本发明公开了一种适用于低场磁共振成像的高效MRI大分子造影剂及其制备方法与应用。所述MRI大分子造影剂可按照包括下述步骤的方法制备：a)将富勒烯羧酸衍生物溶于MES缓冲液中，加入EDC和NHS，室温下反应，得到富勒烯羧酸活性酯溶液；b)将Gd-DTPA-HSA加入到所述富勒烯羧酸活性酯溶液中搅拌反应，即得到所述的MRI造影剂。该Gd-DTPA-HSA-fullerene大分子造影剂在低场(0.5T)条件下弛豫效率显著提高，可在减少造影剂的使用剂量条件下得到明显的组织对比度；更为重要的是将其作为一种MRI分子探针，可以用于探索纳米材料(如功能化富勒烯衍生物)的体内分布代谢行为。
1.一种MRI造影剂，是由Gd-DTPA-HSA与富勒烯羧酸衍生物通过偶联反应制备得到的；
所述富勒烯羧酸衍生物的分子表达式为C60[C(COOH)2]x，其中，x=2-4；
a）将所述富勒烯羧酸衍生物溶于2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，得到富勒烯羧酸活性酯溶液；所述2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液的pH值为4.7-6.0；所述富勒烯羧酸衍生物在所述2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液中的浓度为1mg/mL；所述富勒烯羧酸衍生物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:6:6；所述反应的反应时间为2-4小时；
b）将Gd-DTPA-HSA加入到所述富勒烯羧酸活性酯溶液中搅拌反应，即得到所述MRI造影剂；
所述Gd-DTPA-HSA是按照下述方法制备得到的：
1）将100-200mg人血清白蛋白溶于5mL pH=7.4的PBS缓冲液中，分批加入cDTPA，调节pH=7，室温下反应2h；其中，所加入的cDTPA与人血清白蛋白的摩尔比200:1；
2）反应结束后通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25进行分离纯化，得到HSA-DTPA溶液；洗脱液：pH=6.0且浓度为0.5M的CH3COONa溶液；
3）将100-200mg GdCl3·6H2O加入到所述HSA-DTPA溶液中，室温下搅拌2-4h，使用Mw=12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw=10,000的超滤离心管除去未反应的物质。
2.根据权利要求1所述的MRI造影剂，其特征在于：所述方法还包括：将步骤b）得到的MRI造影剂使用Mw=12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw=10,000的超滤离心管除去未反应的富勒烯羧酸衍生物的步骤。
3.制备权利要求1所述的MRI造影剂的方法，包括下述步骤：
a）将权利要求1所述富勒烯羧酸衍生物溶于2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液中，加入
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应，得到富勒烯羧酸活性酯溶液；所述2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液的pH值为4.7-6.0；所述富勒烯羧酸衍生物在所述2-(N-吗啉基）乙磺酸缓冲液中的浓度为1mg/mL；所述富勒烯羧酸衍生物、
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:6:6；所述反应的反应时间为2-4小时；
b）将Gd-DTPA-HSA加入到所述富勒烯羧酸活性酯溶液中搅拌反应，即得到所述MRI造影剂； 所述Gd-DTPA-HSA是按照下述方法制备得到的：
1）将100-200mg人血清白蛋白溶于5mL pH=7.4的PBS缓冲液中，分批加入cDTPA，调节pH=7，室温下反应2h；其中，所加入的cDTPA与人血清白蛋白的摩尔比200:1；
2）反应结束后通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25进行分离纯化，得到HSA-DTPA溶液；洗脱液：pH=6.0且浓度为0.5M的CH3COONa溶液；
3）将100-200mg GdCl3·6H2O加入到所述HSA-DTPA溶液中，室温下搅拌2-4h，使用Mw=12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw=10,000的超滤离心管除去未反应的物质。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：将步骤b）得到的MRI造影剂使用Mw=12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw=10,000的超滤离心管除去未反应的富勒烯羧酸衍生物的步骤。
一种低场高弛豫率MRI造影剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种低场高弛豫率MRI造影剂及其制备方法与应用。 背景技术
[0002] 磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)技术是80年代以来医学影像学发展的最新成就之一，是一种无损的、高分辨影像学检查方法。它不仅可以在不使用有害的射线条件下提供软组织高分辨率(50μm)的三维图像，而且还可以同时给出病灶生理学和解剖学的实时信息，是诊断肿瘤、指导外科手术最为有效的方法之一[Lauffer R.B.，Chem.Rev.[J]，1987，87(5)：p.901-927.]。尽管常规MRI本身就具有优良的软组织对比度，但是，当病变组织具有类似正常组织的T1和T2值时，正常和病变组织之间不能产生明显对比度。此时，即使通过MR序列设计也很难分辨出它们之间的信号差别，MRI常规扫描会漏掉病变，造成病变诊断的误诊或漏诊。为了增强病变组织与正常组织图像之间的对比度和清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示解剖学特征。这些造影增强剂绝大多数是利用金属离子的顺磁特性。具有7个未成对电子的金属离子钆、具有5个未成对电子的金属离子铁和锰是设计金属对比度增强剂最理想的选择。1987年Gd-DTPA作为MRI对比剂正式被美国食品和药物管理局(FDA)批准，并被大量药理和临床应用研究证明是一种安全、方便、增强效果良好的对比剂，也是目前临床最常用以及应用最为广泛的MRI造影剂。然而传统的MRI造影剂仍然存在效率低、靶向性差等缺点。
[0003] 现代医学的迅速发展对疾病的诊疗提出更高的要求，期望分子影像探针在对病灶或目标部位进行显像的同时，还能作为药物对疾病进行原位治疗。所以，人们开始积极研究双模态或者多模态分子探针，希望能综合两种或多种模态探针的优点，使分子探针在诊断、治疗和监测等方面可获得一些全新的信息。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种低场高效MRI大分子造影剂及其制备方法。 [0005] 本发明所提供的MRI大分子造影剂是以小分子MRI造影剂Gd-DTPA作为母体，制备以人血清白蛋白(HSA)为载体的大分子造影剂前驱体，再将其与富勒烯羧酸衍生物C60[C(COOH)2]x(x＝2-4)偶联，得到适用于低场的高效MRI大分子造影剂Gd-DTPA-HSA-{C60[C(COOH)2]x}。
[0006] 所述MRI造影剂的制备方法，具体包括下述步骤：
[0007] a)将富勒烯羧酸衍生物溶于MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液中，加入EDC·HCl(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温 下反应，得到富勒烯羧酸活性酯溶液；
[0008] b)将Gd-DTPA-HSA加入到所述富勒烯羧酸活性酯溶液中搅拌反应，即得到所述的MRI造影剂。
[0009] 其中，步骤a)中所述MES缓冲液的pH值为4.7-6.0；所述富勒烯羧酸衍生物在所述MES缓冲液中的浓度为1mg/mL。
[0010] 所述富勒烯羧酸衍生物、EDC·HCl、NHS的摩尔比1∶6∶6；所述反应的反应时间为2-4小时。
[0011] 所述方法还包括：将步骤b)得到的MRI造影剂使用Mw＝12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw＝10,000的超滤离心管除去未反应的富勒烯分子，通过测定滤液的紫外可见吸收进行监控直至完全除去富勒烯羧酸衍生物。
[0012] 本发明中所述Gd-DTPA-HSA是按照下述方法制备得到的：
[0013] 1)将100-200mg HSA溶于5mL PBS(pH 7.4)缓冲液中，直接分批加入cDTPA双酐(二乙烯三胺五乙酸环酐)固体，使用0.1M NaOH溶液调节pH在7左右，室温下反应2h； [0014] 2)反应后通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25(PD-10目)进行分离纯化，洗脱液：0.5M CH3COONa(pH＝6.0)，使用紫外可见分光光度计进行监控；
[0015] 3)将100-200mg GdCl3·6H2O溶于1mL CH3COONa(pH＝6.0)缓冲溶液加入到HSA-DTPA溶液中，室温下搅拌2h，使用Mw＝12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw＝10,000的超滤离心管除去未反应的物质，通过测定溶液的电导率进行监控直至3+
完全除去Gd 。
[0016] 本发明所提供的MRI造影剂可作为MRI分子探针研究纳米材料在体内分布代谢行为。
[0017] 与其它现有技术比较，本发明具有以下特点：
[0018] 1、本发明优化了Gd-DTPA-HSA的制备方法，采用直接加入DTPA双酐粉末及使用PBS(pH＝7.4)的中性缓冲体系有效的缓解DTPA双酐的水解；
[0019] 2、本发明在制备过程中使用了多种分离手段确保游离的Gd3+以及未反应的物质被完全除去，避免了未反应的物质对其性质的影响；
[0020] 3、本发明制备的Gd-DTPA-HSA-{C60[C(COOH)2]x}(x＝2-4)大分子造影剂在低场条件下弛豫效率显著提高，可作为一种低场条件下的高效造影剂，在减少造影剂的使用剂量的前提下保证足够的组织对比度；
[0021] 4、本发明制备的Gd-DTPA-HSA作为一种低场高效分子探针可以利用MRI信号研究富勒烯衍生物的体内代谢，克服PET/SPECT技术成本高、时间/空间分辨率低等缺点。同时将富勒烯衍生物的治疗功能与MRI结合，制备多模态探针。
附图说明
[0022] 图1为实施例1制备的大分子造影剂Gd-DTPA-HSA制备流程图。
[0023] 图2为实施例2所制备Gd-DTPA-HSA-Fullerene制备流程图。
[0024] 图3为实施例1与对照例1分别在7T、3T和0.5T磁场条件(300K)下测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图。
[0025] 图4为实施例1与对照例1在0.5T磁场(310K)下测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图和实施例1制备的在1#-4#：0.33；0.22；0.17；0.08mM(溶液中Gd离子浓度)和纯水(W)的体外T1加权像对比图(0.5T自旋-回波序列TR＝300ms，T＝310K) [0026] 图5为实施例1扫描电镜图片。
[0027] 图6为实施例1制备的Gd-DTPA-HSA的粒径分布图和Zeta电位图。 [0028] 图7为实施例2制备的Gd-DTPA-HSA-C60的粒径分布图和Zeta电位图。 [0029] 图8为实施例2在0.5T磁场(300K)下测得的纵向弛豫时间的倒数1/T1对不同Gd浓度作图和实施例2 1#-4#：0.018；0.014；0.012；0.007mM和纯水(W)的体外T1加权像对比图(0.5T自旋-回波序列TR＝200ms，T＝37℃)
[0030] 图9实施例1和实施例1与HeLa细胞孵育固定后的透射照片a)实施例1通过跨膜运动进入细胞；b)实施例1内化于细胞质中；c)实施例2通过内吞作用进入细胞；d)实施例2内化于细胞质中。
具体实施方式
[0031] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。 [0032] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0033] 对比例1
[0034] 作为对照，以临床使用的钆喷酸葡胺注射液，商品名为马根维显(Gd-DTPA，Magnevist)(德国先灵公司生产，先灵药业有限公司分包装。进口药品注册证号：H20030138，批准文号：国药准字J20030062)，分别配制一系列浓度的水溶液，分别在不同磁场(7T\3T\0.5T)条件下(300K)测得纵向弛豫时间T1，而后用其倒数对浓度作图，得到Gd-DTPA在不同磁场下的水质子弛豫率(见图3)。
[0035] 磁场强度7T：1/T1＝3.712C+0.340，R2＝0.996；
[0036] 磁场强度3T：1/T1＝5.52C+0.14，R2＝0.99；
[0037] 磁场强度0.5T：1/T1＝4.66C+0.34，R2＝0.99。
[0038] 实施例1：Gd-DTPA-HSA大分子造影剂的制备
[0039] a)将100mg HSA溶于5mL PBS(pH 7.4)缓冲液中，直接分批加入cDTPA双酐固体(cDTPA∶HSA＝200∶1，摩尔比)，使用0.1M NaOH溶液调节pH＝7，室温下反应2h； [0040] b)将反应结束后得到的体系通过葡聚糖凝胶Sephadex G-25(PD-10目)进行分离纯化，洗脱液：0.5M CH3COONa(pH＝6.0)，在280nm处用紫外可见分光光度计进行监控，得到HSA-DTPA溶液；
[0041] c)将112mg GdCl3·6H2O(GdCl3·6H2O∶HSA＝200∶1，摩尔比)溶于1mL CH3COONa(pH＝6.0，0.5M)缓冲溶液加入到HSA-DTPA溶液中，室温下搅拌2h，使用Mw＝12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw＝10,000的超滤离心管除去未反应
3+
的物质，通过测定溶液的电导率进行监控直至完全除去Gd ，得到Gd-DTPA-HSA大分子造影剂。
[0042] 分别在不同磁场(7T\3T\0.5T)条件下(300K)测得纵向弛豫时间T1，而后用其倒数对浓度作图，得到Gd-DTPA-HSA在不同磁场下的水质子弛豫率(见图3)。 [0043] 磁场强度7T：1/T1＝12.145C+0.0496，R2＝0.9999；
[0044] 磁场强度3T：1/T1＝11.23C+0.33，R2＝0.99；
[0045] 磁场强度0.5T：1/T1＝34.484C+0.4142，R2＝0.99。
[0046] 由图3得到，在3T和7T场强下，Gd-DTPA-HSA的纵向弛豫率r1分别为11.23mM-1s-1-1 -1和12.15mM s ，是临床使用Gd-DTPA的2-3倍，在0.5T场强下，Gd-DTPA-HSA的弛豫率有显著的提高，是Gd-DTPA的近十倍，通过三种磁场强度对比，说明Gd-DTPA-HSA在低场条件下具有非常高的弛豫率。
[0047] 由图4可以看出，实施例1制备的Gd-DTPA-HSA具有明显的成像效果。 [0048] 通过图5、6可以看出实施例1制备的Gd-DTPA-HSA平均粒径为280nm左右，Zeta电位为-12mV左右。
[0049] 实施例2：制备Gd-DTPA-HSA与富勒烯羧酸衍生物的偶联物
[0050] a)(C60[C(COOH)2]x(x＝3))制备：参考文献(Bingel，C.，Cyclopropanierung vonFullerenen.Chemische Berichte 1993，126(8)，1957-1959.)制备富勒烯羧酸酯衍生物，之后使用NaH水解得到富勒烯羧酸衍生物。
[0051] b)10mg富勒烯羧酸衍生物(C60[C(COOH)2]x(x＝3))溶于10mL MES(pH 5.5)缓冲液中，加入10mg EDC和5mg NHS(C60[C(COOH)2]x与EDC，NHS摩尔比为1∶6∶6)，室温下反应2h，得到富勒烯羧酸活性酯。
[0052] c)将10mg Gd-DTPA-HSA加入到上述富勒烯羧酸活性酯溶液中，室温下搅拌过夜，使用Mw＝12,000-14,000透析袋透析除去小分子，之后使用Mw＝10,000的超滤离 心管除去未反应的富勒烯分子，通过测定滤液的紫外可见吸收进行监控直至完全除去富勒烯羧酸衍生物，得到Gd-DTPA-HSA与富勒烯羧酸衍生物的偶联物Gd-DTPA-HSA-C60[C(COOH)2]x。 [0053] 图7中显示实施例2中制备的偶联物的粒径在100nm左右，Zeta电位为-25mV左右，说明偶联上富勒烯后Gd-DTPA-HSA稳定性增加，更不容易聚集。
[0054] 图8说明修饰富勒烯分子后的造影剂分子在低场条件下弛豫率显著提高(r1＝-1 -186mM s )，即使在极低浓度下(0.007mM)成像效果依然显著。
[0055] 图9说明实例1和2中的大分子造影剂都能进入细胞，但连接富勒烯前后，进入细胞的方式不同，但最终都内化于细胞质中。Gd-DTPA-HSA与富勒烯羧酸衍生物的偶联物是通过内吞作用进入细胞，Zeta电位更负，更不容易聚集，稳定性增加。
