定制的分子印迹聚合物(MIP)单元

摘要

一种制备至少一个定制的MIP单元的方法，所述方法包括：(a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子；(b)将来自步骤(a)的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元；(c)通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的表面结合的可带电荷的基团；以及(d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的表面。

权利要求

1.一种制备至少一个定制的MIP单元的方法，所述方法包括以下步骤： （a）提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有表面，所述表面包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团，所述靶结合位点被配置为类似靶分子； （b）将来自所述步骤（a）的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元； （c）通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团；以及 （d）通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，

其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的所述表面，并且 其中所述第一溶剂具有分别产生相反极性的所述表面结合的可带电荷的基团和所述一个或多个模板分子的pH。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（c）包括

-移除非特异结合至被配置为类似靶分子的所述一个或多个结合位点的一个或多个模板分子，使得所述表面结合的可带电荷的基团暴露在所述表面上， -在所述钝化剂与所述表面结合的可带电荷的基团之间形成稳定的键。

3.根据权利要求1至2中的任一项所述的方法，其中所述键选自酯键和酰胺键。

4.根据权利要求1至2中的任一项所述的方法，其中通过在所述第一溶剂中在所述一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行所述步骤（a）和（b）。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述官能单体是甲基丙烯酸官能单体。

6.根据权利要求1至2中的任一项所述的方法，其中所述模板化合 物选自β阻滞药的组。

7.根据权利要求1至2中的任一项所述的方法，其中所述钝化剂选自重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰卤。

8.MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途，其中所述MIP单元是使用包括以下步骤的制备方法制备的： （a）提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有表面，所述表面包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团，所述靶结合位点被配置为类似靶分子； （b）将来自所述步骤（a）的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元； （c）通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团；以及 （d）通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，并且

其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的所述表面， 其中通过测量所述MIP单元在所述溶液中的团聚速率进行所述检测。

9.MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途，其中所述MIP单元是使用包括以下步骤的制备方法制备的： （a）提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有表面，所述表面包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团，所述靶结合位点被配置为类似靶分子； （b）将来自所述步骤（a）的所述一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使得所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元； （c）通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团；以及 （d）通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子，

其中所述钝化剂通过在所述第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至所述一个或多个单元的所述表面，并且 其中通过测量所述MIP单元的净有效电荷Zeff进行所述检测。

10.MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途，其中所述分子印迹聚合物（MIP）单元（200）具有表面(201)，所述表面(201)包括至少一个靶结合位点（201）和表面结合的可带电荷的基团（202）；所述靶结合位点（201）被配置为类似感兴趣的靶分子；其中表面结合的可带电荷的基团（202）的总量的至少80%位于所述至少一个靶结合位点（201）中以使与靶分子的静电相互作用能够发生在所述位点（201）中，并且 其中通过测量所述MIP单元在所述溶液中的团聚速率进行所述检测。

11.MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途，其中所述分子印迹聚合物（MIP）单元（200）具有表面(201)，所述表面(201)包括至少一个靶结合位点（201）和表面结合的可带电荷的基团（202）；所述靶结合位点（201）被配置为类似感兴趣的靶分子；其中表面结合的可带电荷的基团（202）的总量的至少80%位于所述至少一个靶结合位点（201）中以使与靶分子的静电相互作用能够发生在所述位点（201）中，并且 其中通过测量所述MIP单元的净有效电荷Zeff进行所述检测。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中表面结合的可带电荷的基团的总量的至少

90%位于所述至少一个靶结合位点中。

13.根据权利要求10或11所述的用途，其中表面结合的可带电荷的基团的总量的至少

95%位于所述至少一个靶结合位点中。

14.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述单元是直径在50nm至5μm范围内的粒子的形式。

15.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述单元是厚度在20nm至5μm范围内的膜的形式。

16.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志：荧光团、量子点和金纳米粒子。

说明书

定制的分子印迹聚合物(MIP)单元

技术领域

[0001] 本发明涉及分子印迹聚合物(MIP)单元，所述分子印迹聚合物(MIP)单元具有包括至少一个靶结合位点的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子，以及涉及用于制备所述分子印迹聚合物(MIP)单元的方法。

[0002] 本发明还涉及MIP单元用于检测溶液中的靶分子的用途。

[0003] 发明背景

[0004] 近来，在全世界范围内对于监测水质的关注增长。受到特别关注的领域是有害健康的化合物，如药剂、杀虫剂、毒素等向环境中的释放。这些化合物可能持续存在于地下水以及人类所接触的任何其它水中。

[0005] 对有害化合物的监测是至关重要的，以确保人们所接触的水是安全的并且不含可能导致健康问题的污染物。

[0006] 至今，存在数种检测技术，但是因为多种原因监测水中的化学污染物是困难的。例如，很多化合物以非常低的浓度存在，这使得检测困难。此外，检测灵敏度经常由于可能存在于环境浓缩物中的抑制性化合物而降低。结果，产生了很多假阳性信号。

[0007] 当前，在分子印迹聚合物(在下文称作MIP)领域中的研究正在加速。由于MIP特异性识别化合物如药物、激素、蛋白质等的能力，它吸引了大量关注。

[0008] 分子印迹是一种通用技术，它将识别特性引入至合成聚合物中。可以通过从官能单体的混合物在起模板作用的分析物的存在下合成高度交联的聚合物来制造MIP。在用溶剂萃取出分析物之后，分子印迹留在聚合物中，它可以识别相同的模板分子或其类似物。

[0009] MIP不像抗体那么特异，但是对于特异性靶标拥有高亲和性(例如，咖啡因或山梨糖醇，参见Feng，L.等，基于分子印迹的电合成聚合物用于测定山梨糖醇 的 生物 传 感 器(Biosensor for the determination of sorbitol based on molecularly imprinted electrosynthesized polymers)，生物传感器&生物电子学(Biosensors&Bioelectronics)，2004，19，1513-1519)，并且MIP通常对于类似的分子具有不可忽略的亲和性(例如，针对青霉素G(Penicillin G)制备的MIP不仅对于原始模板，并且也对其它相关的β-内酰胺抗生素显示高亲和性，参见Benito-Pena，E.等，用于分子印迹聚合物测定的荧光青霉素的分子工程(Molecular engineering of fluorescent penicillins for molecularly imprinted polymer assays)，Anal.Chem.(化学年报)，2006，78，2019-2027)。

[0010] 取决于应用，这可能是缺点，但是它也可能是优点。例如，如果有人考虑将基于MIP的传感系统应用于监测环境污染物，例如，饮用水中的药理学化合物，他不需要对于每种污染物制造不同的MIP，而仅需对每个污染物家族制造不同的MIP。

[0011] 现行的检测方案，如配合化学样品处理的层析法或电泳法，以及基于固相的萃取例如经由MIP是费时的并且不适合用于野外或在野外处应用。这些技术需要收集废水样品运送至实验室，在那里需要耗费劳力的萃取和分析以检测感兴趣的靶化合物的存在。

[0012] 此外，目前可得的MIP检测方案遇到很多假阳性信号产生的困难，特别是在通过非共价印迹制备MIP的情况下。

[0013] 从而，在本领域对于提供用于感兴趣的靶分子，例如水中存在的污染物和其它环境浓缩物的检测的替代方法存在需求。这种方法应该是方便的、廉价的并且在相当程度上避免假阳性信号的产生。更具体地，这种方法应该能够在其实际环境中检测靶分子；即在发现它们的环境中；例如地下水或废水。

[0014] 发明概述

[0015] 本发明的一个目标是满足上述需求并提供能够特异地并且选择性地在其自然环境中检测感兴趣的靶分子的MIP单元。

[0016] 本发明的这个和其它目标通过根据所附权利要求所述的分子印迹聚合物(MIP)单元实现。

[0017] 因而，在第一方面本发明涉及一种分子印迹聚合物(MIP)单元，所述单元具有包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团的表面。靶结合位点被配置为类似感兴趣的靶分子。

[0018] 表面结合的可带电荷的基团总量的至少80％位于至少一个靶结合位点中，使得与靶分子的静电相互作用能够发生在所述位点中。

[0019] 本发明的MIP单元包括至少一个靶结合位点，所述位点被配置为类似靶分子；即所述位点在其尺寸和形状方面与感兴趣的靶标互补。

[0020] 存在数个因素影响靶标与MIP单元之间相互作用。首先，靶结合位点的形状和尺寸应该匹配靶分子的形状和尺寸。此外，疏水相互作用增强在靶结合位点中与靶分子的相互作用。因为靶分子经常是带电荷的实体，在靶分子要结合的位点中可带电荷的基团的存在允许在这些位点处能够发生静电相互作用，使得更进一步提高了靶标-聚合物相互作用。

[0021] 从而，需要将表面电荷；即存在的表面结合的可带电荷的基团，定位至靶结合位点，同时减少在非印迹位点处和MIP单元表面上的其它位点处存在的可带电荷的基团。

[0022] 在MIP的制备过程中，特别是通过非共价印迹方法，通常形成很多印迹位点。这些印迹位点中的一些是“假”靶结合位点，即在尺寸和形状上不与感兴趣的靶标互补的印迹位点。归因于在这种“假”位点上和还在MIP单元的表面的非印迹部分上的表面结合的可带电荷基团的存在，靶分子仍能结合至该MIP单元，但导致高比例的假阳性信号。这种非特异结合使得难以确定所吸附的分子是否真正是靶向的那一个。

[0023] 表面结合的可带电荷基团典型地由印迹过程中所使用的官能单体的质子化或去质子化产生。

[0024] 在本发明的MIP单元中，表面结合的可带电荷基团的总量的至少80％位于能够使与靶分子的静电相互作用在这样的一个或多个位点中发生的至少一个靶结合位点中。

[0025] 典型地，表面结合的可带电荷基团的总量的至少90％，例如至少95％位于这样的靶结合位点中。

[0026] 从而，靶分子被结合在“正确的”印迹位点，即被配置为类似靶分子的靶结合位点并且因此减少了假阳性信号的产生。因此，根据本发明的MIP单元是稳定的、稳健的和靶标特异的。

[0027] 根据本发明的MIP单元可以以具有50nm至5μm范围内的直径的粒子的形式存在。

[0028] 可以根据所使用的特异检测技术而改变粒子的尺寸。

[0029] 尺寸小于50nm的粒子通常含有非常少的靶结合位点并且可能难以制备。

[0030] 根据本发明的MIP单元也可以是厚度在20nm至20μm范围内的膜的形式。

[0031] 可以将这样的膜应用至例如叉指(interdigitated finger)形式的(微)电极。在靶标结合时，可以观察并探测到电容的变化。

[0032] 厚度在上述范围内的膜是合适的。当膜的厚度小于20nm时，所述膜可能由于聚合物表面相互作用而导致变形，例如由于聚合物链的钉扎(pinning)。相反，膜厚超过20μm是不实用的，因为靶标向膜内部的渗透比较慢，并且导致靶结合位点的占用减少。

[0033] 在备选实施方案中，MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志(identity tag)：荧光团、量子点和金纳米粒子。

[0034] 如果检测在混浊样品中进行；即包含大量其它非印迹背景信号粒子的样品，这些实施方案是适合使用的。

[0035] 在另一方面，本发明涉及根据上面所述的MIP单元用于检测溶液中靶分子的用途。

[0036] 因此，根据上面所述的至少一个MIP单元与可能包含感兴趣的靶分子的溶液接触。

[0037] 本发明人已经发现这可以通过测量上述MIP单元在溶液中的团聚速率来获得。

[0038] 在根据本发明的MIP单元中，在给定pH下粒子的有效电荷状态将主要可以通过印迹位点的数目来确定。这归因于表面结合的可带电荷基团在靶结合位点中的定位，而余下的粒子表面(即非印迹位点和非特异性印迹位点)基本上保持不带电荷。

[0039] 从而，在与靶分子结合时，MIP单元立即将具有接近于0的有效电荷Zeff。这对团聚速率有影响，因为基本上不带电荷的MIP单元将开始聚集。

[0040] 因此可以使用团聚速率作为所结合的靶分子的量的量度。使用团聚检测与MIP单元的结合事件本身是独特的并且在数个方面优于其它检测方案。

[0041] 团聚直接与结合事件相关。如果模板化合物没有结合，MIP单元将不团聚。

[0042] 如上所述，当检测在混浊样品中进行时，存在“干扰”粒子的数种信号，并且这些可能干扰本发明的MIP单元并且引起过度的聚集。在这样的情况下，使用识别标签是高度有利的，例如荧光团、量子点、金纳米粒子以定位特异性结合事件。

[0043] 在备选的实施方案中，对溶液中靶分子的检测可以通过测量MIP单元的净有效电荷Zeff进行。

[0044] 如在上文中提到的，当靶分子结合至本发明的MIP单元时，它们的净有效电荷Zeff将改变至接近于0的Zeff。从而，通过简单地测量Zeff，即使不发生任何团聚，也能够检测到所感兴趣的靶分子的存在。

[0045] 可以使用本发明的MIP单元在野外，即在通常会发现它们的环境中特异地并且选择性地检测所感兴趣的靶分子。

[0046] 在再另一个方面，本发明涉及制备具有上述特征的定制的MIP单元的方法。

[0047] 本发明人已经发现关于所论述的对靶标的非特异结合改进分子印迹的一个方法是，有效地封闭在MIP制备过程中形成的非特异性印迹位点。这可以通过减少在这些位点上以及在非印迹位点上存在的表面结合的可带电荷基团来实现，以使靶分子结合至“正确的”靶结合位点。

[0048] 根据本发明的方法包括：

[0049] (a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个靶结合位点和表面结合的可带电荷的基团的表面，所述靶结合位点被配置为类似靶分子，

[0050] (b)使来自步骤(a)的一个或多个MIP单元在第一溶剂中与至少一个模板分子接触，使得一个或多个模板分子结合至所述一个或多个MIP单元，

[0051] (c)通过加入钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的所述表面结合的可带电荷的基团，

[0052] (d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子。

[0053] 钝化剂通过在第二溶剂中的冲洗时保持稳定的键结合至一个或多个单元表面。

[0054] 从而，产生了主要在正确的一个或多个靶结合位点中的包含可带电荷基团的MIP单元。本发明的方法简单、廉价并且使得能够大量生产具有在靶结合位点内定位的表面结合的可带电荷的基团的定制的MIP单元。

[0055] MIP单元在第一溶剂中与模板分子接触。在一些实施方案中，第一溶剂具有的pH分别产生相反极性的表面结合的可带电荷基团与一个或多个模板分子，使得模板分子可以通过静电相互作用结合至该单元。从而，模板分子将特异性地(即在靶结合位点中)并且同时非特异性地结合在MIP单元表面上。从而在步骤(b)中形成了被模板分子占据的MIP单元。

[0056] 为了移除在没有被配置为类似感兴趣的靶标的位点处，以及在MIP单元表面上的非印迹位点处的非特异性结合，钝化步骤，即步骤(c)包括

[0057] -移除没有特异性地结合至被配置为类似靶分子的一个或多个结合位点的一个或多个模板分子，以使表面结合的可带电荷基团暴露在所述表面上，

[0058] -在钝化剂与表面结合的可带电荷基团之间形成稳定的键。

[0059] 钝化剂将与非特异性地结合至表面的模板分子竞争，以使这些分子在与钝化剂的接触中被移除。然而，将不移除在正确的靶结合位点中结合的模板分子，因为在由于在这些空穴中的尺寸和形状的互补性、静电相互作用和疏水相互作用它们保持结合。

[0060] 在加入钝化剂时，表面结合的可带电荷基团变得暴露在MIP单元的表面上。

[0061] 钝化剂能够与这些暴露的表面结合的可带电荷基团形成未定的键并且这些键即使在用第二溶剂冲洗而洗脱模板之后仍保持对水解稳定。

[0062] 例如，这样的键可以选自酯键和酰胺键的组。

[0063] 通常在模板和交联剂的存在下聚合官能单体典型地提供具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点的MIP单元。

[0064] 在本发明的实施方案中，可以在第一溶剂中通过在一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行步骤(a)和步骤(b)。在这种情况下，当官能单体在第一溶剂中并且在模板分子的存在下聚合时，形成了MIP单元。

[0065] 在一些实施方案中，官能单体是甲基丙烯酸官能单体，例如甲基丙烯酸。这种单体是合适的因为它们的羧基是普通的氢键结合并且是分子印迹中的酸性官能团。

[0066] 如果使用甲基丙烯酸单体，模板化合物可以选自以下各项的组：β阻滞药，例如普萘洛尔和倍他洛尔。

[0067] 与上述单体和β阻滞药一起使用的合适的钝化剂是重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰卤。

[0068] 本发明的这些和其它方面从下文描述的实施方案将变得显而易见来，并将参考所述实施方案进行阐述。

[0069] 附图简述

[0070] 图1图解了用于分子非共价印迹的一般方法。

[0071] 图2图解了根据本发明的MIP单元。

[0072] 图3图解了pH对团聚速率的依赖性。

[0073] 图4图解了本发明的MIP单元的团聚速率以及在团聚之后超声波处理的作用。

[0074] 图5图解了在非印迹聚合物(NIP)单元的情况下缺少团聚。

[0075] 图6a图解了当使用不同浓度的普萘洛尔作为靶分子时的团聚速率。

[0076] 图6b图解了当使用不同浓度的倍他洛尔作为靶分子时的团聚速率。

[0077] 图7显示了本发明的MIP单元区分不同手性的靶分子的能力。

[0078] 图8图解了测量团聚速率的静态光散射方法。

[0079] 发明详述

[0080] 在图1中，描述了非共价印迹的一般方法步骤。官能单体100与至少一个模板分子101混合，所述模板分子101类似至少一个感兴趣的靶分子。

[0081] 可以使用交联剂102控制聚合物基质的形态、稳定结合位点并且提供机械稳定性。合适的交联剂取决于用于印迹的单体，并且是本领域技术人员已知的。

[0082] 官能单体100基于非共价相互作用，如氢键、离子键和疏水相互作用将其自身排列在模板分子101周围。

[0083] 在聚合之后，将模板分子101通过在溶剂中冲洗而洗脱，并将分子印迹103留在聚合物中，所述印迹能够识别相同的模板分子101或其类似物。从而，所得到的印迹聚合物拥有对于模板分子103永久的“记忆”，能够使MIP结合与模板密切相关的靶标化合物。

[0084] 根据经验，已经发现特异性随着聚合物与靶标上的结合“中心”之间键的数目增加。这可以用模板分子101不同侧面的不同形状来说明。

[0085] 非共价印迹方法是有吸引力的，因为它简单并且可以应用于大数量的模板。此外，可以在温和条件下容易地将模板从聚合物移除。

[0086] 然而，非共价印迹带有的一个缺点是产生这样的印迹位点，所述印迹位点可能充当“假”靶结合位点并结合靶分子的印迹位点，尽管在尺寸和形状上并不互补。这种非特异性结合使得难以确定所吸附的分子是否真正是被靶向的那一个。假阳性信号的产生(至少部分地)取决于MIP单元上表面结合的可带电荷的基团的存在。这种表面结合的可带电荷的基团在溶液中容易变得带电荷并且静电吸引极性相反的靶标化合物。

[0087] 从而，需要将表面结合的可带电荷基团定位至MIP单元上正确的靶结合位点；即被配置为类似所感兴趣的靶分子的位点。这样，增强了MIP-靶标相互作用并且MIP单元变得更有选择性。

[0088] 如本文使用的，术语“(多个)可带电荷的基团”意指当遇到分别导致官能团的去质子化或质子化的溶剂或缓冲溶液时，成为带电荷基团的官能团。

[0089] 这种可带电荷官能团的实例是羧基和氨基。

[0090] 图2中图解了根据本发明的MIP粒子200。MIP粒子200具有包括至少一个靶结合位点202和表面结合的可带电荷基团203的表面201。在该情况下，可带电荷基团是可带负电荷基团。靶结合位点202被配置为类似靶分子204。

[0091] 如本文所使用的，术语“被配置为类似靶分子”意指靶结合位点基本上在尺寸和形状上与感兴趣的靶分子互补。从而，靶结合位点可以结合与印迹过程中所使用的模板分子相同的模板分子或者与使用的模板密切相关的靶标化合物。

[0092] 表面结合的可带电荷基团203的总量的至少80％位于至少一个靶结合位点202中，使得与靶分子的静电相互作用发生在所述位点202中。

[0093] 通常在非共价印迹过程中，形成非特异性的，即与感兴趣的靶标在尺寸和形状上不互补的印迹位点205。表面结合的可带电荷基团203在这些位点以及在非印迹位点上的存在可以导致由于与靶分子的非特异性相互作用引起的假阳性结合信号。

[0094] 因此需要将存在的表面结合的可带电荷基团203集中至一个或多个靶结合位点202，所述靶结合位点202被配置为类似感兴趣的靶标。

[0095] 在根据本发明的MIP粒子中，表面结合的可带电荷基团203的总量的至少80％，优选地至少90％，例如至少95％位于至少一个靶结合位点202中。从而，增强了与靶分子的相互作用，并且这是在这种位点202中在形状和尺寸两者上的相似性、静电相互作用和疏水相互作用的结果。

[0096] 在非印迹部分和不拥有靶结合位点202的选择性特性的印迹位点205上少量存在的表面可带电荷基团203将不会在相当程度上被靶分子所占据。从而，提高了本发明的MIP粒子200的检测灵敏度并且减少了假信号的产生。

[0097] 应该注意可带电荷基团也可以在该粒子内部存在；即在聚合网络的孔中，但是这些通常不易接近靶分子。

[0098] 根据本发明的MIP单元可以是粒子或膜的形式。

[0099] MIP粒子可以以任意形状存在，但是通常是直径为至多10μm，例如直径在50nm至5μm的范围内，例如在50nm至1，5μm的范围内的球形。

[0100] 粒子的尺寸可以根据所使用的特异性检测技术而变化。如果检测技术需要粒子在水中混沌地移动，如光子相关光谱法所需要的，那么重要的是粒子不沉淀。在上述直径范围内的粒子即使在数小时之后也不沉淀。

[0101] 此外，具有低于50nm尺寸的粒子通常含有非常少的靶结合位点(对于低分子量模板分子，靶结合位点与聚合物的重量的重量比大约在1∶1000至1∶100的范围内)并且通常难以制备。

[0102] 根据本发明MIP单元也可以是厚度在20nm至20μm范围内的膜。

[0103] 可以将这样的膜应用至例如叉指形式的(微)电极。在靶标结合时，可以观察并检测到电容的变化。

[0104] 公知的是电容改变或者与固定的电荷变化或者与固定的偶极矩变化有关。在本发明的情况下，靶标结合将导致电荷数的降低并且从而，印迹膜的电容将改变。

[0105] 厚度在上述范围内的膜是合适的。当膜的厚度小于20nm时，该膜可能由于聚合物表面相互作用而导致变形，例如由于聚合物链的钉扎导致。相反，膜厚超过20μm是不实用的，因为靶标向膜内部的渗透比较慢，并且导致靶结合位点的占用减少。

[0106] 在备选实施方案中，MIP单元还包括选自包括以下各项的组的识别标志：荧光团、量子点和金纳米粒子(没有显示)。

[0107] 如果检测在混浊样品中进行，即包含大量背景信号粒子的样品，这些实施方案是适合使用的。

[0108] 在又另一方面，本发明涉及根据上面所述的MIP单元用于检测溶液中靶分子的用途。

[0109] 该检测可以是定性的或定量的；即本发明不仅能够测定感兴趣的靶分子的存在，也能测定溶液中靶分子的浓度。

[0110] 本发明人已经发现这可以通过测量溶液中的上述MIP单元的团聚速率来实现。

[0111] 决定胶体溶液稳定性的主要物理和化学参数是公知的(参见，例如Robert J.Hunter，胶体科学基础(Foundations of colloid Science)，vol.I，Clarendon Press，1995，ISBN 0 19 855187 8)并且将仅简要描述。胶体溶液中纳米或微米粒子由于与流体分子的相互作用而混沌地移动(所谓的布朗运动(Brownian motion))。布朗运动导致粒子之间的碰撞。

[0112] 粒子间会遇率(intra particle encounter rate)(碰撞的频率)随粒子浓度的增加而增加但是随粒子尺寸的增加而降低。在这种碰撞的过程中粒子之间的距离随有效离子电荷的减少并随溶液离子强度的增加而降低。在碰撞过程中粒子彼此越接近，它们将彼此结合的可能性越高。

[0113] 在这样的碰撞过程中，如果粒子彼此结合，它们保持结合一段时间，在那之后它们可能再次分开。如果它们结合在一起的时间短于之后用于再次相遇的时间，悬浮液将是稳定的。然而如果两个纳米粒子保持彼此结合的时间足够长，那么下一个粒子可能与这个小团簇碰撞，并与其结合。团簇将因此生长，即，悬浮液中的粒子将团聚，并且该胶体溶液将变得不稳定。

[0114] 因而，团聚速率取决于粒子彼此结合的强度以及会遇率。

[0115] 本发明人已经发现结合强度和会遇率极大地取决于MIP单元的靶结合位点的电荷以及模板分子的电荷。

[0116] 当靶分子与MIP极性相反时，吸附显著地增强并且包含结合了的靶分子的MIP单元将被中和。这使得基本上不带电荷的MIP粒子由于接近的粒子间缔合的更高概率而开始团聚。

[0117] 也可以通过改变用于进行团聚的溶液的pH来控制团聚速率。

[0118] 如图3中所示，团聚的开始是与pH依赖性的。可以选择pH以使由于在这些位点中存在的官能单体残基的去质子化或质子化导致在一个或多个靶结合位点中形成可带电荷基团。同时(Simulateneously)，模板分子在这个pH下应该质子化或去质子化以使模板分子的极性与结合位点的极性相反。

[0119] 在图3中，使用普萘洛尔作为模板并且MIP单元，即MIP粒子由甲基丙烯酸形成，即可带电荷基团表现为羧基。因为羧基的pKa大约为4并且普萘洛尔的pKa大约为9，这两个实体在大约6的pH下都将带电荷；即羧基将去质子化，并且普萘洛尔将质子化。从而，由于靶分子的吸附而发生团聚。

[0120] 在足够高的pH(图3中的pH 12)MAA完全去质子化并且带有负电荷。这使得MIP粒子彼此排斥形成稳定的胶体溶液。同时，在pH 12下普萘洛尔作为中性化合物存在，因此对带负电荷的MIP粒子结合位点具有低结合强度。整体作用是不管普萘洛尔在样品中存在还是不存在，粒子将不会团聚。

[0121] 在低pH(图3中的pH 2.5)下，因为MAA的羧基质子化而导致不带净电荷，MIP粒子是中性的。该中性粒子不结合普萘洛尔，即使后者带有净正电荷。

[0122] 从而，在pH 2.5和pH 12下，MIP粒子的靶结合位点与靶标化合物之间没有静电相互作用存在，并且因此没有团聚发生。

[0123] 然而，如在pH 6.0下可以观察到的，团聚速率是相当快的，因为MIP粒子的靶结合位点和靶标化合物两者都带电荷。靶标化合物的吸附增强并且这可以通过团聚而被检测到。

[0124] 因此，可能将团聚的开始作为靶标摄取的函数来调节，并且可以在相对少量的靶标摄取下实现对团聚的诱导。这使得能够将检测限推进到更低的靶标浓度。

[0125] 在根据本发明的MIP单元中，在给定pH下该单元的有效电荷状态将主要由靶结合位点的数量决定。这是由于靶结合位点中表面结合的可带电荷基团的定位所导致的，而剩下的粒子表面(即非印迹位点和非特异性印迹位点)保持基本不带电荷。

[0126] 从而，在与靶分子结合时，MIP单元将具有接近于0的净有效电荷Zeff。这对于团聚速率有影响，因为基本上不带电荷的MIP粒子将开始聚集。

[0127] 因此，可以通过简单地测量一个或多个MIP单元的净有效电荷Zeff检测靶分子的吸附。当Zeff下降或增加时(取决于带电荷基团的极性)，这可能是已经吸附了靶分子的指示。例如可以通过监测Z电位检测净有效电荷。

[0128] 当MIP单元是膜或者溶液中悬浮的粒子时，这个检测方案是合适的。

[0129] 当可以测定靶分子和MIP单元的电荷状态时，可能选择其中使两者都带电荷的pH区间，以便测定团聚速率或Zeff的变化。

[0130] 图4中进一步图解了团聚的诱导。这里，0.2mg/ml浓度下的MIP单元，即MIP粒子暴露至1.25mM浓度下的R-普萘洛尔并且聚集的MIP粒子尺寸的变化是显著的。

[0131] 当粒子达到1200nm的尺寸时，对它们进行超声处理约45分钟。在超声处理之后，重复试验并观察到相同的团聚模式(由图4中的三角形曲线图解)。这证明本发明的MIP粒子是可再现的并且可以用可控的方式监测。

[0132] 相反，非印迹粒子和模板分子(图5)接触基本上不团聚。

[0133] 在MIP单元制备过程中使用的模板分子可以选自包括以下各项的组：药品、激素、酶、抗体、受体、核酸、病毒、细胞、组织、杀虫剂和包括蛋白质的任意其它材料。

[0134] 通常使用β阻滞药，特别是普萘洛尔和倍他洛尔作为在印迹过程中的模板分子。

[0135] 本发明人已经测定在不同的普萘洛尔和倍他洛尔浓度下的团聚速率。

[0136] 如图6a和6b中所示，将0.02mg/ml浓度的MIP单元，即MIP粒子暴露在不同的(s)-普萘洛尔浓度下，并且在更高的普萘洛尔和倍他洛尔浓度下团聚速率显著增加。

[0137] β阻滞药，例如普萘洛尔或倍他洛尔的浓度典型在0.05至2.5mM的范围内。

[0138] 至多达0.2mg/ml的浓度下的MIP粒子适合用于团聚测定。

[0139] 也可以将本发明的MIP单元设计为评估印迹聚合物的手性。这不是一个普通的任务，它经常需要复杂的实验。

[0140] 在吸附正确手性的靶分子时，本发明的MIP粒子开始团聚，但是将不吸附“错误”手性的靶标，并且因此将不会发生团聚。这在图7中阐明，其中0.02mg/ml浓度的MIP单元，即MIP粒子分别暴露于(s)-普萘洛尔和(r)-普萘洛尔，并且仅有(s)-普萘洛尔由MIP粒子所吸附。即使在低模板分子浓度(在这个具体实施例中为0.025mM)下这也会发生。

[0141] 在高分析物浓度下该性质消失，因为存在大量的“低质量”印迹位点并且这些位点不拥有手性识别能力。

[0142] 通过简单地改变分析物的浓度区分手性与非手性位点的能力简化了印迹优化。这也使得人们能够简单地评价药品的分离质量，其中这种性质极为重要。

[0143] 可以通过例如光子相关光谱(PCS)和静态光散射监测团聚速率。

[0144] 当本发明的MIP单元包含识别标志时，这些MIP单元可能发荧光并且发出光，并且当团聚体生长时，所发射的光强，即团聚体点，变得更亮。这种识别标志也可以帮助在悬浮液中将MIP粒子与其它粒子区分开，例如在Z电位测量过程中。

[0145] Z电位测量也可以适合于更大MIP粒子的检测，以及当MIP单元是膜的形式时。

[0146] 应该注意可以将本发明的MIP单元，以及作为用于测量靶标吸附的手段的团聚速率，应用于很多情况；即它在任何情况下都不限定于废水污染物的检测。

[0147] 本发明人也已经开发了一种用于制备具有上述特征的定制的MIP单元的方法。

[0148] 这个方法包括：

[0149] (a)提供至少一个MIP单元，所述MIP单元具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点和表面结合的可带电荷基团的表面，

[0150] (b)使来自步骤(a)的一个或多个MIP单元与至少一个模板分子在第一溶剂中接触，使所述一个或多个模板分子能够结合至所述一个或多个MIP单元，

[0151] (c)通过添加钝化剂钝化所述一个或多个MIP单元上的表面结合的可带电荷基团，

[0152] (d)通过在第二溶剂中冲洗移除所述一个或多个模板分子。

[0153] 钝化剂通过键结合至所述一个或多个单元的表面，所述键在第二溶剂中的冲洗时保持稳定。

[0154] 如本文使用的术语“钝化”意指除去可能引起非特异性结合的表面结合的可带电荷的基团；即将不希望有的可带电荷基团转化为对水解稳定的不带电基团。

[0155] 从而，根据本发明的方法从一开始就使得能够制备可以主要在靶结合位点中带电荷的MIP单元。

[0156] 本发明的方法是简单的、不昂贵的并且能够大量生产具有在靶结合位点中定位的表面结合的可带电荷基团的定制的MIP单元。

[0157] 第一溶剂通常具有分别产生相反极性的表面结合的可带电荷基团和一个或多个模板分子的pH。从而，MIP单元将通过静电相互作用的方式结合至模板分子。

[0158] 通过在模板和交联剂的存在下聚合官能单体典型地提供具有包括至少一个被配置为类似靶分子的靶结合位点的表面的MIP单元。

[0159] 在本发明的实施方案中，可以通过在第一溶剂中在一个或多个模板分子的存在下聚合官能单体同时进行步骤(a)和步骤(b)。在该情况下，当官能单体在第一溶剂中并且在模板分子的存在下聚合时，形成MIP单元。

[0160] 通过实施例的方式，下面的图解阐述了当官能单体甲基丙烯酸和模板分子普萘洛尔在合适的溶剂中混合时，它们产生相反的极性。

[0161]

[0162] 图解1：甲基丙烯酸(MAA)和普萘洛尔的表面电荷的产生

[0163] 在第一溶剂中在普萘洛尔的存在下聚合MAA单体。第一溶剂具有产生相反极性的MAA单体(带负电荷)和普萘洛尔(带正电荷)的pH。

[0164] 通过将pH调整为大于MAA的羧基的pKa的pH，将聚合物中大部分的羧基去质子化。在该情况下，如果羧基的pKa是4.0，pH为6.0。相反，普萘洛尔在该pH下将带有正电荷(大约9的pKa)。

[0165] 例如，溶剂可以包括混合有有机组分，例如乙腈或乙醇的柠檬酸、乙酸盐或磷酸缓冲溶液。

[0166] 因为甲基丙烯酸是疏水单体，溶剂中包含有机组分。这种有机组分(例如乙腈或乙醇)的体积％可以在25至75体积％之间变化。

[0167] 第一溶剂不限于上述溶剂，而是可以根据所使用的特定的MIP和模板而改动。在这个情况下，当使用MAA和普萘洛尔时，上述组合是合适的。

[0168] 通过在普萘洛尔的存在下聚合，形成了被配置为类似普萘洛尔或其类似物的靶结合位点。

[0169] 下面的图解阐述了在聚合过程中形成的靶结合位点：

[0170]

[0171] 图解2：靶结合位点中的表面结合的可带电荷基团

[0172] MIP单元空腔中的表面结合的可带电荷基团；即靶结合位点由MAA残基的带负电荷的羧基形成。

[0173] 当再次加入普萘洛尔时，它将通过以下方式结合至靶结合空腔：(i)静电相互作用，(ii)形状和尺寸的互补性，以及(iii)普萘洛尔的CH3残基与MIP单元之间的疏水相互作用。

[0174] 在备选的实施方案中，使用4-乙烯基吡啶作为单体，并且使用4-乙烯基吡啶-2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)作为模板。

[0175] 在该情况下，单体带正电荷，并且模板在中性溶剂中带负电荷。

[0176]

[0177] 图解3：4-乙烯基吡啶和4-乙烯基吡啶-2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的表面电荷的产生

[0178] 在2，4-D的存在下聚合时，形成了被配置为类似2，4-D或其类似物的靶结合位点。

[0179] 下面的图解阐述了在聚合过程中靶结合位点的形成：

[0180]

[0181] 图解4：靶结合位点中的表面结合的可带电荷基团

[0182] MIP单元空腔中的表面结合的可带电荷基团由衍生自官能单体4-乙烯基吡啶的质子化的吡啶基团形成。

[0183] 如上文所述，模板分子可以同时特异性地(即在靶结合位点中)和非特异性地结合至MIP单元的表面。不希望有非特异性结合，因为它可能产生假阴性信号。

[0184] 为了除去在未被配置为类似感兴趣的靶标的位点以及MIP单元表面上的非印迹位点处的非特异性结合，加入了钝化剂，所述钝化剂通过键与所述单元的表面结合，所述键在第二溶剂中的冲洗时保持稳定。

[0185] 这种第二溶剂；即模板洗脱溶剂是本领域技术人员已知的。

[0186] 在其中官能单体含有氨基的实施方案中，可以使用乙酰氯作为钝化剂。

[0187] 下面的图解阐述了非质子溶剂中的钝化；即不与溶解在其中的物质交换质子的有机溶剂。这里，使用乙酰氯作为钝化剂，并且使用2，4-D作为模板分子：

[0188]

[0189] 图解5：通过用乙酰氯处理钝化非特异性位点处的表面结合的可带电荷基团。

[0190] 这里，钝化发生在非水性溶剂中。在该条件下仅有模板占据的位点具有带电荷的氨基。表面结合的可带电荷的氨基，因为缺少质子供体，未带电荷，并且通过酰化而形成稳定的键仅对于未带电荷的氨基发生。在钝化之后，可以在水性条件下使用该聚合物，其中可以用缓冲剂调节pH以控制空腔中游离氨基的电荷状态。

[0191] 当将钝化剂乙酰氯加入MIP模板分子混合物时，它与表面结合的可带电荷氨基反应并形成键，它是对水解稳定的。在这个实施例中，由氨基的酰化形成稳定的键；即形成稳定的酰胺键。

[0192] 因为模板2，4-D特异性地结合在“正确的”靶结合位点中，保护位于其中的氨基使之免于酰化，并且在这些位点处将不发生钝化。

[0193] 在将模板分子移除之后，表面结合的可带电荷氨基将保留在靶结合位点中，但是MIP单元的表面将基本上被钝化；即基本上不包含表面结合的电荷。

[0194] 因此，在本发明的实施方案中，由氨基代表表面结合的可带电荷基团。在该情况下，乙酰氯是合适的钝化剂。

[0195] 钝化剂的选择取决于官能单体的结构。

[0196] 上述方法的钝化步骤更详细地包括：

[0197] -移除非特异性地结合至被配置为类似靶分子的结合位点的一个或多个模板分子，以使表面结合的可带电荷基团暴露在表面上，

[0198] -在钝化剂与表面结合的可带电荷基团之间形成稳定的键。

[0199] 钝化剂将与非特异性地结合至表面的模板分子竞争，使得这些在与钝化剂的接触时被移除。然而，结合在正确的靶结合位点中的模板分子将不会被移除，因为以下原因它们保持结合：在这些空腔中，尺寸和形状上的互补性、静电相互作用以及疏水相互作用。

[0200] 在加入钝化剂时，表面结合的可带电荷基团变得暴露在MIP单元的表面上。

[0201] 钝化剂能够与这些暴露的表面结合的可带电荷基团形成稳定的键，并且这些键即使在通过用第二溶剂冲洗将模板洗脱之后仍保持对水解稳定。

[0202] 可以通过下面的关系解释将非特异性地结合至被配置为类似靶分子的一个或dgoe结合位点的一个或多个模板分子移除的步骤：

[0203] exp{-(Hn/非特异-H非特异)/kT}:exp{-(Hn/特异-H特异)/kT}，[0204] 这里T是温度并且H非特异是结合至非特异位点的模板的焓，H特异是特异性地结合的模板的焓，同时Hn/非特异和Hn/特异分别是结合至MIP单元上的非特异性或特异性位点上的可带电荷基团的钝化剂的焓。

[0205] 由模板分子占据的非特异位点处上的交换平衡将为

[0206] θn～1/{1+aKcn}，

[0207] 这里a是常数，K是有效平衡反应常数～exp{-(Hn/非特异-H非特异)/kT，θn是由钝化剂占据的位点的分数并且cn是溶剂中钝化剂的浓度。

[0208] 指数中的因子是从将靶分子“扯下(tearing off)”并将其交换为钝化剂所“获得(gain)”的焓。

[0209] 在室温下指数可能容易地变得非常大并且覆盖度(coverage)将接近1。尤其当非特异性靶结合是静电结合(通常～10kT)时这将是真实的。特异性结合同时是静电的和疏水的(通常～30kT)，同时钝化剂结合是稳定的；即(半)共价的，(通常～200kT)。因而，非特异性结合的靶分子的移除相比特异性结合的靶标的移除将至少更有效exp 3≈20倍。

[0210] 在分别使用甲基丙烯酸官能单体和β阻滞药作为单体和模板的实施方案中，可以使用重氮甲烷、苯基重氮甲烷和酰卤作为钝化剂。

[0211] 在钝化时，通过酯化反应将位于非特异性位点中的表面结合的可带负电荷羧基转化为不带电荷的酯基。

[0212] 表面结合的可带电荷基团与钝化剂之间形成的键可以选自，例如酯键和酰胺键。然而，其它对水解稳定的键也落在本发明的范围之内。

[0213] 在实施方案中，该方法还包括加入选自荧光团、量子点和金纳米粒子的识别标志的步骤。

[0214] 通常，在官能单体聚合的过程中加入这种识别标志。

[0215] 例如，可以使用官能单体的氨基或羧基将识别标志连接至MIP单元，从而形成“桥”。也可以使用通过DCC或EDC活化的标准氨基和羧基偶联反应。这种偶联反应是本领域技术人员所熟悉的。

[0216] 虽然在附图和前面的描述中详细地图解并描述了本发明，这些图解和描述应该被认为是说明性的或者是示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。

[0217] 在实施所要求保护的发明中，本领域技术人员从对于附图、公开的内容和所附权利要求中可以明白并实现所公开的实施方案的其它变体。

[0218] 例如，本发明不限于使用特定的官能单体、模板分子等，而可以使用任意类型的单体和模板。本发明不限于特定应用，而是可以应用至其中利用MIP吸附靶标是适宜的任意情况。实施例

[0219] 印迹和非印迹纳米粒子的合成

[0220] 使用一篇在前出版物(Yoshimatsu等，2007)中描述的沉淀聚合方法合成分子印迹(MIP)纳米粒子。简言之，在配备有螺帽的150mm×25mm的硼硅酸盐玻璃管中将模板分子，即其游离碱形式的(S)-或(R)-普萘洛尔(137mg，0.53mmol)溶解在40ml的乙腈中。之后加入MAA(113mg，1.31mmol)、TRIM(684mg，2.02mmol)和AIBN(28mg，3重量％的单体)。
用平缓的氩气流吹扫溶液5分钟并在氩气下密封。通过将硼硅酸盐玻璃管插入预设为60℃的水浴中24小时进行聚合。在聚合之后，通过在18000rpm(38000g)下离心20分钟收集粒子。通过用含有10％乙酸(v/v)的甲醇分批式萃取溶剂移除模板，直到通过光谱测量(UV
290nm)从冲洗溶剂中不能检测出模板为止。最终用丙酮冲洗聚合物粒子并在真空室中干燥。所得到的MIP粒子，MIP(S)和MIP(R)，分别针对(S)-或(R)-普萘洛尔印迹。除了省略模板，在相同条件下合成非印迹参照聚合物，NIP。

[0221] 用于测量团聚速率的技术

[0222] 动力学光散射-光子相关光谱(PCS)

[0223] 可以使用PCS测定溶液中MIP粒子的粒度分布特征。当光击中粒子时，光沿各个方向散射，并且可以测量散射强度的波动。

[0224] 因为在测量的体积(由入射激光束和用于检测散射光的光学检测器的视野限定的体积)中粒子数量改变而出现这些波动。因为溶液中的MIP粒子进行布朗运动并且进入并离开所测量的体积，粒子数改变。因此，强度波动带有关于散射体运动的时间尺度的信息。

[0225] 测量带有关于平移布朗弛豫时间(translation Brownian relaxation time)τ的信息的所谓的归一化强度自相关函数。弛豫时间是粒子移动(平均)多快的量度并且与扩散系数密切相关。有效粒子/团聚物尺寸通过以下关系与弛豫时间相关：

[0226] τ＝(6πη/kTq2)x r，

[0227] 其中T和分别是溶剂温度和粘度，同时q是光散射矢量，并且由下式给出：

[0228] q＝(4πn/λo)x sin(θ/2)

[0229] λo-入射光的波长，n-MIP粒子/团聚物折射率，并且θ-入射光与检测器之间的角。至于更多信息，参见R.Pecora，动态光散射：光子相关光谱的应用(Dynamic light Scattering：Applications of Photon Correlation spectroscopy)，Kluver Academic Publisher，1985。

[0230] 当MIP粒子较小，例如小于500nm时通常使用PCS。

[0231] 静态光散射

[0232] 为了检测团聚的MIP粒子的相对大小，也可以使用静态光散射。该技术使用在许多角度处的强度迹线(intensity trace)来分析溶液中粒子的散射。

[0233] 在数个恒定散射角下测量散射强度的变化。在发生靶标吸附之前将它们归一化至粒子溶液的强度。

[0234] 归一化散射强度的简单方式是通过对少数散射角构建以下形式的商值：

[0235] Q＝{Ibsc(0，θbsc)-Ibsc(t，θbsc)}/{Ifsc(0，θfsc)-Ifsc(t，θfsc)}，[0236] 其中Ibsc(t，θbsc)是在角θbsc和时间t(或者分别地时间＝0)下的向后散射强度，同时Ifsc(t，θfsc)是在角θfsc和时间t(或者分别地时间＝0)下的向前散射强度。将所有强度归一化至引入靶标以后的向前透射强度，Itr(t)(参见图8)，所述引入发生在时间t＝0。

[0237] 当靶标吸附导致团聚时，后者将通过Q的变化被检测出。

[0238] 由直径大约为0.1λo-100λo(λo是入射光的波长)的小粒子散射的光的强度随检测角、粒度和悬浮液的浓度变化。

[0239] 如图8中所示，直径＜600nm的粒子在向前和向后(除某些方向以外，例如，θ≈90°)的两个方向上两者都散射可观的强度。然而直径＞25λo的粒子团簇散射开的光的强度在某些方向上显示出明显的极小值。因此可以使用角度强度扫描来测定粒子的绝对尺寸和它们在团聚之后形状的变化两者。

[0240] 图8也显示了这里使用的用于通过静态光散射检测团聚的几何图形。粒子在向前的方向(强度Ifsc)和向后的方向(强度Ibsc)两个方向上都散射入射光的强度，Iin。

[0241] 在给定的检测角下，散射强度大大依赖于粒子的尺寸和入射光束的偏振，如图8的RHS中所示{H.Blumer，Z.f.Physik，第32卷(1925)第199页后的数据；也参见Bornth和Wolf，光学原理第五版(Principles of Optics 5 ed.)，§13，Pergamon Press，牛津(Oxford)1975}。可以使用该性质检测粒度的变化。

[0242] 通过本发明的MIP粒子的团聚相比于非印迹聚合物(NIP)粒子测量的靶标结合[0243] 将使用本发明的MIP粒子的团聚速率与非印迹聚合物(NIP)粒子的团聚速率相比较(图4和5)。

[0244] 将各自浓度为0.2mg/ml的MIP粒子和NIP粒子加入包含模板分子(普萘洛尔1.25mM)的溶液(pH 6，4)中。

[0245] 如从图5中可以看出，团聚速率是显著的。当粒子达到1200nm的大小时，将样品超声处理45分钟，并且重复超声降解、分析。观察到相同的团聚模式(三角形曲线)。

[0246] 非印迹聚合物(NIP)单元未明显团聚(图4)。