一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法

摘要

本发明涉及一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法。按照本发明提供的技术方案：其主要以壬基酚类似物为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比。本发明的合成方法能够成功合成壬基酚类似物的人工抗原，合成步骤简洁、有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

权利要求

1.一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法，其特征在于：以壬基酚类似物为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比；具体包括如下步骤：（1）人工抗原的合成：

（a）壬基酚类似物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺、牛血清白蛋白以摩尔比为80：

120：136：1的比例反应，将壬基酚类似物溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，然后转移到棕色小瓶中，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺和碳二亚胺，室温反应6h，制得A液；将牛血清白蛋白溶解到磷酸盐缓冲液中，制得B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应3h，离心去掉沉淀，取上清液即得到烷基酚类药物人工抗原混合液；所述碳二亚胺为EDC；

（b）透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗

3min，保存在4℃去离子水中备用；

（c）将步骤（a）制得的烷基酚类药物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析2次，磷酸盐缓冲溶液每次用量2L，再用去离子水透析2次，去离子水每次用量2L，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到壬基酚类似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚类药物人工抗原；

（2）人工抗原的鉴定：采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚类似物-牛血清白蛋白的偶联比，分别在272nm、278nm波长处测吸光值，并计算偶联比；

所述壬基酚类似物是10-苯基癸酸；

所述壬基酚类似物通过如下方法制备：取摩尔比为1:1的庚二酸二甲酯和庚二酸，在pH为11的氢氧化钠碱性溶液中水解反应12小时得到庚二羧酸酯，然后再加入亚硫酰氯在苯中反应，得到庚二羧酸氯酯；将庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在0℃下搅拌反应24小时，用乙醚萃取，然后再用锌粉和醋酸汞在甲苯中回流反应6小时；旋蒸干后用乙醇溶解，并加入10%氢氧化钠溶液回流水解反应6小时，再旋蒸干得沉淀；将沉淀用冰醋酸溶解，并加入48%的溴化氢回流反应6小时，再旋蒸干，并在乙醇中重结晶，得到带有羧基的壬基酚类似物，即10-苯基癸酸。

2.如权利要求1所述的适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法，其特征在于：所述人工抗原的鉴定方法具体如下：将偶联产物壬基酚类似物-牛血清白蛋白用超纯水稀-1释到150μg·mL ，以超纯水作空白对照，用紫外扫描仪测稀释液在272nm、278nm波长处的吸光值，稀释液在272nm的吸光值为A1，稀释液在278nm的吸光值为A2，依据公式r=（A1×εB278-A2×εB272）/（ A2×εA272-A1×εA278）计算偶联比；式中：εA为壬基酚类似物的摩尔吸光系数，εA272为272nm处的摩尔吸光系数，εA278为278nm处的摩尔吸光系数；εB为牛血清白蛋白的摩尔吸光系数，εB272为272nm处的摩尔吸光系数，εB278为278nm处的摩尔吸光系数。

说明书

一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体是涉及一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法。

背景技术

[0002] 烷基酚类化合物(Alkyl Phenol，APs)，属于内分泌干扰物质中重要的一种，具有明显的环境雌激素效应。该类化合物多为脂溶性有机化合物，化学稳定性较强，一旦摄入就不易降解排出，有生物累积性，危害性较大，即使微量也可对生物产生影响。同时其在环境中分布也十分广泛，并且含量较低。烷基酚类化合物APs是重要的精细化工原料，在表面活性剂、润滑油添加剂、油溶性酚醛树脂及绝缘材料、纺织印染、造纸助剂、农药乳化剂、工业用洗涤剂、橡胶塑料的防老抗氧剂、油田及炼油厂化学品等领域具有广泛用途。APs中最重要的是壬基酚(Nonyl Phenol，NP)和辛基酚(Octyphenol，OP)，二者只在长碳链相差一个甲基，它们同属于联合国UNEP制订的持久性有毒化学污染物。NP和OP等APs内分泌干扰物主要为烷基酚聚环氧乙烷醚(Alkylphenolethoxylater，APEO)在环境降解过程中的中间产物。一般随着APEO的排放进入环境，并且在环境中分布比较广泛。APs类化合物可以对生物体形成外因性雌性激素作用，其中又以OP为最强，NP次之，而其它APs类化合物则依照亲水端链从短到长，作用程度依次削减。APs类化合物是促乳房癌细胞活性化与增殖现象的环境内分泌干扰物。同时烷基酚类化合物对细胞的DNA有明显的损伤作用，并且DNA的损伤程度与化学结构有一定的关系，苯酚环中增加其他基团，可使致突变活性增强，并且随着苯酚环中氯原子数的增加，致突变活性也增强；随着苯酚对位碳原子数增多，其致突变活性也增高等。因此，APs类物质也逐步被列入强制性禁用范围，一些国家纷纷制定法规限制APs的生产和使用。欧盟第2003/53/EC号指令规定纺织品中NP和NPEO含量均不能高于0。1％。这些措施成为我国纺织品出口欧盟面临的又一大技术贸易壁垒，因此对APs检测方法的研究提上日程。现今烷基酚主要的分析方法有：高效液相色谱法、气相色谱法、LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没有针对烷基酚结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以烷基酚的降解产物壬基酚的类似物NPA为半抗原的用于烷基酚类结构检测的完全抗原。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法，利用该合成方法所制备的产品可用于烷基酚类结构的免疫分析方法研究，为今后的研究提供更好的必需的人工抗原。

[0004] 按照本发明提供的技术方案：一种适用于烷基酚类药物人工抗原的合成方法，其特征在于：以壬基酚类似物为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定偶联物的偶联比；具体包括如下步骤：

[0005] (1)人工抗原的合成：

[0006] (a)壬基酚类似物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、碳二亚胺、牛血清白蛋白以摩尔比为80∶120∶136∶1的比例反应，将壬基酚类似物溶于N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，然后转移到棕色小瓶中，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulf-NHS)和碳二亚胺(EDC)，室温反应6h，制得A液；将牛血清白蛋白(BSA)溶解到磷酸盐(PBS)缓冲液中，制得B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应3h，离心去掉沉淀，取上清液即得到烷基酚类药物人工抗原混合液；

[0007] (b)透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

[0008] (c)将步骤(1)制得的烷基酚类药物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析2次，磷酸盐缓冲溶液每次用量2L，再用去离子水透析2次，去离子水每次用量2L，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到壬基酚类似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚类药物人工抗原；

[0009] (2)人工抗原的鉴定：采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚类似物-牛血清白蛋白的偶联比，分别在272nm、278nm波长处测吸光值，并计算偶联比。

[0010] 偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。

[0011] 作为本发明的进一步改进，所述人工抗原的鉴定方法具体如下：将偶联产物壬基-1酚类似物-牛血清白蛋白用超纯水稀释到150μg·mL ，以超纯水作空白对照，用紫外扫描仪测稀释液在272nm、278nm波长处的吸光值，稀释液在272nm的吸光值为A1，稀释液在
278nm的吸光值为A2，依据公式r＝(A1×εB278-A2×εB272)/(A2×εA272-A1×εA278)计算偶联比；式中：εA为壬基酚类似物的摩尔吸光系数，εA272为272nm处的摩尔吸光系数，εA278为
278nm处的摩尔吸光系数；εB为牛血清白蛋白的摩尔吸光系数，εB272为272nm处的摩尔吸光系数，εB278为278nm处的摩尔吸光系数。

[0012] 作为本发明的进一步改进，所述壬基酚类似物是10-苯基癸酸。

[0013] 作为本发明的进一步改进，所述壬基酚类似物通过如下方法制备：取摩尔比为1∶1的庚二酸二甲酯和庚二酸，在pH为11的氢氧化钠碱性溶液中水解反应12小时得到庚二羧酸酯，然后再加入亚硫酰氯在苯中反应，得到庚二羧酸氯酯；将庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在0℃下搅拌反应24小时，用乙醚萃取，然后再用锌粉和醋酸汞在甲苯中回流反应6小时；旋蒸干后用乙醇溶解，并加入10％氢氧化钠溶液回流水解反应6小时，再旋蒸干得沉淀；将沉淀用冰醋酸溶解，并加入48％的溴化氢回流反应6小时，再旋蒸干，并在乙醇中重结晶，得到带有羧基的壬基酚类似物(NPA)，即10-苯基癸酸。

[0014] 偶联物蛋白浓度通过以下实验方法测定：配制浓度分别为0，40，60，80，100，120，-1160，200μg·mL 的牛血清白蛋白溶液1.5ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，
30℃下水浴温热5分钟，每个浓度做平行样。在595nm处测吸光值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将偶联物溶液按一定比例稀释，在595nm处测定偶联物溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得偶联物溶液的蛋白浓度为-1
6.6253mg·ml 。

[0015] 本发明与现有技术相比，优点在于：本发明的合成方法能够成功合成壬基酚类似物的人工抗原，合成步骤简洁、有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。

附图说明

[0016] 图1为NPA、BSA及其偶联物的紫外紫外扫描图。

[0017] 图2为利用间接ELISA方法测得的壬基酚类似物-牛血清白蛋白的标准抑制曲线。

具体实施方式

[0018] 下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0019] 实施例1

[0020] 壬基酚类似物的制备：取100mmol的庚二酸二甲酯和100mmol的庚二酸，在pH为11的氢氧化钠碱性溶液中水解反应12小时得到庚二羧酸酯，然后再加入足够量的亚硫酰氯在苯中反应，使庚二羧酸酯全部转化为庚二羧酸氯酯；将庚二羧酸氯酯滴入到苯甲醚的二氯乙烷溶液中，在0℃下搅拌反应24小时，用乙醚萃取，然后再用锌粉和醋酸汞在甲苯中回流反应6小时；旋蒸干后用乙醇溶解，并加入10％氢氧化钠溶液回流水解反应6小时，再旋蒸干得沉淀；将沉淀用冰醋酸溶解，并加入48％的溴化氢回流反应6小时，再旋蒸干，并在乙醇中重结晶，得到带有羧基的壬基酚类似物NPA。上述制得的壬基酚类似物NPA为
10-苯基癸酸，其只比壬基酚NP在其烷基链末端多了一个羧基，其它结构部位完全相同，从而保留了苯酚基的抗原决定簇。

[0021] 人工抗原的制备：

[0022] (a)、取0.5ml含有12mg(0.04538mmo1)的壬基酚NP类似物NPA的N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液到棕色小瓶中，加入14.77mg(0.06807mmol)的N-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulf-NHS和14.78mg(0.07715mmol)的碳二亚胺EDC，室温反应6h，制得A液；将37.55mg(0.56725μmol)的牛血清白蛋白BSA溶解到0.01M的pH为7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，制得B液；然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应3h，离心去掉沉淀，取上清液即得到烷基酚类药物人工抗原混合液；

[0023] (b)透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；

[0024] (c)将步骤(1)制得的烷基酚类药物人工抗原混合液移入透析袋中，每天先用0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析2次，磷酸盐缓冲溶液每次用量2L，再用去离子水透析2次，去离子水每次用量2L，共透析3天；最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，得到壬基酚类似物-牛血清白蛋白，即是烷基酚类药物人工抗原；

[0025] (2)人工抗原的鉴定：采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚类似物-牛血清白蛋白的偶联比，分别在272nm、278nm波长处测吸光值，并计算偶联比。

[0026] 该鉴定方法具体如下：将偶联产物壬基酚类似物-牛血清白蛋白用超纯水稀释-1到150μg·mL ，以超纯水作空白对照，用紫外扫描仪测稀释液在272nm、278nm波长处的吸光值，稀释液在272nm的吸光值为A1，稀释液在278nm的吸光值为A2，依据公式r＝(A1×εB278-A2×εB272)/(A2×εA272-A1×εA278)计算偶联比。式中：εA为壬基酚类似物的摩尔吸光系数，εA272为272nm处的摩尔吸光系数，εA278为278nm处的摩尔吸光系数，εA272＝-1 -1
3622L·mol 、εA278＝3006L·mol ；εB为牛血清白蛋白的摩尔吸光系数，εB272为272nm-1
处的摩尔吸光系数，εB278为278nm处的摩尔吸光系数，εB278＝41059L·mol 、εB272＝-1
251656L·mol 。经计算，本实施例中壬基酚类似物-牛血清白蛋白的偶联比r≈17。

[0027] 所述壬基酚类似物的摩尔吸收系数εA通过以下实验方法获得：配制浓度分别为-10，10，20，30μg·mL 的壬基酚类似物(NPA)超纯水溶液，通过紫外扫描可知壬基酚类似物的最大吸收波长为272nm，牛血清白蛋白BSA的最大吸收波长为278nm，分别在272nm、278nm处测其吸光值，每个浓度做平行样，摩尔吸光系数计算为：εA＝吸光值/摩尔浓度。本实验-1 -1
计算得εA272＝3622L·mol 、εA278＝3006L·mol 。

[0028] 所述牛血清白蛋白的摩尔吸收系数εB通过以下实验方法获得：配制浓度分别为-10，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg·mL 的牛血清白蛋白(BSA)超纯水溶液，通过紫外扫描可知牛血清白蛋白BSA的最大吸收波长为278nm，分别在278nm、272nm测吸光值，每个浓度做平行-1 -1
样。本实验计算得摩尔吸光系数分别为：εB278＝41059L·mol 、εB272＝251656L·mol 。

[0029] 蛋白浓度测定：具体方法为：配制浓度分别为0，40，60，80，100，120，160，-1200μg·mL 的牛血清白蛋白溶液1.5ml，加入5ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃下水浴温热5分钟，每个浓度做平行样。在595nm处测吸光值，绘制牛血清白蛋白浓度与吸光值的关系曲线(如图1所示)。将抗原溶液液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本实验计算得抗原溶液的蛋白浓度为-1
6.6253mg·ml 。

[0030] 利用间接ELISA方法测的壬基酚类似物-牛血清白蛋白的标准抑制曲线，结果如图2所示。

[0031] 用制得的壬基酚类似物-牛血清白蛋白偶联物进行免疫学实验，相关实验数据如表1。

[0032] 表1：不同兔子抗血清的抗血清效价

[0033]

[0034] 由上述的两个实验可以看出：我们制得的壬基酚类似物-牛血清白蛋白偶联物是针对烷基类药物的非常好的抗体。