本发明公开了一种染色体8q24区段多态性检测特异性引物和液相芯片，该液相芯片主要包括有：由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成的特异性引物，所述特异性引物序列分别选自：针对G83T的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对C140A的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C160T的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对G99A的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对C202A的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对C296T的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对A125C的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对T119C的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对C149A的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40、针对C193T的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对G201T的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44中的一对以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.22中的序列；微球，扩增引物。所制备的染色体8q24区段多态性检测液相芯片具有非常好的信号噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
一种染色体8q24区段多态性检测特异性引物和液相芯片
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种染色体8q24区段检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
[0002] 全基因组关联研究发现，染色体8q24区段的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与前列腺癌、结肠癌和乳腺癌等多种肿瘤的遗传易感性相关。
[0003] 目前，对染色体8q24区段的单核苷酸多态性进行检测、分析的方法很多，如：直接测序法、PCR-RFLP分析法、传统固相芯片等等，其中最常用的是PCR-RFLP分析法。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，传统固相芯片因其重复性差不能满足实际应用的需要，而其它基于PCR技术的方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
[0004] 本发明目标检测的染色体8q24区段突变位点，如表所示：
[0005]
发明内容
[0006] 本发明的目的之一是提供染色体8q24区段多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于检测染色体8q24区段的11种常见多态性位点G83T、C140A、C160T、G99A、C202A、C296T、A125C、T119C、C149A、C193T和G201T的野生型和突变型。
[0007] 一种染色体8q24区段多态性检测液相芯片，主要包括有：
[0008] A.针对染色体8q24区段的11种常见多态性位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因多态性位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：针对G83T的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、针对C140A的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C160T的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对G99A的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对C202A的SEQID NO.31及SEQ ID NO.32、针对C296T的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对A125C的SEQID NO.35及SEQID NO.36、针对T119C的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对C149A的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40、针对C193T的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对G201T的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44中的一对以上；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.22中的序列；
[0009] B.分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与A中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.45～SEQ ID NO.66中的序列，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列，上述每种微球具有不同颜色编码；
[0010] C.用于扩增具有G83T、C140A、C160T、G99A、C202A、C296T、A125C、T119C、C149A、C193T和G201T的中的一个以上多态性位点目标序列的引物。
[0011] 优选地，所述扩增引物为：针对G83T的SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、针对C140A的SEQID NO.69和SEQ ID NO.70、针对C160T的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、针对G99A的SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、针对C202A的SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、针对C296T的SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、针对A125C的SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80、针对T119C的SEQ ID NO.81和SEQID NO.82、针对C149A的SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.84、针对C193T的SEQ ID NO.85和SEQ IDNO.86、针对G201T的SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.88中的一对以上。
[0012] 优选地，所述ASPE引物为：针对G83T的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24组成的序列、针对C140A的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26组成的序列、针对C160T的由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.27组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.28组成的序列、针对G99A的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.29组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.30组成的序列、针对C202A的由SEQID NO.9和SEQ ID NO.31组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.32组成的序列、针对C296T的由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.33组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.34组成的序列、针对A125C的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.35组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.36组成的序列、针对T119C的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.37组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQID NO.38组成的序列、针对C149A的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.40组成的序列、针对C193T的由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.41组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.42组成的序列、针对G201T的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.43组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.44组成的序列中的一对以上。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种用于染色体8q24区段多态性检测的特异性引物序列。
[0014] 实现上述目的的技术方案如下：
[0015] 一种用于染色体8q24区段多态性检测的特异性引物序列，其选自：针对G83T的SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24、针对C140A的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对C160T的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对G99A的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、针对C202A的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对C296T的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对A125C的SEQ ID NO.35及SEQID NO.36、针对T119C的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、针对C149A的SEQ ID NO.39及SEQ IDNO.40、针对C193T的SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42、针对G201T的SEQ ID NO.43及SEQ ID NO.44中的一对以上。
[0016] 本发明的主要优点在于：
[0017] 1.本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中，经过大量试验，反应验证，得到最优组合的液相芯片系统。所制备的染色体8q24区段多态性检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
[0018] 2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。
[0019] 3.本发明的检测方法步骤简单，11种多态性位点检测可通过一步多重PCR即可完成11个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
[0020] 4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
[0021] 实施例1染色体8q24区段多态性检测液相芯片，主要包括有：
[0022] 一、ASPE引物
[0023] 针对染色体8q24区段的11种常见基因型G83T、C140A、C160T、G99A、C202A、C296T、A125C、T119C、C149A、C193T和G201T的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
[0024] 表1染色体8q24区段的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
[0025]
[0026]
[0027]
[0028] 每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
[0029] 二、anti-tag序列包被的微球
[0030] 根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的22种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
[0031] 表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
[0032]
[0033]
[0034] 选择的22种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
6
[0035] 分别取5×10 个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/m1)。配制 10ng/ml 的 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)( 购 自 Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
[0036] 三、扩增出含有多态性位点的目标序列的引物
[0037] 针对染色体8q24区段的11种常见多态性位点G83T、C140A、C160T、G99A、C202A、C296T、A125C、T119C、C149A、C193T和G201T，设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出11条含有多态性位点的目标序列。
[0038] 表3扩增出具有多态性位点的目标序列的引物
[0039]
[0040]
[0041] 所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
[0042] 实施例2运用染色体8q24区段检测液相芯片对样本的检测
[0043] 所述各种溶液的配方如下：
[0044] 50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250m1)：
[0045]
[0046] 2×Tm杂交缓冲液
[0047]试剂 来源 终浓度 每250ml的用量
1MTris-HCl，pH8.0 SigmaT3038 0.2M 50ml
5MNaCl Sigma S5150 0.4M 20ml
Triton X-100 Sigma T8787 0.16％ 0.4ml
[0048] 过滤后贮存于4℃。
[0049] ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
[0050] 生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
[0051] 一、样本的DNA提取：
[0052] 参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
[0053] 二、待测样品的PCR扩增
[0054] 设计11对引物，多重PCR一步扩增出分别含有染色体8q24区段的11种常见基因型G83T、C140A、C160T、G99A、C202A、C296T、A125C、T119C、C149A、C193T和G201T共11条的目标序列，产物大小分别为273bp、342bp、307bp、351bp、362bp、471bp、283bp、353bp、440bp、385bp和432bp，引物序列(SEQ ID NO.67-88)见上述表3所示。
[0055] 首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.67-88的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
[0056]
[0057]
[0058] PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
[0059] 三、PCR产物的酶切处理
[0060] 1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
[0061] 四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
[0062] 利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
[0063] 首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
[0064]
[0065] 反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
[0066] 五、杂交反应
[0067] 1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的22种微球(每种微球浓度均为5
2.5×10 个/ml)；
[0068] 2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
[0069] 3.微球于≥10000g离心1-2min；
[0070] 4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
[0071] 5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
[0072] 6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
[0073] 7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
[0074] 8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
[0075] 9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
[0076] 10.微球于≥3000g离心2-5min；
[0077] 11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
[0078] 12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
[0079] 六、结果检测与数据分析
[0080] 反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
[0081] 1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
[0082] 2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
[0083] 3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
[0084] 突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
[0085] 4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
[0086] 使用本方法检测20份样本的染色体8q24区段多态性位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的染色体8q24区段型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的染色体8q24区段多态性检测液相芯片能够准确地检测出染色体8q24区段多态性位点类型，且结果稳定可靠。
[0087] 表4样本检测结果(MFI)之一
[0088]
[0089] 表5样本检测结果(MFI)之二
[0090]
[0091]
[0092] 表6样本染色体8q24区段突变比值(％)
[0093]
[0094]
[0095] 表7样本染色体8q24区段突变比值(％)
[0096]
[0097]
[0098] 表8样本染色体8q24区段突变类型分析结果
[0099]样本号 液相芯片检测结果 测序结果
1 野生型 野生型
2 296CT 296CT
3 野生型 野生型
4 149AA 149AA
5 野生型 野生型
6 99GA、125CC 99GA、125CC
7 野生型 野生型
8 83TT 83TT
9 野生型 野生型
10 野生型 野生型
11 野生型 野生型
12 202AA 202AA
13 野生型 野生型
14 160TT 160TT
15 125AC 125AC
16 野生型 野生型
17 野生型 野生型
18 201TT 201TT
19 野生型 野生型
20 野生型 野生型
[0100] 实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对染色体8q24区段多态性位点的检测[0101] 一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
[0102] 以染色体8q24区段C160T和C202A位点突变检测液相芯片为例，分别针对C160T和C202A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.22，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ IDNO.45-SEQ ID NO.66。具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
[0103] 表9液相芯片制备的设计
[0104]
[0105] 二、样品检测
[0106] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
[0107] 表10样本检测结果与基因多态性分析
[0108]
[0109] 表11样本检测结果与基因多态性分析
[0110]序号NO. C202A-w检测值 C202A-m检测值 C202A判断结果
[0111]Group4 Group5 Group6 Group4 Group5 Group6 Group4 Group5 Group6
阴性对照 25 16 20 24 22 16 - - -
21 3453 3994 3157 129 63 90 3％ 1％ 2％
22 3171 3750 2776 188 85 164 5％ 2％ 5％
23 3481 4193 3495 188 121 232 5％ 2％ 6％
24 2743 3616 2662 75 66 203 2％ 1％ 7％
25 3107 3669 2771 202 80 150 5％ 2％ 5％
26 2823 3591 2918 266 127 200 8％ 3％ 6％
27 2727 3362 2710 129 90 224 4％ 2％ 7％
28 3387 4065 3446 244 109 213 6％ 2％ 5％
29 171 120 133 2485 3367 2561 94％ 97％ 96％
30 2787 3408 2476 112 112 164 3％ 3％ 6％
31 3447 4078 3121 157 95 150 4％ 2％ 4％
32 2882 3430 2813 233 112 174 7％ 3％ 5％
33 2499 3364 2423 194 114 115 6％ 3％ 4％
34 2600 3291 2301 243 121 164 8％ 3％ 6％
35 2752 3680 2995 157 86 188 5％ 2％ 5％
36 2337 3297 2425 231 128 261 8％ 3％ 9％
37 2549 3327 2487 108 91 194 3％ 2％ 7％
38 2370 3301 2564 125 122 249 4％ 3％ 8％
39 2464 3162 2371 209 125 125 7％ 3％ 4％
40 3296 3825 2933 167 110 238 4％ 2％ 7％
[0112] 其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组2和试验组5。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
[0113] 实施例4染色体8q24区段多态性检测特异性引物序列的选择
[0114] 一、液相芯片制备的设计(野生型和突变型特异性引物序列的选择)
[0115] 以染色体8q24区段A125C和C193T位点突变检测液相芯片为例，分别针对A125C和C193T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和两条备选的特异性引物序列，如表11所示。其中， 内碱基为多态性位点。
[0116] 表12特异性引物序列
[0117]
[0118] 以染色体8q24区段A125C和C193T位点突变检测液相芯片为例，分别针对A125C和C193T的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表(表13)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
[0119] 表13液相芯片制备的设计之二
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[0121]
[0122] 二、样品检测
[0123] 采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
[0124] 表14样本检测结果与基因多态性分析
[0125]
[0126] 表15样本检测结果与基因多态性分析
[0127]
[0128]
[0129] 其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的特异性引物序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组7和试验组10。其它不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
[0130] 以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
