT3-siRNA1能够显著抑制HGC-27细胞的生长。