鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白共表达的重组酵母工程菌、其构建方法及应用

摘要

本发明公开了一种共表达鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白的重组酵母工程菌、其构建方法及应用。本发明的重组酵母工程菌株，其菌种保藏编号为：CGMCC5045。对工程菌进行大规模诱导，VP1表达量达到12g/L的水平。经SDS-PAGE及Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有鸡贫血病毒天然蛋白的生物学活性和抗原性。将重组蛋白制成重组抗原疫苗，免疫SPF鸡，实验结果表明：该鸡传染性贫血重组抗原疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得抗CAV攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。

权利要求

1.一种鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白共表达的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母（Pichia.pastoris）GS115工程菌株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC5045。

2.构建权利要求1所述的重组酵母工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）VP1、VP2基因的扩增

以鸡传染性病毒株CAV/M9905株基因为模板，设计特异性扩增引物，从已构建的插入CAV/M9905全基因的重组质粒中分别扩增出VP1、VP2基因，扩增得到的VP 1、VP2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示，扩增片段分别插入pPICZαB和pPICZαC载体中，分别扩增得到融合有α-factor信号肽基因序列的VP1、VP2基因片段；将扩增出的基因片段插入毕赤酵母表达载体pAO815中，分别构建成含有α-factor信号肽基因序列及VP1基因片段或含有α-factor信号肽基因序列及VP2基因片段的重组质粒，所述的CAV/M9905株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5016；

（2）利用体外构建多拷贝的方法，将CAV VP1、VP2基因共同构建到同一个载体pAO815上，使其实现共载体表达，两个基因在载体上各插入两个拷贝，得到酵母重组载体pAO815-2-VP1+VP2；

（3）酵母转化体的制备

获得的酵母重组载体pAO815-2-VP1+VP2转化毕赤酵母GS115，筛选得到稳定表达的高产菌株，并将其驯化为工程菌株。

3.权利要求1所述的重组酵母工程菌株在表达鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白中的应用。

说明书

鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白共表达的重组酵母工程菌、其构

建方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用基因工程技术构建的重组酵母基因工程菌株，特别涉及一种鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白共表达的重组酵母基因工程菌株，还涉及其构建方法，进一步涉及所表达的重组蛋白及其在研制新型抗鸡贫血病毒的重组抗原疫苗中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 鸡传染性贫血是由鸡贫血病毒(Chicken Anemia Virus，CAV)引起的，能够导致鸡体免疫抑制的重要的病毒病，以雏鸡再生障碍性贫血、全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血及伴随免疫抑制为特征，鸡传染性贫血严重危害着世界的养鸡业。随着该病近年来呈现的新的变化，如发病日龄升高，感染发病后死亡率升高，混合感染和继发感染严重等，使得对该病的防制越来越棘手，传统疫苗生产难度大，病毒弱化困难，而且致弱的病毒很容易返强，使其很难在生产中安全应用。

[0003] CAV基因组编码VP1、VP2和VP3三种蛋白，由于VP1和VP2蛋白在病毒刺激机体产生中和抗体方面具有重要作用，随着基因工程技术的发展，研究者们在探索利用基因工程技术来生产有效的CAV疫苗。人们利用大肠杆菌原核表达系统及杆状病毒和酿酒酵母等真核表达系统对VP1、VP2基因均进行了体外表达，Koch(1995)和Noteborn(1998)等人研究发现利用重组杆状病毒在昆虫细胞中共同表达VP1和VP2蛋白的细胞裂解物免疫鸡群，可以刺激机体产生具有中和活性的抗体，并且该抗体可以保护子代鸡免受CAV感染，但可能由于生产成本的问题，一直未见到该疫苗商品化的报道。国内的肖庆利等(2001)在家蚕中共同表达了VP1和VP2蛋白，并初步证实其可以诱导机体产生抗体。刘常军等(2003)构建了一株含CAV VP1、VP2基因的重组疱疹病毒，体内外的试验结果均表明重组病毒具有很好的稳定性，有望用来研制疫苗同时预防鸡马立克氏病和鸡贫血病。Noteborn等人(1998)在构建的质粒pCAV/E(Notebornet al.，1991)的基础上，在基因组的启动子/增强子区域引入突变，构建了突变的CAV基因组。转染细胞结果显示这些突变体可以获得有感染性的病毒，但是对鸡的T细胞的致病力明显降低，尤其是当启动子/增强子区域12bp的插入片段发生突变时，这种变化更为明显。这些突变的病毒在组织培养中是稳定的，也能够产生所需要的中和活性，因而可以作为疫苗株的候选株。国内的张恒(2003)构建了VP3基因缺失的CAV突变体，通过原核诱导表达试验证实突变可以抑制致病性蛋白VP3的生成，动物试验也证实这种突变体作为DNA疫苗来使用对鸡群具有一定的免疫保护作用，因而可以作为未来DNA疫苗研制的一个方向。但是由于表达产物或者不能刺激机体产生中和抗体，或者蛋白表达量低，要产生高滴度抗体需要多次加强免疫，因此，从经济的角度考虑，不适合用于大规模商业化生产。

[0004] 目前利用酵母表达系统开发鸡传染性贫血疫苗在国内外还未有报道，但是在理论上是完全可行的。酵母菌的培养简单、方便，所需培养基价格也较低，表达产物经过粗提即可应用。因此，用酵母表达生产的CIA重组抗原疫苗将有很好的前景。本实验室人员林欢将CAV VP1和VP2基因分别在毕赤酵母中进行了表达，但表达蛋白并未诱导良好的免疫反应，这是因为VP1和VP2只有依靠表达过程中的相互作用才可形成诱导中和抗体产生的中和表位；根据以上基础，本实验室人员陈绍平将林欢构建的pPIC9k-VP1和pPIC9k-VP2载体共同转化酵母宿主菌GS115，获得了共表达CAV VP1和VP2的重组酵母菌株，表达蛋白免疫原性较好，可以诱导产生CAV特异性抗体，但VP1蛋白在表达过程中只能获得部分分泌。本研究将VP1N端进行了缺失表达，通过体外构建方法，获得了同时包含多拷贝VP1和VP2基因的重组表达载体pAO815-VP1+VP2，转化GS115宿主菌后经表达验证，提高了VP1的分泌表达量。

[0005] 本项目所利用的甲醇酵母具有表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉等特点，使得利用该系统开发鸡贫血疫苗具有很好应用前景，而且在一个细胞内共表达VP1与VP2有利于产生具有生物活性的VP1蛋白。本申请所应用的疫苗具有上述价廉，生物活性好等优点，能够为防治当前流行的鸡贫血提供确实、有效的工具和手段，并可为防治禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。由于新型疫苗相对于传统疫苗具有更低的成本，这将为该疫苗的应用创造了一个很好的条件，投入应用后既能有效的防止疫病造成的损失，同时也降低了养殖成本。该疫苗的研制将创造更大的经济效益和社会效益。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题之一是提供一种可以共表达鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白的重组酵母工程菌株，其表达的VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，表达的VP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0007] 优选的，一种可以共表达鸡贫血病毒VP 1、VP2蛋白的重组酵母工程菌株，其特征在于所述菌株为重组巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)GS115工程菌株，该菌株(pAO815rCAVVPI-VP2/GS115)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5045，保藏日期为2011年7月8日；

[0008] 本发明所要解决的技术问题之二是提供所述的重组酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0009] (1)VP1和VP2基因的扩增

[0010] 以鸡传染性病毒株CAV/M9905株基因为模板，设计特异性扩增引物，从已构建的插入CAV/M9905全基因的重组质粒中分别扩增出VP1、VP2基因，扩增得到的VP1、VP2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示，扩增片段分别插入pPICZαB和pPICZαC载体中，分别扩增得到融合有α-factor信号肽基因序列的VP1、VP2基因片段；将扩增出的基因片段插入毕赤酵母表达载体pAO815中，分别构建成含有α-factor信号肽基因序列及VP1基因片段或含有α-factor信号肽基因序列及VP2基因片段的重组质粒，所述的CAV/M9905株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5016，保藏日期为2011年7月8日；

[0011] (2)利用体外构建多拷贝的方法，将CAV VP1和VP2基因共同构建到同一个载体pAO815上，使其实现共载体表达，两个基因在载体上各插入两个拷贝，得到酵母重组载体pAO815-2-VP1+VP2，载体构建流程图如图1所示；

[0012] (3)酵母转化体的制备

[0013] 获得的酵母重组载体pAO815-2-VP1+VP2转化毕赤酵母GS115，筛选得到稳定表达的高产菌株，并将其驯化为工程菌株。

[0014] 其中所述引物序列如下：

[0015] CAVP1Nd59F：5’AGCCTGCAGGTAGGCTACCGAACCCCCAG3’

[0016] CAVP1R：5’AGAGAATTCCTCGAGTTAGGGCTGCGTCCCCCAG3’

[0017] CAVP2F：5’AGCATCGATTATGCACGGGAACGGCGG 3’

[0018] CAVP2R：5’AGAGAATTCCTCGAGTTACACTATACGTACCGGGGC 3’

[0019] 其中，CAVP1Nd59F、CAVP1R用于扩增VP1基因片段；CAVP2F、CAVP2F用于扩增VP2基因片段；

[0020] 本发明所要解决的技术问题之三是提供所述的重组酵母工程菌株在表达鸡贫血病毒VP1、VP2蛋白中的应用。

[0021] 本发明所要解决的技术问题之四是提供所述的重组酵母基因工程菌株表达的鸡贫血病毒VP1、VP2重组蛋白，及其在制备预防鸡传染性贫血疫苗药物中的应用。

[0022] 本发明所要解决的技术问题之五是提供一种鸡传染性贫血重组抗原疫苗，其特征在于包含有效剂量的所述的重组蛋白和药学上可接受的载体。本发明的重组抗原疫苗可用于预防鸡传染性贫血药物的制备中。

[0023] 本发明相较于现有技术具有以下优点：

[0024] 1、本发明利用甲醇酵母作为转化受体菌，其表达产物活性高，生产规模容易放大，成本低廉，而且在一个细胞内共表达VP1与VP2蛋白有利于产生具有生物活性的VP1蛋白；

[0025] 2、VP1和VP2两个基因在pAO815载体上各插入两个拷贝，再电击转化毕赤酵母宿主菌GS115，从而达到提高基因拷贝数，进而提高蛋白表达量的目的；

[0026] 3、通过对VP1N端进行59个氨基酸的缺失表达，去除了VP1N端精氨酸富集区域，从而提高了VP1的分泌表达量，而这一缺失经验证并不会影响其中和表位的形成；

[0027] 4、对重组酵母菌株进行小规模诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株。对工程菌进行大规模诱导，VP1表达量达到12g/L的水平；

[0028] 5、经SDS-PAGE及Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有鸡贫血病毒天然蛋白的生物学活性和抗原性。

[0029] 本实验将重组蛋白制成重组抗原疫苗，免疫SPF鸡实验结果表明：该鸡传染性贫血重组抗原疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得抵抗CAV攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。此疫苗的研制成功将会加速新型基因工程疫苗替代传统疫苗的步伐，并将为鸡传染性贫血的防治带来新的技术手段。

[0030] 本申请所应用的疫苗具有上述价廉，生物活性好等优点，能够为防制当前流行的鸡贫血提供确实、有效的工具和手段，并可为防制禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。由于新型疫苗相对于传统疫苗具有更低的成本，这将为该疫苗的应用创造了一个很好的条件，投入应用后既能有效的防止疫病造成的损失，同时也降低了养殖成本。该疫苗的研制将创造更大的经济效益和社会效益。

附图说明

[0031] 图1为本发明的鸡贫血病毒VP1和VP2基因的载体构建图谱；

[0032] 图2为CAV VP1基因PCR扩增图；1.阴性对照；2.Marker DL2000；3.CAVVP1基因片段；

[0033] 图3为CAV VP2基因PCR扩增图；1.Marker DL2000；2.阴性对照；3.CAVVP2基因片段；

[0034] 图4为重组质粒pPIC9K-CAV VP1、pPIC9K-CAV VP2酶切鉴定结果；

[0035] 1：pAO815-VP2；2：pAO815-VP1；3：Marker 1kb DNA Ladder；4：MarkerDL2000；

[0036] 图5重组质粒pAO815-CAVP1+VP2和pAO815-2-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果；1：pAO815-2-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果；2：pAO815-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果；3、阴性对照；M：1kb Marker；

[0037] 图6为单克隆抗体与酵母表达的CAV VP1、CAV VP2蛋白的Western blot分析；1：预染Marker；2：CAV VP1；3：CAV VP2

[0038] 图7为真核表达蛋白与CAV VP1、CAV VP2单克隆抗血清的Dot-ELISA分析结果；1：CAV VP1；2：CAV VP2

[0039] 图8为ELISA抗体检测结果；

[0040] 图9为免疫鸡多克隆抗体与CAV感染的MDCC-MSB1细胞的IFA；

[0041] A：CAV VP1PcAB；B：阴性对照。

具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

[0043] 实施例1重组酵母工程菌株的构建

[0044] 1材料和方法

[0045] 1.1质粒、菌株、细胞：pBluemCAV重组质粒、抗CAV VP1单克隆抗体(MAb2F3)、抗CAV VP2单克隆抗体(MAbE11C9)由本实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH10F’由本实验室制作。毕赤酵母菌种GS 115和载体pAO815购自Invitrogen公司。CAV M9905病毒株由本实验室从13日龄发生贫血病肉仔鸡组织中分离得到，该菌株(M9905)现已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5016；pPICZαB和pPICZαC载体购买自Invitrogen公司；HRP标记兔抗鼠IgG抗体、FITC标记的兔抗鼠二抗购买自Sigma公司。MDCC-MSB1细胞由哈尔滨兽医研究所保藏。

[0046] 1.2试验试剂：ExTaq聚合酶，限制性内切酶BamHI、SaLI、EcoRI、NotI、SacI，Pyrobest DNA Polymerase，DNA Marker，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司，核酸凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司。其他试剂为分析纯。

[0047] 1.3仪器设备

[0048] 低温高速离心机CS-15RCentrifuge(BECKMAN)、PCR仪(Takara PCR Thermal cycler)、2301型电泳仪(KLB)、Imagemaster R VDS凝胶扫描仪(Pharmacia Biotech)、倒置显微镜(Nikon TS 100)、荧光显微镜(LEICAHC)、酶标仪Model-680(BIO-RAD)、二氧化碳培养箱(FORMA SCIENTIFIC)、生物安全柜(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、BIO-RAD(Serial NO.411BR 3336)电转仪、空气浴振荡器HZQ-C(哈尔滨市东明医疗仪器厂)。

[0049] 1.4CAV VP1基因及CAV VP2基因的克隆与表达

[0050] 1.4.1VP1、VP2基因引物设计

[0051] 引物的设计与合成：本实验室从13日龄发生贫血病肉仔鸡组织中分离到鸡贫血病病毒(CAV)，分离物能被已知CAV阳性血清所中和，并能利用PCR技术扩增出特异性寡聚核甘酸片段。分离物经70℃5min、50％氯仿15min处理后，可引起1日龄SPF雏鸡发生鸡传染性贫血，因此认为分离物是CAV(Chicken Anemia Virus)，并命名为CAV M9905，该菌株(M9905)现已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC 5016；构建插入CAV/M9905全基因的重组质粒pBluemCAV，根据测定的CAV M9905的基因全序列设计引物，扩增全长基因，所用方法具体参见文献：鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建。王晓燕，2007，中国农业科学院博士学位论文。

[0052] 1.4.2VP1、VP2基因各片段的获得

[0053] 根据已测定的CAV/M9905株的VP1和VP2基因序列，利用Oligo6.0分子生物学软件分别设计扩增引物，同时在引物中引入相应的限制性酶切位点(PstI/XhoI+EcoRI和ClaI/XhoI+EcoRI)，引物由上海英俊生物有限公司合成。

[0054] CAVP1Nd59F：5’AGCCTGCAGGTAGGCTACCGAACCCCCAG 3’

[0055] CAVP1R：5’AGAGAATTCCTCGAGTTAGGGCTGCGTCCCCCAG 3’

[0056] CAVP2F：5’AGCATCGATTATGCACGGGAACGGCGG 3’

[0057] CAVP2R：5’AGAGAATTCCTCGAGTTACACTATACGTACCGGGGC 3’

[0058] 以重组质粒pBluemCAV为模板，用VP1、VP2特异性引物扩增VP1、VP2基因。反应体系为：水70μL、10×PCR Buffer 10μL、dNTP Mixture 8μL、上、下游引物各4μL、Pyrobest DNA Polymerase 0.5μL、模板4μL。VP1反应条件为94℃预变性4min；94℃30s，56℃45s，72℃1.5min，30个循环；72℃延伸10min；VP2反应条件为94℃预变性4min；
94℃30s，57℃45s，72℃50s，30个循环；72℃延伸10min，反应结束后用华舜公司琼脂糖凝胶试剂盒回收PCR产物，按说明书操作，扩增得到的VP1、VP2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQID NO：4所示。

[0059] 1.4.3表达载体的构建

[0060] 将PCR回收的CAV-VP1Nd59和VP2基因片段分别用PstI/XhoI和ClaI/XhoI酶切，分别插入pPICZαB和pPICZαC载体中，经连接、转化后提取质粒，获得阳性克隆pPICZαB-VP 1Nd59和pPICZαC-VP2。分别以αFEcoR1U/CAVP1R和αFEcoR1U/CAVP2R为上下游引物扩增得到融合有α-factor信号肽的VP1和VP2基因。将回收的PCR产物与载体pAO815分别用EcoRI酶切，回收，用T4DNA连接酶于22℃连接过夜，然后转化E.coli DH10F’感受态细胞，提取质粒，以EcoRI酶切及PCR进行鉴定，并测序确证(北京英俊)，鉴定阳性克隆，获得重组质粒pAO815-VP1和pAO815-VP2。将CAVP2表达盒用BamHI和BglII切下，连于pAO815-VP1载体上，构建成为pAO815-VP1+VP2，再将CAVP1+VP2表达盒用BamH1和BglII切下，连于pAO815-VP1+VP2载体上，构建成为pAO815-2-VP1+VP2，此载体含有两个拷贝的(VP1+VP2)表达盒。

[0061] 1.4.4重组表达质粒的酶切鉴定

[0062] 用限制性内切酶EcoRI对重组表达质粒pAO815-VP1和pAO815-VP2进行双酶切。反应体系：ddH2O 14μL，10×Tango Buffer 2μL，EcoRI 0.5μL，NotI 0.5μL，待检质粒
3μL。混匀后至37℃水浴2小时，取10μL产物进行1％琼脂糖电泳，紫外投射仪上观察。
用限制性内切酶BamH1和BglII对重组表达质粒pAO815-VP1+VP2和pAO815-2-VP1+VP2进行双酶切鉴定。反应体系：ddH2O 13μL，10×Tango Buffer 2μL，限制性内切酶各1μL，待检质粒3μL。混匀后至37℃水浴2小时，取10μL产物进行1％琼脂糖电泳，紫外投射仪上观察。

[0063] 1.4.5酵母细胞的转化

[0064] 用限制性内切酶SalI对制备的重组表达质粒进行单酶切，酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀回收后，与毕赤酵母GS 115感受态细胞混合，用BIO-RAD(SerialNO.411BR3336)电转仪在参数为2.0kV、25μF、200Ω条件下进行电击，立即加入1ml预冷的1mol/L山梨醇，温浴后将内容物涂布于含100μg/ml G418抗性的YPDS平板，30℃培养3-7d。

[0065] 1.4.6重组质粒的真核表达

[0066] 将PCR鉴定阳性的酵母转化子接种于40ml BMGY培养基中，30℃300rpm培养至OD600为2-6时，1500g离心5min收集菌体，换10ml BMMY培养基继续培养4d，每隔24h取样并同时加入0.5％的甲醇。

[0067] 1.4.7重组酵母菌株的PCR筛选

[0068] 1.4.7.1重组酵母菌PCR鉴定引物的设计与合成

[0069] 根据目的基因插入两侧的表达载体核苷酸序列设计一对特异引物，并由上海博亚生物技术公司合成。引物序列为：

[0070] 5’AOX1引物：5’-gactggttccaattgagaagc-3’

[0071] 3’AOX1引物：5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’

[0072] 1.4.7.2重组酵母基因组DNA的提取

[0073] 取少量转化菌单个菌落培养物置Ep管中，加100μL灭菌水，100℃煮沸10min以消解酵母菌细胞壁，液氮冰冻30min，100℃煮沸10min，12000r/min离心10min，取上清液，即为重组酵母基因组DNA。

[0074] 1.4.7.3PCR扩增鉴定

[0075] 以重组酵母基因组DNA为模板，用特异引物对整合到巴斯德毕赤酵母X-33染色体DNA中的PoIL-2成熟蛋白基因进行PCR扩增，取5μL PCR扩增产物作1％琼脂糖凝胶电泳观察。PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL、25mmol/LMgCl2 3.0μL、5’AOX1引物(20pmol/μL)0.5μL、3’AOX1引物(20pmol/μL)0.5μL、Tap酶0.5μL、dNTP(10mmol/L)1.0μL、基因组DNA模板5.0μL，以灭菌水补体积至50μL。扩增反应条件：94℃5min；94℃0.5min、55℃0.5min、72℃2min，30个循环；72℃10min。

[0076] 1.4.8重组蛋白的Dot-ELISA检测

[0077] 取目的蛋白2μL在NC膜上，膜干燥后，用5％脱脂乳室温封闭1h，加入1∶500稀释的CAV VP1及CAV VP2的单克隆抗血清，以鸡的阴性血清做对照，室温作用1h，PBST洗4次，5min/次，加入1∶5000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，室温作用45min，PBST洗4次，5min/次，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色。

[0078] 1.4.9重组蛋白的免疫印迹试验

[0079] 目的蛋白电泳后，转至硝酸纤维素膜(NC)上，将膜封闭，加入1∶500稀释的CAV VP1单克隆抗体，轻轻摇动混匀，于37℃作用1h后，洗涤NC膜，将洗涤后的膜置于适量1∶5000稀释的HRP标记兔抗鼠IgG为二抗液中，室温作用37℃作用45min，洗涤NC膜3次，二氨基联苯胺(DAB)显色。

[0080] 2、结果

[0081] 2.1CAV VP1、CAV VP2基因的扩增

[0082] 以pBluemCAV为模板，分别用两对引物CAV VP1Nd59F、CAV VP1R和CAV VP2F、CAV VP2R进行PCR扩增后获得与预期大小一致的1173bp和650bp的DNA条带，结果如图2、3所示。

[0083] 2.2重组表达质粒的鉴定

[0084] 2.2.1重组表达质粒的酶切鉴定

[0085] 重组表达质粒pAO815-VP1和pAO815-VP2经EcoRI酶切鉴定，分别得到1446bp和924bp的条带，与预期结果一致，结果如图4所示。

[0086] 2.2.2重组表达质粒的序列测定与分析

[0087] 经测序分析，重组表达质粒的目的基因序列与CAV/M9905VP1、VP2基因序列完全一致，已正确地插入表达载体的读码框架中。以上PCR鉴定、酶切鉴定及序列分析结果表明，已成功构建了基因pAO815-VP1、pAO815-VP2的重组酵母表达质粒。

[0088] 2.2.3pAO815-2-VP1+VP2重组表达质粒的鉴定

[0089] 重组质粒pAO815-CAVP1+VP2和pAO815-2-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果；1：pAO815-2-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果：8764bp片段为2×(CAVP1+VP2)表达盒；2：
pAO815-CAVP1+VP2的酶切鉴定结果：4382bp片段为1×(CAVP1+VP2)表达盒；2400bp和
4000bp片段为载体自身酶切片段。3、阴性对照；M：1kb Marker(TAKARA)。图5所示。

[0090] 2.3重组酵母菌株的PCR筛选

[0091] 以His+转化子的基因组DNA为模板，用酵母5’AOX1和3’AOX1通用引物PCR验证目的DNA与酵母基因组整合情况，结果有11个转化子能扩增出1800bp和1100bp的片段，说明重组菌株中整合了VP1基因片段和VP2基因片段。

[0092] 2.4重组表达质粒的转化与鉴定

[0093] 2.4.1表达产物的Western blot分析

[0094] 以制备的MAbs为一抗，对表达的CAV VP1和CAV VP2蛋白进行Westernblot(如图6所示)分析，结果显示MAbs均可以与酵母表达的CAV VP1和VP2蛋白发生反应，与VP1和VP2相互作用形成的蛋白也有良好的反应。

[0095] 2.4.2表达产物的Dot-ELISA分析

[0096] 表达蛋白纯化后进行Dot-ELISA检测，CAV VP1、CAV VP2蛋白均可以被CAV单克隆抗体(抗CAV VP1单克隆抗体(MAb 2F3)、抗CAV VP2单克隆抗体(MAbE11C9))所识别，而与阴性鸡血清不发生反应。表明所表达的融合蛋白具有免疫反应活性(如图7所示)，表达的VP 1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，VP2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：3所示。

[0097] 实施例2重组蛋白免疫原性的检测

[0098] 1重组蛋白的表达量

[0099] 取破碎后的培养物，首先用紫外分光光度计测定蛋白浓度，浓度为48g/L，然后进行SDS-PAGE，用薄层凝胶扫描测定目的蛋白占总蛋白的百分含量为25％，因此目的蛋白的表达量为12g/L。

[0100] 1.1免疫动物

[0101] 鸡传染性贫血重组抗原疫苗的制备：将发酵菌体蛋白按VP 1含量用PBS(PH7.4)分别稀释至200μg/0.6ml、400μg/0.6ml、2000μg/0.6ml，与等体积法国佐剂((ISA50V2)购自SEPPIC公司)乳化。

[0102] 取1周龄SPF鸡50只，分5组，每组10只。1、2、3组为表达蛋白免疫组：1组免疫剂量为50μg/0.3ml/只，2组免疫剂量为100μg/0.3ml/只，3组免疫剂量为500μg/0.3ml/只；4组为常规灭活疫苗免疫组，常规灭活疫苗按照以下方法制备得到：以100LD50剂量对一日龄SPF雏鸡进行CAV攻毒，攻毒后11天进行剖杀，采取肝脏，对其进行研磨，以PBS为稀释液，将其稀释成10％悬乳液，加入0.2％甲醛37℃灭活48h，然后无菌条件下以白油佐剂进行乳化，制备成灭活疫苗，免疫剂量为0.3ml/只；免疫途径均为胸肌注射法；5组为非免疫对照组。各组免疫后定期采血，用ELISA和间接免疫荧光检测抗体，并于免疫后14天各组取5只以1000TCID50剂量攻击CAV/M9905病毒，攻毒后观察7天，剖杀，采集肝脏，提取DNA，PCR方法检测病毒。各组余下的5只仍每7天定期采血至56天，检测抗体。试验在负压隔离器(澳大利亚进口)中进行。

[0103] 1.2酶联免疫吸附试验(ELISA)

[0104] 用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的CAV全病毒以100μL/孔包被ELISA板，4℃过夜，用5％脱脂乳37℃封闭1h。然后用PBST(PBS含0.05％Tween-20)洗3遍，加入1∶100稀释的待检血清，37℃作用1h，PBST洗3遍，加入1∶5000稀释的HRP标记兔抗鼠IgG抗体，37℃作用1h，PBST洗4遍，加入OPD显色液，室温、避光显色10min，50μL/孔，2mol/L H2SO4终止，于490nm测定吸光值。

[0105] 1.3间接免疫荧光检测(Immunofluorence assay IFA)

[0106] 取1mL CAV感染的MDCC-MSB1细胞悬液于1.5mL EP管内，1000r/min，离心10min，沉淀细胞，将沉淀的细胞用pH 7.4PBS洗两遍。再用少量PBS将细胞均匀悬浮，然后涂于24孔板中央，待细胞干燥后，用冰冷的95％乙醇室温固定10min。固定后，倒掉乙醇，用PBS洗3遍，待细胞稍稍干燥后，加入1∶50、1∶100稀释的待检血清，37℃孵育1h，用PBS洗3遍，每次5min。稍稍干燥后，加入1∶100稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗，37℃，30min，用PBS洗5遍，每次5min，用甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察结果。

[0107] 2结果

[0108] 2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)

[0109] 疫苗免疫后7天即可检测到抗体阳性样品，免疫后14天抗体阳性率达到90％，免疫后21天达到100％，至免疫后56天抗体阳性率仍维持在100％(如图8所示)。

[0110] 2.2间接免疫荧光检测(Immunofluorence assay IFA)

[0111] 将试验中制备的血清分别用CAV/M9905株感染48h以后的MDCC-MSB1细胞涂片进行IFA检测，同时用非免疫鸡的血清做阴性对照，免疫重组蛋白后多抗血清对感染细胞呈现阳性反应，说明其可以与天然的病毒发生反应；阴性血清对照对感染细胞均呈现阳性反应。结果见图9。

[0112] 2.3病毒检测结果

[0113] 免疫后14天，各组鸡进行病毒感染，7天后剖杀，检测病毒，免疫组除50μg/只剂量组有1只鸡检测到有病毒感染外，其他鸡均未检测到病毒存在。非免疫对照组5只鸡均检测到病毒。

[0114] 实验结果表明：该鸡传染性贫血重组抗原疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得抗CAV攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。

[0115] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。