使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法

摘要

本发明所要解决的技术问题是为恩拉霉素的分离纯化提供一种有效的方法。解决该问题的技术方案是提供了一种利用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法。该方法即用甲醇将大孔弱酸性阳离子树脂充分活化，加入足量的水，搅拌混合后装柱，用弱碱性的甲醇溶液过柱平衡；恩拉霉素菌丝体经乙醇水浴加热回流得到粗品，粗品与弱酸性的甲醇水溶液混合，过滤，调至弱碱性，上柱，吸附后用甲醇水洗去杂质，再用适量的甲醇水洗脱，收集洗脱液，浓缩，蒸干后得产品恩拉霉素。本发明工艺简单，可操作性强，回收率、纯度高。

权利要求

1.使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法，其特征在于包括以下步骤：a、由恩拉霉素粗品提取得含恩拉霉素提取液备用；

b、将大孔弱酸性阳离子树脂用足量甲醇浸泡后，去掉上层甲醇液体，再加入足量水，静置以备装柱；所述大孔弱酸性阳离子树脂为HD-2型；

c、将预处理的大孔弱酸性阳离子树脂装层析柱，使用pH8.0的1：1甲醇水过柱，平衡后待用；

d、将步骤a所述含恩拉霉素提取液调至pH8.0，再过滤，用上清液上柱；用1：1甲醇水溶液过柱，洗涤去除杂质；再用7：3甲醇水溶液过柱，收集洗脱液，浓缩，蒸干得到恩拉霉素产品。

2.根据权利要求1所述的使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法，其特征在于：步骤a所述的恩拉霉素粗品提取的方法为将恩拉霉素粗品加入pH3.0的1：1甲醇水适量，充分搅拌混合后静置，过滤，取上清液体作为提取液备用。

3.根据权利要求1所述的使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法，其特征在于：步骤d所述蒸干的温度不超过45℃。

说明书

使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法

技术领域

[0001] 本发明属于分离技术领域，涉及一种使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法。

背景技术

[0002] 抗生素发明以来，不仅在人类疾病的治疗和预防方面效果显著，同时在畜牧业饲料添加剂方面也发挥着巨大的作用。抗生素对动物的促生长作用是在20世纪40年代后期由Stocktadt等人发现，以后相继发现四环素类、大环内酯类、β-内酚胺类等抗生素加入饲料中，都有促进生长、增重、增产、提高饲料报酬作用。1950年美国FDA正式批准允许在饲料中添加抗生素。抗生素对于畜禽的生长和提高生产性能的作用是肯定的，而且很稳定，许多国家的畜禽业都长期应用抗生素添加剂。实践证明，合理地使用抗生素添加剂能促进畜禽生长，提高饲料转化率。同时也有报告显示，不允许在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生长剂的国家，会造成畜牧业生产成本增加，盈利减少，同时也有可能引发诸如生态环境及国家之间的贸易战等问题。但为了避免由于抗生素的滥用引起耐药菌株大量繁殖或使药物在畜产品中的残留量增大，对畜禽生长及人体健康造成直接危害，应用畜禽专用的抗生素饲料添加剂已迫在眉睫。由于恩拉霉素具有优良的促生长和改善饲料利用率的作用，因此被世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。

[0003] 恩拉霉素(Enramycin)，又名恩来霉素、恩霉素、安来霉素、持久霉素，是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious NO.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素，易溶于稀盐酸，微溶于水、甲醇、乙醇。市场上主要的来源是先灵葆雅公司的菌丝体预混剂。

[0004] 作为饲料添加剂恩拉霉素有如下优点：

[0005] 1.临床应用研究方面，与其他抗生素添加剂相比，用量少的情况下饲料系数更低，生长速度更快。2.药效学研究方面，恩拉霉素对主要的革兰氏阳性菌都具有强大的杀菌作用。恩拉霉素对乙肝病毒(HBV)抗原有较强的抑制作用，包括对乙肝e抗原(HBeAg)也有较好的抑制效果。恩拉霉素与临床上现有的抗生素或抗菌药之间不存在交叉耐药性。敏感菌几乎不对恩拉霉素产生耐药性，在实验条件下，耐药性的产生也非常缓慢，即使出现，耐药性也不稳定，而且极易丢失。3.药物残留研究方面，恩拉霉素内服极不易被吸收，药物主要通过粪便排出体外。4.毒理学研究方面，恩拉霉素毒性很低。急性毒性实验表明，恩拉霉素在口服、皮下或肌肉注射给药时实际无毒。5.恩拉霉素的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性。

[0006] 抗生素的提取主要有以下几种途径：

[0007] 有沉淀法、溶媒萃取法、吸附法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、膜分离技术、毛细管电泳、双水相技术、反胶束、超临界萃取等。其中膜分离技术、毛细管电泳、双水相技术、反胶束、超临界萃取等为近几年新开始应用的方法，成本高，没有较为成熟的工业化模式，大多在实验室小规模对个别品种进行探索。

[0008] 沉淀法、溶媒萃取法、吸附法等传统方法，由于活性炭和大多数溶媒不能很好的将杂质分离，得到的物质纯度不够，从而达不到分离提取要求的效果，目前大多应用于粗提，粗品预处理阶段，配合其他方法共同应用。高效液相色谱法中，大多通过使用预柱来排除部分相关杂质，预柱常因不能再生利用而造成耗损成本比较高。目前大多数抗生素品种在分离、提取、浓缩、纯化、脱色等方面广泛应用的是色谱法。

[0009] 中国发明专利申请《一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法》(200910032340.1)中记载用大孔吸附树脂安伯莱特XAD-4、安伯莱特XAD-16等来分离提取恩来霉素。大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果。同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过上述这种吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，近年来也广泛应用于中药、微生物的分离提取。但该发明方法对于菌丝体中恩拉霉素的产率只能控制在60％～71％，回收率较低，对于规模化工业生产耗损太多，含量检测方面也难满足准确度要求。

[0010] 离子交换色谱法应用到的离子交换树脂分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类，它们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。按照孔隙结构分凝胶型和大孔型两种，凡具有物理孔结构的称大孔型树脂。阳离子树脂又分为弱酸性和强酸性，其中弱酸性阳+离子树脂含弱酸性基团，如羧基-COOH，能在水中离解出H 而呈酸性。树脂离解后余下的负电基团，能与溶液中的其他阳离子吸附结合，从而产生阳离子交换作用。这种树脂的酸性即离解性较弱，但比强酸性树脂较易再生。但针对恩拉霉素，一般认为无法使用离子交换树脂纯化，主要使用吸附树脂(《饲料中恩拉霉素的微生物学含量测定方法研究》中国兽药杂志
2008，42(9)：17～21顾欣等)。本领域需要寻找更好的方法来分离提取恩拉霉素，提高回收率和纯度。

发明内容

[0011] 本发明所要解决的技术问题是为恩拉霉素的分离纯化提供一种有效的方法。解决该问题的技术方案是提供了一种使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法。本发明大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法的技术方案包括以下步骤：

[0012] a、由恩拉霉素粗品提取得含恩拉霉素提取液备用；

[0013] b、将大孔弱酸性阳离子树脂用足量甲醇浸泡后，去掉上层甲醇液体，再加入足量水，静置以备装柱；

[0014] c、将预处理的大孔弱酸性阳离子树脂装层析柱，使用pH 8.0的1∶1甲醇水过柱，平衡后待用；

[0015] d、将步骤a所述含恩拉霉素提取液调至pH 8.0，再过滤，用上清液上柱；用1∶1甲醇水溶液过柱，洗涤去除杂质；再用7∶3甲醇水溶液过柱，收集洗脱液，浓缩，蒸干得到恩拉霉素产品。

[0016] 其中，上述方法中所述大孔弱酸性阳离子树脂为HD-2型。

[0017] 其中，上述方法步骤a所述的恩拉霉素粗品提取的方法为将恩拉霉素粗品加入pH3.0的1∶1甲醇水适量，充分搅拌混合后静置，过滤，取上清液体作为提取液备用。

[0018] 其中，上述方法步骤d所述蒸干的温度不超过45℃。

[0019] 另，所述7∶3甲醇水是指体积比为70％甲醇和30％水的混合溶液，1∶1甲醇水同理可配制。

[0020] 其中，上述方法中所述调节pH值的物质为盐酸和氢氧化钠的水溶液。

[0021] 其中上述方法中，所述恩拉霉素粗品可为产恩拉霉素菌的菌丝体，也可为先灵葆雅公司市售的恩拉霉素菌丝体预混剂。

[0022] 本发明方法具体操作如下：

[0023] 恩拉霉素粗品提取：样品加入用调pH 3.0的甲醇水(1∶1)适量，充分搅拌混合后静置，过滤，取上清液体作为提取液备用；

[0024] 树脂预处理：将弱酸性阳离子树脂HD-2用甲醇浸泡后，去掉上层甲醇，再加入足量水，静置以备装柱；

[0025] 层析柱装柱及处理：将预处理的树脂装层析柱，使用pH 8.0的甲醇水(1∶1)过柱，平衡后待用。在整个装柱过程中，装柱的柱子不能干枯；

[0026] 分离纯化：将前述提取液用NaOH调至pH 8.0，再过滤后的上清液上柱，用甲醇水(1∶1)过柱，洗涤去除杂质；再用甲醇水(7∶3)过柱，收集洗脱液，浓缩，蒸干得到恩拉霉素产品。

[0027] 本发明分离提取恩拉霉素的主要是打破了常规，引入弱酸性阳离子树脂HD-2型进行恩拉霉素的纯化，并对该方法进行了优化，提取产物纯度均达到98％以上，回收率高达85％以上，适用于规模化工业生产，为本领域纯化恩拉霉素提供了一种新的选择。

[0028] 下面通过实施例对本发明进行具体描述。

具体实施方式

[0029] 本发明方法将大孔弱酸性阳离子树脂浸入足量的甲醇中，使充分活化，放置后，除去上层甲醇液体，加入足量的水，搅拌混合后装柱，用弱碱性的甲醇溶液过柱平衡。恩拉霉素菌丝体经乙醇水浴加热回流得到粗品，粗品与弱酸性的甲醇水溶液混合，搅拌，过滤，滤液调至弱碱性，再次过滤，取该滤液流经层析柱，发生吸附后，再用普通甲醇水洗去杂质，然后用水洗为中性，最后用适量的甲醇水洗脱，收集全部洗脱液，浓缩，蒸干后得产品恩拉霉素。

[0030] 上述方法中优选使用HD-2型阳离子树脂，优选使用甲醇水(1∶1)和甲醇水(7∶3)进行洗涤和洗脱。

[0031] 具体而言，本发明方法为：

[0032] 恩拉霉素粗品提取：样品加入用调pH 3.0的甲醇水(1∶1)适量，充分搅拌混合后静置，过滤，取上清液体作为提取液备用。调pH一般用浓盐酸和氢氧化钠。

[0033] 树脂预处理：将弱酸性阳离子树脂HD-2用甲醇浸泡后，去掉上层甲醇，再用加入甲醇同量水，静置20分钟以备装柱。

[0034] 层析柱装柱及处理：将预处理的树脂装层析柱，使用的pH 8.0的甲醇水(1∶1)过柱，流速0.4ml/min，平衡后待用。在整个装柱过程中，装柱的柱子不能干枯。

[0035] 分离纯化：将前述提取液用NaOH调至pH 8.0，再过滤后的上清液上柱，上柱流速0.5ml/min，用甲醇水(1∶1)过柱，流速0.4ml/min，洗涤去除杂质，再用甲醇水(7∶3)过柱，流速0.3ml/min，收集洗脱液，浓缩，蒸干得到恩拉霉素产品。

[0036] 详细实施过程及与现有方法的比较请见实施例。

[0037] 以下实例中使用的恩拉霉素粗品为先灵葆雅公司市售的恩拉霉素4％菌丝体预混剂。恩拉霉素标准品为先灵葆雅公司市售，纯度检测使用常规HPLC进行。大孔弱酸性阳离子树脂HD-2，河北沧恩化工生产。

[0038] 实施例一 用HD-2型阳离子树脂分离纯化恩拉霉素

[0039] 本实施例是移用的大孔吸附树脂上使用的条件。

[0040] 1、恩拉霉素粗品10g+50ml的50％甲醇水(pH 3.0)混合，搅拌，过滤，取上清液体作为提取液备用。

[0041] 2、分离纯化，本实施例是移用的大孔吸附树脂上使用的条件。

[0042] (1)树脂预处理：

[0043] HD-2型大孔弱酸性阳离子树脂浸入足量的甲醇中，缓缓搅拌，使充分混合，放置后，小心除去上层甲醇液体，加入足量的水，搅拌混合后，放置，备用。

[0044] (2)层析柱处理：

[0045] 选用1cmX20cm规格的层析柱，将预处理好的树脂装柱，在整个装柱过程中，使装柱的柱子不能干枯。使用25ml的pH 8.0碱性的甲醇水(1∶1)以0.4ml/min流速过柱，平衡后，待用。

[0046] (3)分离纯化：

[0047] 将提取液用NaOH液调至PH为碱性(pH＝8.0)过滤，取滤液以0.5ml/min速度流经过层析柱，再用适量的pH值8.0甲醇溶液(浓度为1∶1)流速以0.4ml/min过柱，洗涤去除杂质，然后用50ml的pH3.0甲醇溶液(浓度7∶3)以0.3ml/min流速过柱，收集全部洗脱液体，浓缩，蒸干后得产品恩拉霉素。经检测所得恩拉霉素回收率为73.1％，纯度为97.4％。

[0048] 实施例二 使用本发明方法用大孔弱酸性阳离子树脂HD-2分离纯化恩拉霉素[0049] 1、样品粗提

[0050] 恩拉霉素粗品130g+200ml(甲醇)+200mlH2O

[0051] 用浓盐酸HCl调pH 3.0充分搅拌120min后静置，过滤，取上清液体作为提取液备用。

[0052] 2、分离纯化，本实例是使用本发明方法进行中量纯化。

[0053] (1)树脂预处理：

[0054] 弱酸性阳离子树脂HD-2用甲醇浸泡60min后，去掉甲醇，再用水浸泡20min装柱。

[0055] (2)层析柱处理：

[0056] 选用1cmX20cm规格的层析柱，将预处理好的树脂装柱，在整个装柱过程中，使装柱的柱子不能干枯。使用25ml的pH 8.0的甲醇水(1∶1)以0.5ml/min流速过柱，平衡后，待用。

[0057] (3)分离纯化：

[0058] 将步骤1所得的提取液用NaOH调至pH 8.0，过滤后的上清以0.5ml/min上柱，